Trapianto di rene ortotopico ratto: un nuovo approccio chirurgico semplificato

Riepilogo

Lo scopo di questo manoscritto e protocollo è quello di spiegare e dimostrare in dettaglio la procedura chirurgica del trapianto di rene ortotopico nei ratti. Questo metodo è semplificato per ottenere la corretta perfusione del rene donatore e abbreviare il tempo di riperfusione utilizzando la tecnica di anastomosi del polsino venoso e ureterale.

Abstract

Il trapianto di rene offre un aumento dei tassi di sopravvivenza e una migliore qualità della vita per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale, rispetto a qualsiasi tipo di terapia sostitutiva renale. Nel corso degli ultimi decenni, il modello di trapianto di rene di ratto è stato utilizzato per studiare i fenomeni immunologici di rigetto e tolleranza. Questo modello è diventato uno strumento indispensabile per testare nuovi farmaci e regimi immunomodulatori prima di procedere con costosi studi preclinici su animali di grandi dimensioni.

Questo protocollo fornisce una panoramica dettagliata su come eseguire in modo affidabile il trapianto di rene ortotopico nei ratti. Questo protocollo comprende tre passaggi distintivi che aumentano la probabilità di successo: perfusione del rene donatore da vampate attraverso la vena portale e l'uso di un sistema di polsino per anastomose le vene renali e ureteri, diminuendo così freddo e caldo tempi di ischemia. Utilizzando questa tecnica, abbiamo raggiunto tassi di sopravvivenza oltre i 6 mesi con la normale creatinina sierica negli animali con trapianti renali singenici o tollerante. A seconda dello scopo dello studio, questo modello può essere modificato da trattamenti pre-o post-trapianto per studiare il rigetto acuto, cronico, cellulare o mediato dagli anticorpi. Si tratta di un modello animale riproducibile, affidabile e conveniente per studiare diversi aspetti del trapianto di rene.

Introduzione

Storicamente, i primi studi di rigetto del trapianto sono stati eseguiti da Brent e Medawar utilizzando trapianti di pelle nei roditori¹. Ben presto divenne chiaro che la pelle ha caratteristiche immunologiche distinte, rendendolo un organo altamente immunogenico che è diverso nel rigetto da altri organi solidi vascolarizzati². Studi di ratto di rigetto di trapianto di organo solido sono abitualmente limitati a cuore, fegato, e trapianti di rene. Anche se ciascuno di questi organi è adatto a studiare il rigetto, ci sono vantaggi e svantaggi per ciascuno di essi. I trapianti cardiaci sono spesso trapiantati nell'addome e anastomosed all'aorta e alla vena cava, con il cuore nativo del ricevente in posizione³. Questo non ricrea le condizioni cliniche umane, anatomiche e fisiologiche. Inoltre, i cuori sono molto sensibili all'ischemia fredda e devono essere riperfuso preferenzialmente entro 1 h al fine di essere in grado di recuperare la loro funzione⁴. I trapianti di fegato sono generalmente considerati chirurgicamente più impegnativi e sensibili al tempo per eseguire. Dopo aver rimosso il fegato nativo, il fegato donatore deve essere impiantato e riperfuso entro 30 min come i destinatari non possono durare più a lungo senza un fegato funzionante⁵. L'arteria epatica, la vena del portale e soprattutto la ricostruzione del dotto biliare richiedono abilità chirurgiche raffinate. Oltre alle sfide chirurgiche, il fegato è noto per possedere proprietà tollerogeniche e roditori e gli esseri umani possono diventare operalmente tolleranti^6,7,8. Il rene, a differenza degli organi di cui sopra, può essere trapiantato in modo ortotopico, è noto per essere un organo immunogeno con episodi di rigetto coerenti e riproducibili (se non immunosoppressi), e consente tempi prolungati di ischemia fredda di diversi Ore. Questo rende il trapianto di rene di ratto un modello ideale per studiare il rigetto e la tolleranza dell'alloinnesto.

Il trapianto di rene (KT) è la scelta preferita di trattamento per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale. Negli ultimi decenni, i risultati di sopravvivenza a breve termine dopo KT sono migliorati drasticamente, ma i risultati di sopravvivenza a lungo termine sono stagnanti⁹. I regimi immunosoppressori convenzionali restano la terapia standard anti-rigetto. Tuttavia, l'uso cronico di terapie immunosoppressive provoca morbilità e mortalità significative, come nefrotossicità, diabete e neoplasie secondarie^10,11,12. Nel lungo termine, il rigetto cronico di anticorpi e cellulari-mediati minaccia la sopravvivenza del trapianto, con limitate opzioni terapeutiche disponibili.

Un obiettivo importante nel trapianto è l'induzione della tolleranza al trapianto al fine di ovviare alla necessità di immunosoppressione cronica. Il modello di ratto KT è uno strumento robusto per indagare il processo di rigetto immunologico e per valutare nuovi approcci all'immunomodulazione e alla tolleranza al trapianto. Il ratto funge anche da modello adatto per lo studio di rigetto acuto e cronico di cellule e anticorpi mediati^{13,14,15,16,17}. Questo modello chirurgico ha dimostrato di essere uno strumento affidabile, riproducibile e conveniente per studiare vari aspetti del rigetto e della tolleranza dell'alloinnesto. Viene spesso utilizzato per testare nuovi protocolli che inducano la tolleranza prima di intraprendere studi costosi e ingombranti su grandi animali. L'esecuzione di KT in ratti richiede un'ampia formazione chirurgica e competenze per raggiungere tassi di sopravvivenza di > 90%. In questo manoscritto e nel video didattico di accompagnamento, forniamo un contorno passo-passo per il KT ortotopico nel ratto, come eseguito con successo per molti anni presso la nostra istituzione.

Prima di iniziare qualsiasi procedura, la selezione del donatore e del destinatario è critica e dipende dalla natura dell'esperimento. Idealmente, i donatori e i riceventi dovrebbero pesare tra 220 – 260 g ed essere tra 8 – 12 settimane di età. Gli animali sotto 220 g hanno arterie di piccolo diametro, vene e ureteri, rendendo l'anastomosi nel ricevente particolarmente impegnativa. Una minore perdita di sangue può causare ipovolemia e portare alla morte in animali più piccoli. Animali più pesanti di 260 g mostrano più grasso intorno ai loro vasi, e l'isolamento della nave richiederà più tempo operativo e aumentare il tempo di ischemia fredda.

Protocollo

Lewis (RT1¹) e Dark Agouti (da) (RT1A^a) ratti sono stati acquistati da venditori commerciali (vedere la tabella dei materiali). Questi ceppi completamente non corrispondenti a MHC sono spesso usati per studiare il rigetto acuto dell'alloinnesto renale. Tutti gli animali sono stati alloggiati e mantenuti secondo le linee guida nazionali degli istituti di salute (NIH) in una struttura specifica priva di agenti patogeni presso la Johns Hopkins University. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per l'assistenza e l'uso degli animali.

1. procedura di donatore

1. Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici da utilizzare in questa procedura come mezzo di sterilizzazione e utilizzare guanti sterili monouso per prevenire complicazioni infettive.
2. Anestetizzare il ratto donatore con l'inalazione di isoflurano (induzione al 3% – 4% e mantenimento all'1% – 2%) per il resto della procedura. Dare a tutti gli animali donatori e riceventi la buprenorfina preemptive per via sottocutanea a 0,1 mg/kg di peso corporeo per l'analgesia.
3. Ora, posizionare il ratto in una posizione supina e immobilizzare gli arti con nastro adesivo sterile.
4. Utilizzare un tagliatore meccanico per rimuovere i capelli dalla zona addominale.
   1. Applicare un lubrificante per gli occhi e utilizzare garza sterile imbevuta di povidone-iodio, seguita da garza imbevuta di alcool isopropilico, per sterilizzare il campo chirurgico.
   2. Prima della prima incisione, assicurarsi che il ratto sia adeguatamente anestetizzato controllando l'assenza del riflesso di astinenza della punta.
5. Utilizzando le forbici, iniziare facendo una grande linea mediana longitudinale della pelle e l'incisione del muscolo dalla sinfisi pube al xiphoid, ed entrare nella cavità peritoneale.
6. Inserire due retrattori su entrambi i lati della parete addominale al fine di esporre la cavità intra-addominale.
7. Coprire l'intestino con una garza sterile umida e spostarla sul lato destro dell'addome, esponendo l'aorta, la vena cava e il rene sinistro. Applicare 1 mL di soluzione salina preriscaldata con una siringa da 1 CC per mantenere l'intestino e gli organi addominali umidi e a una temperatura normale.
   1. Applicare una seconda garza umida per coprire e mobilitare lo stomaco e la milza craniale al rene e una piccola garza umida per coprire il rene esposto (Figura 1a).
8. Utilizzare pinze di dissezione microchirurgica per isolare e mobilitare l'arteria renale sinistra e la vena dal tessuto connettivo e l'altro. Isolare la vena renale sinistra cauterizzando la vena gonadica sinistra e isolare l'arteria renale sinistra cauterizzando l'arteria surrenale. Dopo di che, mobilitare l'aorta e vena cava superiore e inferiore del pedicolo renale sinistro dissezione del tessuto connettivo con pinze dissezione (Figura 1B).
9. Dividere e mobilitare l'uretere dal tessuto connettivo utilizzando pinze dissezione, e fare un'incisione diagonale a una lunghezza di 2 cm misurata dalla pelvi renale, utilizzando microforbici. Inserire un polsino in poliammide (vedere tabella dei materiali) a metà strada nell'uretere e fissare il polsino posizionando un nodo con 8-0 sutura di seta (Figura 1C).
   Nota: è importante non rimuovere tutto il grasso e il tessuto connettivo dall'uretere, in quanto forniscono protezione contro l'ostruzione causata da aderenze, e la loro rimozione può causare necrosi ureterale. Prestare particolare attenzione alla conservazione della nave che fornisce ossigeno all'uretere.
10. Mobilizzare il rene sinistro separandolo dal grasso perinefrico utilizzando pinze dissezione o microforbici. Lasci la capsula adiposa del rene attaccata e usi quel sito per maneggiare il rene.
    1. Esporre la vena cava inferiore.
11. Somministrare 200 unità di eparina utilizzando una siringa con un ago da 27 G attraverso la vena del pene. Esercitare pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone per almeno 1 min per prevenire il sanguinamento.
12. Identificare la vena del portale (PV) e la vena cava inferiore (IVC) (Figura 1D). Sciacquare il rene iniettando 50 mL di soluzione salina fredda miscelata con 500 unità di eparina nella vena portale utilizzando un ago da 16 G (Figura 1E). Prima del rossore, tagliare la vena cava inferiore a livello infrahepatico e la vena portale caudale al sito di inserimento dell'ago per consentire al sangue di uscire dalla circolazione. Iniziare a sciacquare il rene gradualmente inseguendo la soluzione salina. Osservare un cambiamento di colore del rene dal rosso scuro ad un colore grigio uniforme e pallido (Figura 1F).
13. Dopo il rossore, legare l'arteria renale e la vena prossimale all'aorta e alla vena cava e posizionare il rene arrossato in una capsula di Petri in soluzione salina fredda sul ghiaccio. Figura 2 A rappresenta la panoramica schematica della procedura di donatore.
14. Una volta che il rene è in soluzione salina fredda, fissare e immobilizzare la maniglia del polsino della vena (vedere la tabella dei materiali) e tirare delicatamente la vena renale attraverso il polsino. Quindi, fissare la vena renale sopra il polsino posizionando tre nodi con sutura di seta a otto zero (Figura 2B).
    Nota: prestare particolare attenzione all'orientamento della vena, fissandolo in posizione. Le vene ruotate causano un'ostruzione del flusso sanguigno e conducono alla trombosi.

2. procedura del destinatario

1. Ripetere i passaggi 1.1 – 1.11 dalla procedura di donatore.
2. Posizionare due morsetti atraumatici per microvasi sull'arteria renale sinistra e la vena prossimale all'aorta e alla vena cava (Figura 3a).
3. Legare la vena renale ricevente prossimale all'ingresso del rene. Sciacquare la vena renale con una soluzione salina eparinizzata per rimuovere tutto il sangue rimanente dalla nave.
4. Far scorrere la vena renale ligata sulla vena renale ammanata precedentemente posizionata nel rene donatore e fissarlo con un 8-0 sutura di seta (Figura 3B). Mantenere lo stesso orientamento posizionale quando si fissano la vena renale sopra il polsino.
5. Legare l'uretere a livello del polo inferiore del rene sinistro. Mobilizzare il rene dal grasso perinefrico.
6. Legare l'arteria renale prossimale all'ingresso del rene ricevente. Sciacquare con soluzione salina eparinizzata per rimuovere il sangue in eccesso nella nave. Eseguire un'anastomosi end-to-end dell'arteria renale con da 8 a 10 sutura interrotte utilizzando una sutura di nylon 10-0 (Figura 3C). Manovrare l'arteria utilizzando lo strato avventiziale.
7. Rimuovere i morsetti del recipiente per riattivare la riperfusione del rene. Iniziare rimuovendo il morsetto sulla vena seguita dal morsetto sull'arteria (Figura 3D). Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per esercitare una leggera pressione su tutte le aree che circondano la regione dell'anastomosi. Alcuni minuti dovrebbero essere sufficienti per ottenere un'anastomosi brevettuale.
8. Osservare brevemente il rene per valutare la perfusione adeguata. Immediatamente dopo la riperfusione, il rene dovrebbe cambiare colore e ritrovare gradualmente il suo colore rosso scuro naturale dopo pochi minuti (Figura 3E). A volte si osservano la peristalsi visibile dell'uretere e la produzione di urina in loco.
9. Terminare inserendo la punta esposta del polsino ureterale nell'uretere ricevente e fissare l'uretere ricevente con un 8-0 sutura di seta (Figura 2C e Figura 3F).
10. Al fine di mantenere in posizione il donatore e il ricevente ureteri, legare le estremità di ogni lato dell'uretere l'uno all'altro.
11. Facoltativamente, il rene destro può essere nefrectomizzato legando l'arteria renale destra e la vena con una sutura di seta 4-0 e rimuovendo il rene.
12. Rimuovere tutte le garza dalla cavità addominale, riportare tutti gli organi alla loro posizione naturale, spruzzare 1 mL di soluzione salina sopra l'intestino per mantenerli umidi e chiudere l'addome utilizzando una sutura assorbibili 4-0 sul muscolo retto e una sutura 4-0 di seta per chiudere la pelle giaceva in modo interrotto.

3. assistenza postoperatoria

1. Collocare l'animale in una gabbia pulita con accesso ad acqua e cibo ad libitum e consentire il recupero su un tampone riscaldante di 37 ° c.
2. Iniettare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea per l'analgesia e monitorare l'animale per il recupero. Ulteriori somministrazione di analgesici può essere necessaria nei prossimi giorni, a seconda dei segni di disagio o dolore. Gli antibiotici non vengono somministrati di routine, poiché le complicanze infettive sono rare.
3. Osservare il recupero per 1 – 2 h prima di riportare l'animale alla struttura animale. Ispezionare l'animale 2x – 3x al giorno per le prime 24 ore, seguita da un'ispezione giornaliera. Prestare attenzione ai segni di dolore e angoscia, assunzione orale, e la produzione urinaria.
4. Rimuovere i punti 7 – 10 giorni dopo l'operazione.

Risultati

Abbiamo eseguito trapianti di rene singenici (n = 5) e allogenico (n = 5). Gli animali con un trapianto syngeneico hanno raggiunto la sopravvivenza a lungo termine senza alcun trattamento immunosoppressivo. Gli animali che hanno ricevuto un trapianto allogenico senza immunosoppressione hanno respinto il loro innesto e hanno ceduto all'insufficienza renale con una sopravvivenza mediana di 8 giorni (Figura 4a). La creatinina sierica media è aumentata modesta...

Discussione

In questo manoscritto, descriviamo in dettaglio il metodo chirurgico per il KT ortotopico nei ratti, comprese tutte le attrezzature necessarie per eseguire questa procedura (Figura 5). Nel 1965, Fisher e Lee pubblicarono il primo rapporto sul KT in ratti, che divenne l'inizio di un emozionante campo investigativo¹⁸. Da allora, sono state introdotte molte modifiche per migliorare la riproducibilità di questo modello. Ha servito come un modello animale efficace per stu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm