직교 쥐 신장 이식: 새롭고 단순화 된 외과 접근

요약

이 원고와 프로토콜의 목적은 쥐에서 직교 신장 이식의 외과 수술을 상세히 설명 하 고 입증 하는 것입니다. 이 방법은 기증자 신장의 정확한 관류를 달성 하 고 정 맥 및 요 추 팔목 문 합 기술을 사용 하 여 재 관류 시간을 단축 하기 위해 단순화 된다.

초록

신장 이식 향상 된 생존 율을 제공 하 고 최종 단계 신장 질환 환자에 대 한 삶의 질 향상, 모든 종류의 신장 대체 요법에 비해. 지난 몇 십년 동안, 쥐 신장 이식 모델은 거부와 관용의 면 역학적 현상을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 모델은 고가의 전 임상 큰 동물 연구를 진행 하기 전에 새로운 면역 조절 제약 및 식이요법을 테스트 하는 필수 불가결 한 도구가 되고있다.

이 프로토콜은 쥐에서 직교 신장이 식을 안정적으로 수행 하는 방법에 대 한 자세한 개요를 제공 합니다. 이 프로토콜은 성공 확률을 증가 시키는 세 가지 독특한 단계를 포함 합니다: 포털 정 맥을 통해 홍 조에 의해 기증자 신장의 관류와 신장 정 맥과 요 관을 낙 소 하는 커 프 시스템의 사용, 추위와 따뜻한 감소 허 혈 시간. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 syn유전학 또는 관대 한 신장이 식을 가진 동물에 있는 일반적인 혈 청 크 레 아 티 닌을 가진 6 달 저쪽에 생존 율을 달성 했습니다. 연구의 목적에 따라,이 모델은 급성, 만성, 세포 또는 항 체 중재 거부를 연구 하기 위해 이식 전 또는 후 처리에 의해 변형 될 수 있다. 이는 신장 이식의 다양 한 측면을 연구 하기 위해 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있으며 비용 효율적인 동물 모델입니다.

서문

역사적으로, 첫번째 이식 거절 연구 결과는 설치류¹에 있는 피부이 식을 사용 하 여 브렌 트와 Medawar에 의해 수행 되었다. 피부가 뚜렷한 면 역학적 특징을가지고 있다는 것이 분명 하 게 되었고,이는 다른 혈관 화 된 고체 기관에서 거부 되는 것과다른 높은 면역 원 성 기관을 만들기 때문입니다. 고체 장기 이식 거부의 쥐 연구는 심장에 제한, 간, 그리고 신장 이식. 이러한 각 기관은 거부를 연구 하는 데 적합 하지만, 각각의 장점과 단점이 있습니다. 심장 이식 종종 복 부에 이식 하 고 대동맥과 대 정 맥에 문 지, 자리에 받는 사람의 기본 마음으로³. 이것은 인간의 임상, 해부학 적, 생리 적 상태를 재현 하지 않습니다. 또한, 마음은 차가운 허 혈에 매우 민감 하 고 그들의 기능을 복구 할 수 있도록 하기 위해 1 시간 내에 우선적으로 사용 되는 재 관류 해야⁴. 간이 식은 일반적으로 외과로 더 도전적이 고 시간에 민감한 수행 하기 위하여 여겨집니다. 네이티브 간을 제거한 후, 기증자 간 이식 하 고 30 분 이내에 사용 되는 받는 사람으로 작동 하지 않고 더 이상 지속 될 수 없습니다⁵. 간 동맥, 문맥 정 맥, 특히 담 관 재건은 정제 된 외과 기술이 필요 합니다. 외과 적 문제 외에도, 간은 토로 제 성 성질 및 설치류와 인간을 소유 하는 것으로 알려져 있습니다.^6,7,8. 상기 신장은 전술한 기관과 달리, 직교 방식으로 이식 될 수 있으며, 일관 되 고, 재현성 있는 거부 에피소드 (면역 억제 되지 않은 경우)를 갖는 면역 원 성 기관으로 알려져 있으며, 여러 가지 중의 장기간의 차가운 허 혈 시간을 허용 시간. 이것은 쥐 신장 이식이 동종 거부 및 관용을 연구 하기 위한 이상적인 모델을 만든다.

신장 이식 (KT)은 말기 신장 질환을 가진 환자에 대 한 치료의 바람직한 선택 이다. 지난 몇 십년 동안, KT 후 단기 생존 결과는 극적으로 개선, 하지만 장기 생존 결과 정체는⁹. 종래의 면역 억제제 요법은 표준 항 거부 요법으로 남아 있다. 그러나, 면역 억제 요법의만 성적 사용은 신 독성, 당뇨병 및 이차 악성 종양과 같은 현저한 사망률 및 사망률을 야기 한다 (¹⁰,¹²). 장기적으로 만성 항 체 및 세포 매개 거부는 이식 편 생존을 위협 하며, 제한 된 치료 옵션을 사용할 수 있습니다.

이식의 주요 목표는 만성 면역 억제에 대 한 필요성을 장애와 하기 위해 이식 관용의 유도 이다. Rat KT 모델은 면역 억제 과정을 조사 하 고 새로운 접근법을 면역학 변조 및 이식 관용으로 평가할 수 있는 강력한 도구입니다. 쥐는 또한 급성 및 만성 세포 및 항 체 중재 거부¹³,^14,15,17을 연구 하기에 적합 한 모델로 서의 역할을 한다. 이 수술 모델은 동종 거부 및 관용의 다양 한 측면을 연구 하는 신뢰할 수 있고, 재현 가능 하며, 비용 효율적인 도구 임을 입증 했습니다. 그것은 종종 고가의 성가신 대형 동물 연구를 착수 하기 전에 새로운 관용 유도 프로토콜을 테스트 하는 데 사용 됩니다. 쥐에서 KT를 수행 하는 것은 > 90%의 생존 율에 도달 하기 위해 광범위 한 외과 훈련과 전문성을 필요로 합니다. 이 원고와 함께 제공 되는 교육용 비디오를 통해 우리 기관에서 수년간 성공적으로 수행 된 쥐에 대 한 직교 KT에 대 한 단계별 개요를 제공할 수 있습니다.

어떤 절차를 시작 하기 전에, 기증자 및 수령인 선택은 중요 하 고 실험의 성격에 달려 있습니다. 이상적으로, 기부자와 수령인은 220-260g 사이의 무게와 나이의 8 ~ 12 주 사이 이어야 합니다. 220 g 미만의 동물은 작은 직경의 동맥, 정 맥 및 요 관을가지고 있어 받는 사람의 문 합을 특히 어렵게 합니다. 경미한 출혈은 저 혈당 증를 유발 하 고 작은 동물에서 죽음으로 이어질 수 있습니다. 260 g 보다 무거운 동물은 혈관 주위에 더 많은 지방을 표시 하 고 혈관 분리는 더 많은 수술 시간을 필요로 하 고 차가운 허 혈 시간을 증가 시킵니다.

프로토콜

루이스 (RT1¹)와 검은 쥐 티 (RT1A) 랫 트는 상업 상인 들에^게서 구입 하였다 ( 재료 표참조). 이러한 완전 한 MHC 불일치 균 주는 종종 급성 신장 동종 거부를 연구 하는 데 사용 됩니다. 모든 동물은 존스 홉킨스 대학의 특정 병원 체 무료 시설에서 건강 (NIH) 지침의 국립 연구소에 따라 보관 및 유지 되었다. 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.

1. 기부자 절차

1. 소독의 수단으로이 절차에 사용 되는 모든 수술 도구를 준비 하 고 오토 클레이 브 및 감염 합병증을 방지 하기 위해 일회용 멸 균 장갑을 사용 합니다.
2. 이 소에이 소를 흡입 하 여 기증자 쥐를 마 취 (3%에서 유도-4% 및 유지 보수 1%-2%) 절차의 나머지 부분에 대 한. 모든 기증자 및 수령인에 게 동물을 제공 하십시오. 진통에 대 한 몸 무게 0.1 밀리 그램/kg에서 선취 권 부 프레 노르 핀 피하.
3. 이제 쥐를 부정사 위치에 놓고 멸 균 마스킹 테이프로 팔 다리를 움직이지 않습니다.
4. 복 부 영역에서 머리를 제거 하는 기계식 클리퍼를 사용 합니다.
   1. 눈 윤활제를 바르고 포 비 돈 요오드에 적신 멸 균 거 즈를 사용 하 고, 이소프로필 알콜에 적신 거 즈로 수술 장을 소독 합니다.
   2. 첫 번째 절 개 전에, 쥐는 적절 하 게 발가락 핀치 철수 반사의 부재를 확인 하 여 마 취 있는지 확인.
5. 가 위를 사용 하 여 시작 하 여 큰 종 중간 선 피부와 근육 절 개에서 심 피 증에 대 한 절단은 xiphoid, 복 강에 들어갑니다.
6. 복 부 벽의 양쪽에 두 개의 견인 기를 삽입 하 여 개복 내 강을 노출 시킵니다.
7. 촉촉한 살 균 거 즈로 장을 덮고 복 부의 오른쪽 측면으로 옮겨 대동맥, 대 정 맥, 왼쪽 신장을 노출 시킵니다. 내장과 복 부 장기를 상 온으로 유지 하기 위해 1 cc 주사기로 예 열 식 염 수 1 mL를 바르 십시오.
   1. 두 번째 촉촉한 거 즈를 덮고 신장에 위 및 비장 두개골을 동원 하 여 노출 된 신장을 덮는 작은 촉촉한 거 즈를 적용 하십시오 (그림 1a).
8. 분리 하 고 결합 조직과 서로 왼쪽 신장 동맥 및 정 맥을 동원 하기 위해 미세 수술 해 부 집게를 사용 합니다. 왼쪽 고 달 정 맥을 cauterizing 하 여 왼쪽 신장 정 맥을 분리 하 고 부 신 동맥을 cauterizing 하 여 왼쪽 신장 동맥을 분리 합니다. 그 후, 하 부 포 셉 (그림 1B)와 결합 조직을 하 수 하 여 왼쪽 신장 척추의 우수 하 고 열 등 한 대동맥과 대 정을 동원.
9. 하 부 팅 핀셋을 사용 하 여 결합 조직에서 요 관을 나누고 동원 하 고, 마이크로가 위를 사용 하 여 신장 골반에서 측정 된 2cm의 길이로 대각선 절 개를 만듭니다. 폴 리아 미드 커 프 ( 재료 표참조)를 요 관 중간에 삽입 하 고 8-0와 매듭을 두어 커 프를 고정 시킵니다. 실크 봉합 (그림 1C).
   참고: 유착으로 인 한 장애물에 대 한 보호 기능을 제공 하므로 ureter에서 모든 지방과 결합 조직을 제거 하지 않는 것이 중요 하며, 제거 하면 요 관 괴 사가 발생할 수 있습니다. Ureter에 산소를 공급 하는 용기를 보존 하기 위해 여분의 주의를 기울이십시오.
10. 해 부 집게 또는 마이크로가 위를 사용 하 여 perinephric 지방과 분리 하 여 왼쪽 신장을 동원 합니다. 신장의 지방 캡슐을 두고 연결 하 고 신장을 처리 하기 위한 그 사이트를 사용 합니다.
    1. 열 등 한 대 정 맥을 노출.
11. 페니 스 정 맥을 통해 27G의 바늘로 주사기를 사용 하 여 200의 헤 파 린 단위를 관리 합니다. 출혈을 방지 하기 위해 면봉으로 1 분 이상 주사 부 위에 압력을가 합니다.
12. 차원문 정 맥 (pv)과 열 등 한 대명 (그림 1d)을 확인 합니다. 16 G 바늘을 사용 하 여 포털 정 맥에 헤 파 린의 500 단위와 혼합 된 차가운 생리 식 염 50 mL를 주입 하 여 신장을 씻어 냅니다 (그림 1e). 플러싱 하기 전에, 인프라 수준에서 열 등 한 대 정 맥을 자르고 바늘 삽입 부 위에 문맥이 혈액 순환을 종료 할 수 있도록 합니다. 서서히 식 염 액을 주입 하 여 신장을 내뿜는 것을 시작 하십시오. 진한 빨간색에서 균일 한 회색과 옅은 색으로 신장의 색의 변화를 관찰 하십시오 (그림 1F).
13. 플러싱 후, 대동맥과 정 맥에 신장 동맥과 혈관 근 위부를 리 게이트 하 고 얼음에 차가운 염 수에 있는 페 트리 접시에 플러시 신장을 배치 합니다. 그림 2 A는 기증자 절차의 개략적인 개요를 나타냅니다.
14. 일단 신장이 찬 염 분에, 수정 하 고 정 맥 팔목의 손잡이를 움직이지 않게 하 고 ( 물자의 테이블을 참조 하십시오) 팔목을 통해 서 신장 정 맥을 부드럽게 당깁니다. 그런 다음, 8 제로 실크 봉합 사를 사용 하 여 3 개의 매듭을 배치 하 여 커 프에 신장 정 맥을 고정 시킵니다 (그림 2b).
    주의: 정 맥의 방향에 특별 한 주의를 기울여 제자리에 고정 시킵니다. 회전 된 정 맥은 혈액 흐름의 방해를 일으키고 혈전 증으로 이어집니다.

2. 수령인 절차

1. 기증자 절차에서 1.1-1.11 단계를 반복 합니다.
2. 두 개의 atraumatido 미세 혈관 클램프를 대동맥과 대 정 맥 근에 왼쪽 신장 동맥에 위치 시킵니다 (그림 3a).
3. 신장의 입구에 수용자 신장 정 맥 근 위부를 ligate. 혈관에서 남아 있는 모든 혈액을 제거 하기 위해 혈장 생리 식 염 수로 신장 정 맥을 씻어 냅니다.
4. 이전에 기증자 신장에 위치 하 고 8-0를 가진 수 갑의 신장 정 맥 위에 결 찰 된 신장 정 맥을 밀어 넣습니다 실크 봉합 (그림 3b). 팔목에 신장 정 맥을 고정 할 때 동일한 위치 방향을 유지.
5. 왼쪽 신장의 하 부 극의 수준에서 요 관를 ligate. Perinephric 지방에서 신장을 동원 합니다.
6. 수용자 신장의 입구에 신장 동맥 근 위부를 ligate. 혈관의 과잉 혈액을 제거 하려면 혈장 염 수로 씻어 내십시오. 10-0 나일론 봉합 사를 사용 하 여 8 ~ 10 개의 봉합이 중단 된 신장 동맥의 종단 간 문 합을 수행 합니다 (그림 3c). 모험 층을 사용 하 여 동맥을 기동.
7. 혈관 클램프를 제거 하 여 신장의 재 관류를 다시 시작 하십시오. 먼저 정 맥에 클램프를 제거한 다음 동맥에 클램프를 제거 합니다 (그림 3d). 무 균 면봉을 사용 하 여 문 합 부위 주위의 모든 부 위에 가볍게 압력을가 합니다. 몇 분은 특허 문 합을 달성 하기에 충분 해야한다.
8. 적절 한 관류를 평가 하기 위해 신장을 잠시 관찰 하십시오. 재 관류 직후, 신장은 색상을 변경 하 고 몇 분 후 점차 자연 스러운 짙은 붉은 색을 회복 해야 합니다 (그림 3E). 요 관 및 현장 소변 생산의 가시적 연동 운동 때때로 관찰 된다.
9. Ureteral 커 프의 노출 된 팁을 받는 요 관에 삽입 하 고 수령인에 게 8-0을 확보 하 여 마무리 합니다. 실크 봉합 (도 2c 및 도 3F).
10. 기증자와 수령인의 요 관을 위치에 유지 하기 위해, 각 요 관 측의 끝을 서로 묶어.
11. 선택적으로, 오른쪽 신장은 4-0 실크 봉합 사와 신장을 제거 하 여 오른쪽 신장 동맥과 정 맥을 묶는 하 여 조카를 절제 할 수 있습니다.
12. 복 강에서 모든 고 지를 제거 하 고 모든 장기를 자연 스러운 위치에 반환 하 고 내장에 생리 식 염 수 1 mL을 넣어 습기를 유지 하 고 4-0 흡수 성 봉합 사를 사용 하 여 복 부를 닫고 피부를 닫기 위해 4-0 실크 봉합을 합니다. 중단 된 방식으로.

3. 수술 후 관리

1. 광고 libitum 물과 음식에 대 한 액세스와 깨끗 한 케이지에 동물을 배치 하 고 37 ° c가 열 패드에 복구 할 수 있습니다.
2. 진통에 대 한 피하에 0.1 mg/kg 부 프레 노르 핀을 주입 하 고 회복을 위해 동물을 모니터링 하십시오. 추가 진통제 투여는 다음 며칠에 필요할 수 있습니다, 불편 함이나 통증의 징후에 따라. 항생제는 전염 하는 합병증이 희소 하기 때문에, 일상적으로 관리 되지 않습니다.
3. 동물 시설에 다시 동물을 반환 하기 전에 1 ~ 2 시간에 대 한 복구를 관찰 합니다. 처음 24 시간 동안 동물의 2 배 – 하루 3 배를 검사 하 고, 매일 검사를 수행 합니다. 통증과 고통, 경구 섭취, 비뇨 기 출력의 징후에 주의 하십시오.
4. 수술 후 7 ~ 10 일 후에 바늘을 제거 하십시오.

결과

신 유전학 (n=5) 과 동종 신장 이식 (n=5)을 수행 하였다 . 신 유전학 이식이 있는 동물은 면역 억제제 치료 없이 장기간 생존을 달성 하였다. 면역 억제 없이 동종이 식을 받은 동물은 이식 편을 거절 하 고 8 일의 중앙값 생존을 통해 신부전에 굴복 하였다 (도 4a). 합성 군에서 정숙 하 게 증가 된 혈 청 크 레 아 티 닌은 동종 군에서 14 배로 증가 시키면?...

토론

이 원고에서, 우리는이 절차를 수행 하는 데 필요한 모든 장비를 포함 하 여 구체적으로 래 트의 직교 KT에 대 한 외과 수술 방법을 설명 합니다 (그림 5). 1965에서 피셔와 리는 쥐의 KT에 대 한 첫 번째 보고서를 출판 하였으며,이는 흥미로운 조사 분야¹⁸의 시작이 되었다. 이후,이 모델의 재현성을 향상 시키기 위해 많은 변형이 도입 되었습니다. 그것은 허 혈 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm