Orthotopic ラット腎移植: 新規かつ簡便な外科的アプローチ

要約

この原稿とプロトコールの目的は、ラットの orthotopic 腎移植の外科的処置を詳細に説明し、実証することである。この方法は、ドナー腎臓の正しい灌流を達成し、静脈および尿管カフ吻合技術を使用して再灌流時間を短縮するために単純化される。

要約

腎臓移植は、あらゆる種類の腎補充療法と比較して、末期腎疾患患者の生存率の向上および生活の質の改善を提供する。過去数十年の間に、ラット腎臓移植モデルは、拒絶および寛容の免疫学的現象を研究するために使用されてきた。このモデルは、高価な前臨床大規模動物研究を進める前に新しい免疫調節医薬品およびレジメンをテストするために欠くことのできないツールとなっている。

このプロトコルは、ラットに orthotopic 腎移植を確実に行う方法の詳細な概要を提供する。このプロトコルには、成功の確率を高める3つの特徴的なステップが含まれています: 門脈へのフラッシングによるドナー腎臓の灌流および腎静脈および尿管を anastomose するためのカフ系の使用によって、それによって寒さと暖かさを減少させる虚血時間。この技術を用いて、同系または寛容な腎移植を有する動物において通常の血清クレアチニンを有する6ヶ月を超える生存率を達成した。研究の目的に応じて、このモデルは、急性、慢性、細胞性、または抗体媒介拒絶反応を研究するために、事前または奏治療によって修飾することができる。それは腎臓の移植の異なった側面を研究するために再生可能な、信頼できる、費用効果が高い動物モデルである。

概要

歴史的に、最初の移植拒絶研究は、げっ歯類¹の皮膚移植を用いてブレントと Medawar によって行われた。皮膚が異なる免疫学的特徴を有していることがすぐに明らかになり、他の血管化固形臓器²からの拒絶反応とは異なる非常に免疫原性の器官となった。固形臓器移植拒絶反応のラット研究は、心臓、肝臓、腎臓移植に習慣的に制限されています。これらの器官のそれぞれは拒絶反応を研究するのに適していますが、それぞれに長所と短所があります。心臓移植はしばしば腹部に移植され、大動脈および下大静脈に anastomosed、レシピエントの生来の心臓は³である。これは、人間の臨床的、解剖学的および生理的状態を再作成しません。さらに、心臓は寒冷性虚血に対して非常に敏感であり、その機能⁴を回復できるようにするために1時間以内に優先的に reperfused されなければならない。肝臓移植は、一般に、外科的により困難で、時間に敏感であると考えられている。ネイティブ肝臓を除去した後、ドナーの肝臓は、レシピエントが機能している肝臓⁵を伴わなくては長くは続かないので30分以内に移植され、reperfused する必要がある。肝動脈、門脈、特に胆管再建には洗練された外科的技術が必要である。外科的課題に加えて、肝臓は tolerogenic 特性を有することが知られており、げっ歯類およびヒトは、運用的に寛容な^6、7、8になることができる。腎臓は、前述の器官とは異なり、orthotopic の方法で移植することができ、一貫性のある再現性のある拒絶エピソード (免疫抑制でない場合) を有する免疫原性器官であることが知られており、そしていくつかの長期の低温虚血時間を可能にする時間。これは、ラット腎臓移植は、同種移植片拒絶および耐性を研究するための理想的なモデルになります。

腎移植 (KT) は、末期腎疾患患者に対する治療の好ましい選択である。過去数十年の間に、KT の後の短期的な生存率は劇的に改善しましたが、長期生存の結果は停滞しています⁹.従来の免疫抑制レジメンは、標準的な抗拒絶療法のままである。しかし、免疫抑制療法の慢性的な使用は、腎毒性、糖尿病、二次悪性腫瘍などの重大な罹患率および死亡率を引き起こす^10、11、12。長期的には、慢性抗体および細胞媒介性拒絶は移植片の生存を脅かし、限られた治療選択肢が利用可能である。

移植における主要な目標は、慢性免疫抑制の必要性を未然ための移植性耐性の誘導である。ラット KT モデルは免疫学的拒絶過程を調査し、免疫調節および移植の許容のための新しいアプローチを評価するために強い用具である。ラットはまた、急性および慢性の細胞および抗体媒介性拒絶反応^{13、14、15、16、17}を研究するのに適したモデルとして機能する。この外科モデルは同種移植片の拒絶および許容のさまざまな側面を研究する信頼でき、再生可能な、費用効果が高い用具であると証明した。高価で面倒な大型動物研究を行う前に、新しい公差誘導プロトコールをテストするためによく使用されます。ラットで KT を行うには、広範な外科的訓練と > 90% の生存率に達するための専門知識が必要です。本稿と付随する説明ビデオでは、私たちの機関で長年にわたって成功したように、ラットに orthotopic KT の概要を段階的に提供しています。

任意の手順を開始する前に, ドナーとレシピエントの選択が重要であり、実験の性質に依存します.理想的には、ドナーとレシピエントは 220 ~ 260 g の間で体重が 8 ~ 12 週の間でなければならない。220 g の下の動物は、小径の動脈、静脈、および尿管を有し、レシピエントの吻合を特に困難にする。軽度の失血は血液量減少を引き起こし、小動物では死に至ることがある。260 g より重い動物は、血管の周囲により多くの脂肪を表示し、容器の分離はより多くの手術時間を必要とし、冷たい虚血時間を増加させる。

プロトコル

1. ドナー・プロシージャ

1. この手順で使用するすべての手術器具を滅菌の手段として調製し、オートクレーブし、感染性合併症を予防するために使い捨て滅菌手袋を使用する。
2. イソフルラン吸入によるドナーラットの麻酔 (誘導 3% – 4% および 1% – 2% の維持)手順の残りの部分。鎮痛のために 0.1 mg/kg 体重で皮下のすべてのドナーおよびレシピエント動物に先制して与える。
3. さて、ラットを仰向けの姿勢に置き、滅菌マスキングテープで四肢を固定する。
4. 腹部の領域から髪を削除するには、メカニカルクリッパーを使用します。
   1. 眼の潤滑剤を塗布し、ポビドンに浸した滅菌ガーゼを使用し、その後にイソプロピルアルコールに浸したガーゼを用いて、手術野を殺菌する。
   2. 最初の切開に先立って、ラットがつま先のピンチ離脱反射の不在をチェックすることによって十分に麻酔されていることを確認する。
5. はさみを使用して、恥骨恥骨から剣状突起に大きな長手方向の正中線皮膚と筋肉の切開を行い、腹腔に入ることによってオフを開始します。
6. 腹腔内腔を露出させるために、腹壁の両側に2つのレトラクターを挿入します。
7. 湿った無菌ガーゼで腸を覆い、それを腹部の右側面に移し、大動脈、大静脈、および左腎を暴露する。予熱した生理食塩水1ml を 1 cc 注射器で塗布し、腸と腹部の器官を湿ったまま常温に保ちます。
   1. 2番目の湿ったガーゼを塗布して、胃と脾臓を腎臓に動員し、露出した腎臓を覆う小さな湿ったガーゼを塗る (図 1a)。
8. 結合組織および互いから左の腎動脈と静脈を分離し、動員するために顕微手術解剖鉗子を使用してください。左性腺静脈を焼灼ことによって左腎静脈を分離し、副腎を焼灼ことによって左腎動脈を分離する。その後、結合組織を解剖鉗子で解剖することによって左腎椎弓根の大動脈および下大静脈を動員する (図 1B)。
9. 解剖鉗子を使用して結合組織から尿管を分裂させ、動員し、microscissors を使用して、腎骨盤から測定された2cm の長さで斜め切開を行う。(材料のテーブルを見て) 尿管の中に半分を挿入し、8-0 との結び目を置くことによって袖口をしっかり固定しなさいシルク縫合糸 (図 1C)。
   注: 彼らは癒着によって引き起こされる閉塞に対する保護を提供し、その除去は、尿管壊死を引き起こす可能性があり、尿管からすべての脂肪と結合組織を除去しないことが重要です。尿管に酸素を供給する容器を保存することに特に注意を払いなさい。
10. 解剖鉗子または microscissors を使用して perinephric 脂肪からそれを分離することによって左の腎臓を動員します。添付の腎臓の脂肪カプセルを残して、腎臓を処理するために、そのサイトを使用.
    1. 下大静脈を露出させます。
11. 200単位のヘパリンを投与し、27 G 針の注射器を陰茎静脈に通す。綿棒での注入部位に、出血を防ぐために少なくとも1分の圧力をかけます。
12. 門脈 (pv) および下大静脈 (ivc) を特定します (図 1D)。16 G の針 (図 1E) を使用して、500のヘパリンを門脈内に混合した 50 mL の冷食塩水を注入して、腎臓を洗い流す。フラッシュする前に、下大静脈を infrahepatic レベルで切断し、針挿入部位で門脈尾部を切り、血液が循環を終了することを可能にする。徐々に食塩水を注入して腎臓を洗い流す。濃い赤から均一な灰色と淡い色に腎臓の色の変化を観察します (図 1F)。
13. フラッシング後、結紮を大動脈および下大静脈に近位の腎動脈および静脈に配置し、氷の上の冷たい生理食塩水中のペトリ皿にフラッシュされた腎臓を置く。図 2A は、ドナー・プロシージャーの概略概要を表します。
14. 腎臓が冷食塩水に入ったら、静脈カフのハンドル (材料の表を参照してください) を固定して、慎重にカフを通して腎静脈を引っ張ってください。その後、8ゼロの絹の縫合糸を使用して3つの結び目を置くことによって、カフの上に腎静脈を固定する (図 2b)。
    注: 適所でそれを確保しながら、静脈の向きに特別な注意を払ってください。回転した静脈は血流の閉塞を引き起こし、血栓症につながる。

2. 受取人の手順

1. ドナー・プロシージャーからステップ 1.1 ~ 1.11 を繰り返します。
2. 2つの atraumatic マイクロ容器クランプを左の腎動脈および静脈の近位に大動脈および下大静脈に置きます (図 3A)。
3. 結紮は、レシピエント腎静脈を腎臓の入口に近位する。ヘパリン処理の生理食塩水で腎静脈を洗い流すと、血管から残りのすべての血液を取り除くことができます。
4. 以前にドナー腎臓に配置されたカフ腎静脈の上に結紮された腎静脈をスライドし、8-0 でそれを確保シルクの縫合糸 (図 3B)。カフ上の腎静脈を保護するときに同じ位置の向きを維持します。.
5. 結紮は、尿管を左腎の下極のレベルにする。Perinephric 脂肪から腎臓を動員します。.
6. 結紮は、レシピエント腎臓の入口に近位の腎動脈を有する。ヘパリン処理の生理食塩水で洗い流し、血管内の余分な血液を除去します。10-0 ナイロン縫合糸 (図 3C) を用いて 8 ~ 10 個の切断縫合糸で腎動脈のエンドツーエンド吻合術を行う。Adventitial 層を使用して動脈を操縦します。
7. 容器クランプを取り外して、腎臓の再灌流を解除ます。まず、静脈のクランプを外し、続いて動脈にクランプをかけます (図 3D)。滅菌綿棒を使用して、吻合領域の周囲の滲出した部分を軽く圧迫します。数分は、特許吻合を達成するのに十分でなければなりません。
8. 腎臓を簡単に観察し、十分な灌流を評価します。再灌流直後に、腎臓は色を変え、数分後に徐々に自然な暗赤色の色を取り戻しなければならない (図 3E)。尿管の目に見える蠕動およびオンサイト尿の生産は時々観察される。
9. 尿管袖口の露出された先端をレシピエント尿管に挿入し、8-0 でレシピエント尿管を固定することによって終えるシルク縫合糸 (図 2Cおよび図 3F)。
10. ドナーおよびレシピエントの尿管を位置に保つために、各尿管側の端を互いに結ぶ。
11. 必要に応じて、右腎臓を4-0 のシルク縫合線で nephrectomized し、腎臓を除去することによって、右腎を切断することができる。
12. 腹腔からすべてのガーゼを取り除き、すべての臓器を自然な位置に戻し、腸の上に 1 mL の生理食塩水をかけて湿った状態に保ち、直筋に4-0 吸収性の縫合糸を使用して腹部を閉じ、皮膚を閉じるために4-0 の絹の縫合線を使う中断された方法で er.

3. 術後のケア

1. 自由摂取水と食物にアクセスできる清潔なケージに動物を置き、37° c の加熱パッドの回復を可能にします。
2. は、鎮痛のために皮下に 0.1 mg/kg のブプレノルフィンを注入し、回復のために動物を監視する。追加の鎮痛薬投与は、不快感や痛みの徴候に応じて、次の数日で必要になることがあります。抗生物質は日常的に投与されることはなく、感染性合併症は稀である。
3. 動物を動物施設に戻す前に、1〜2時間の回復を観察してください。動物の2x を検査し、最初の24時間の1日3倍、そして毎日の検査を行います。痛みや苦痛、経口摂取、および尿の出力の兆候に注意を払います。
4. 操作後 7 ~ 10 日後にステッチを外します。

結果

同系 (n = 5) と同種腎移植 (n = 5) を行った。同系移植片を有する動物は、免疫抑制治療を行わずに長期生存を達成した。免疫抑制なしで同種移植を受けた動物は、その移植片を拒絶し、8日間の中央値生存で腎不全に屈した (図 4a)。平均血清クレアチニンは同系群では控えめに増加したが同種異系群では14倍増加した (0.5 mg/dL 対 7.0 mg/dL, p < 0...

ディスカッション

本稿では、この手順を実行するために必要なすべての装置を含め、ラットに orthotopic KT の外科的方法について詳述する (図 5)。1965年、フィッシャーとリーはラットの KT に関する最初の報告書を発表したが、これは刺激的な調査分野¹⁸の始まりとなった。それ以来、このモデルの再現性を向上させるために多くの修正が導入されています。それは、虚血?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm