使用氧化二氮作为评估哺乳动物体内成分和耗水量的非侵入性、非致命性工具

摘要

本文介绍了两种哺乳动物（昆虫和食肉）的氧化稀释技术，以确定全身水分、瘦体质量、身体脂肪量和耗水量。

摘要

身体状况评分系统和身体状况指数是评估一个物种的健康状况或健康状况的常见技术。身体状况评分系统是评估者依赖的，具有高度主观性的潜力。身体状况指数可以通过觅食、体重的影响以及统计和推断问题来混淆。身体状况评分系统和身体状况指数的替代是使用稳定的同位素，如氧化铀来确定身体成分。氧化氧化剂稀释法是一种可重复的定量技术，用于估计人类、野生动物和国内物种的身体组成。此外，氧化铀稀释技术可用于确定单个动物的耗水量。在这里，我们描述了氧化氧化稀释技术对评估大棕色蝙蝠（Eptesus fuscus）的身体成分以及评估猫（Felis catis）的耗水量的适应。

引言

身体状况评分系统和身体状况指数是评估^{1、2类健康状况}或健康状况的常见技术。许多家养动物和动物物种都有独特的身体状况评分（BCS）系统，用于评估动物的肌肉和表面脂肪组织^3。但是，BCS 评估依赖于评估者，这意味着当经过培训的评估者评估 BCS 是一个目标或半定量的测量时。在野生动物物种中，身体状况指数是常用的，而不是BCS，并且基于身体质量与体型或身体质量与前臂²的比率。身体状况的病症往往被觅食的影响混淆，可以混淆的体型，以及统计和推断问题^4。

身体状况评分系统和身体状况指数的替代是使用稳定的同位素来确定身体成分。一种常用的稳定同位素是氧化铀_（D2O），这是一种非放射性水，其中氢原子是铀同位素。本研究中描述的氧化氧化稀释方法可以是一种非主观、定量和可重复的技术，用于估计人类⁵和多种物种^4、6、7的人体组成。这种技术对研究野生动物的身体组成是有利的。例如，它可用于评估身体成分的纵向变化，例如管理行动之前和之后。然而，在一些野生动物物种中，氧化氮可以高估实际含水量^8。因此，在适应某一物种的技术时，通过比较氧化氧化法和非濒危物种的骨层分析来验证该方法非常重要。对于受威胁和濒危物种，应将双X射线吸收测量（DXA）等非破坏性方法视为与完全尸体分析的黄金标准破坏性方法的替代比较方法。

除了身体成分_，D2O稀释技术还可用于确定单个动物的耗水量^9。D2 O的这种独特应用不仅可用于回答研究问题，还可用于评估大型社会环境中个体动物的耗水量。

在这里，我们描述了_D2O稀释技术的适应，用于评估昆虫、大棕色蝙蝠（Eptesus fuscus）中的身体成分，以及评估食肉动物、猫（费利斯猫）的耗水量。

研究方案

这里描述的所有实验都得到密苏里大学动物护理和使用委员会的批准，并在密苏里保护部（MDC）野生动物科学采集许可证（许可证#16409和#17649）下进行。

1. 制备无菌、等位、盐渍_D2O库存溶液

1. 制作 9.0 g/L 盐渍 D₂O 的 50 mL 库存溶液。
   1. 重量为 450 mg 的制药级 NaCl，并将所有 NaCl 转移到 100 mL 的消毒烧杯中。在实验室笔记本中记录 NaCl 的确切数量到小数点 4 位。
   2. 使用无菌分级圆柱体，测量 50 g 的 ± 99.8% 的氧化铀，并转移到含有 NaCl 的无菌烧杯中。在实验室笔记本或电子表格中记录到小数点4位的精确氧化物量。
   3. 通过带亚微米孔隙（0.2 μm）的非热敏无菌盘过滤器过滤10 mL的异位强度NaCl（9.0 g/L）。
   4. 将 20 G 针头连接到非热敏无菌盘过滤器，带亚微米孔隙（0.2 μm），并配有 10 mL 注射器筒。插入 100 mL 无菌空小瓶的隔膜。
   5. 将真空管连接到 22 G 针头，然后将针头插入 100 mL 无菌空小瓶的隔膜中。
   6. 将库存溶液的 10 mL 倒入注射器筒中。缓慢打开真空，直到 D₂O 库存溶液开始缓慢地过滤到无菌小瓶中。继续将 D₂O 库存溶液倒入注射器筒中，直到过滤所有 50 mL。
      注:根据所需的剂量，库存溶液可能需要稀释或浓缩。D2 O的剂量会因物种和分析方法的敏感性而异。对于猫，工作溶液用于施用0.7克/千克_D2O的剂量。上述库存溶液最大限度地减少了在动物皮下引入的NaCl溶液量，同时仍允许准确测量剂量。对于蝙蝠等小型哺乳动物，这种浓度必须稀释到工作溶液中，如0.1600 g/mL。这种浓度允许以大约 100 μL 或更少的 NaCl 溶液精确测量和施用 0.75 g/kg D₂O 的剂量。

2. 制备无菌、等位、盐渍D₂O库存工作溶液

1. 称量为 10 mL 空无菌小瓶，并将重量记录到最接近的 4 位小数。量表。
2. 使用 1.0 mL 注射器将 0.65 mL 的 D₂O 库存溶液转移到焦油，10 mL 空无菌小瓶。记录 D₂O 到 4 位小数位的重量。量表。
3. 计算 10 mL 空小瓶中的 D₂O 体积。使用以下公式。
   
   其中W记录重量，D是 99.8% D₂O （1.107 g/mL） 的密度。
4. 使用 D₂O 的计算体积和已知重量来确定制造 ±0.1600 g/mL 工作溶液所需的等托盐水体积。
5. 插入 10 mL 无菌小瓶的隔膜，22 G 针（连接到真空管）。插入 10 mL 无菌小瓶的隔膜，即 20 G 针头（连接到装有 10 mL 注射器管的 0.22 μm 注射器过滤器上）。
6. 将计算出来的等子 NaCl 质量/体积倒入注射器筒中，打开真空，以便缓慢地滴入无菌的 10 mL 小瓶中。
7. 记录小瓶的重量，确保创建 ±0.1600 g/mL 工作溶液。

3. 用_D2O测定大棕色蝙蝠（Eptesicus fucsus）的身体组成

注:协议中使用的_D2O库存溶液为0.1598 g/mL。在采集血液之前，确保去除高达 200 μL 的血液将占蝙蝠总血量的 10%，并且属于机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 既定的采血指南。所有动物都应禁食或腹部触觉，以确保空腹。最近的一餐可能会改变动物的体重，导致混淆的结果，因为计算确定身体脂肪依赖于动物的体量。

1. 麻醉一只棕色的大蝙蝠。
   1. 使用 5.0% 的分路胶进行感应。使用 0.5%-3.0% 的异常胶维持稳定的麻醉平面。
   2. 通过测试踏板退出反射（捏住蝙蝠的脚趾）确定适当的麻醉深度。蝙蝠不应对感觉做出反应，呼吸速率应保持缓慢和稳定。根据需要调整共和体，以保持稳定的麻醉平面。
   3. 按照IACUC的要求记录电子水平、心率、呼吸速率和其他信息。
2. 称量大棕色蝙蝠，并将重量记录到小数点后 4 位。
3. 用酒精准备垫清洁内膜静脉上的尿毒（尾膜），并允许干燥。在体间静脉上涂上一层薄薄的石油果冻。
4. 使用 29 G 针头刺穿静脉间的背部分，并使用塑料肝素毛细管收集 100 μL 的血液。收集后轻轻滚动每根管子，并贴上管的标签，确保整个血液与肝素钠充分混合。
5. 使用为小型哺乳动物校准的DXA机器，获得蝙蝠¹⁰的三次DXA扫描。
6. 通过将蝙蝠重量以千克乘以 0.75 g/kg 的 D₂O 剂量，确定要注射的 D₂O 的质量（以 g 表示）。通过将 D₂O 剂量的重量除以工作溶液的浓度来确定计算出的 D₂O 剂量 （V） 的体积。
   
   
7. 使用连接29 G针头的胰岛素注射器绘制_D2O计算的体积。称量 D₂O、胰岛素注射器和针头。记录到小数点后 4 位。
8. 在麻醉蝙蝠的背臀区域上注射_D2O皮下。
9. 让蝙蝠从麻醉中恢复，并记录注射时间。
10. 注射后立即，用29G针连接，称量现在空的胰岛素注射器。将权重记录为小数点后 4 位。
11. 从注射前D₂O填充胰岛素注射器中减去胰岛素注射器的注射后重量，确定注射的_D2O的剂量。记录到小数点后 4 位。
12. 在采血后30分钟内，使用造血离心机旋转每个毛细管5分钟。如果造子离心机允许多种速度，则设置为 10，000 x g。
13. 用锋利的剪刀切割整个血液和血浆之间的塑料毛细管。使用 200 μL 移液器将等离子体直接排入标有标签的 500 μL 存储管中。
14. 平衡期后，从间静脉中再采集100μL的血液。
    注:平衡期会因物种而异，如果蝙蝠进入旋涡。对于大棕色蝙蝠，通常 2 小时足以达到平衡期。
15. 通过重复步骤 3.13 将等离子体分离到第二个标签 500 μL 微离心螺钉顶管中。将样品储存在-20°C或更冷处，直到分析。

4. 傅立叶变换红外分光度分析

1. 将沙浴温度设定为60°C，以利于蒸馏（允许将水和_D2O与其他血液成分分离）。
2. 将每个等离子样品的移液器 50 μL 和标准移液器放在 1.5 mL 锥形微离心管盖内侧。包括含有已知浓度为_D2O的标准作为质量控制。
   注:理想情况下，每个动物每个样本有三个复制，并报告三个复制的平均值。由于作者使用的 FT-IR 设备所需的样品量有限，因此对蝙蝠样本没有进行复制。如果任何样品含有少于50μL的等离子体，将样品量移移到锥形微离心管盖上并记录体积。
3. 保持微离心盖倒置，并将 1.5 mL 锥形微离心管拧到盖上。将带盖的倒置（倒置）管与沙浴接触，至少12小时（过夜）。
4. 12 小时后，拆下盖子，用新的清洁盖进行更换。在离心机中脉冲微离心管10秒。
5. 创建以下标准:0 ppm（0 毫克 D₂O 在 1 L 蒸馏水中），293 ppm （293 mg D 2 O 在 1 L 蒸馏水中），585 ppm （585 毫克 D₂O 在 1 L 蒸馏水中），878 ppm （878 毫克 D₂O 在 1 L 蒸馏水中）， 和 1170 ppm D₂O （1170 毫克 D₂O 在 1 L 蒸馏水）。
   注: 建议使用标准曲线的上述值。可使用 250 ppm、500 ppm、750 ppm 等替代值。
6. 将液体传输单元安装到傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）光谱仪（材料表）。向电池中填充甲醇并连接喷射口。在小心取出甲醇注射器时，缓慢地向细胞注水，以降低气泡的风险。将油管连接到输出端口，以便在分析后拆下样品。
7. 准备FTIR光谱仪软件（材料表），用于分析水中的_D2O。表1列出了该协议中使用的光谱仪软件的参数设置。
8. 使用稀释剂 0.22 μm 过滤蒸馏水收集背景样品。这应该是标准中使用的水。
9. 注入 0 ppm D₂O 的 40 μL 并记录光谱。将光谱另存为逗号分隔值 （CSV） 文件。
10. 继续注入并保存所有标准的光谱，以创建标准曲线。
11. 每 60–90 分钟重复一次背景曲线和标准曲线。
12. 将每个蒸馏样品的40μL注入液体传输单元，保存光谱。
    注:根据液体传输单元的体积改变标准和蒸馏样品的注入体积。如果样品体积低于 40 μL 或用背景蒸馏水稀释 1:1，请使用较小的体积液体传输单元。
13. 使用 Jennings 等人¹¹号描述的电子表格程序或光谱软件，确定 FTIR 光谱中每个样品的_D2O 浓度。执行复制时，使用平均浓度计算身体成分。

5. 身体成分的计算

1. 使用以下方程¹²将每个样品的铀浓缩 （ppm） 转换为原子百分比浓度:
   
   其中 x 是样品的测量铀浓缩 （ppm），0.0001557 是维也纳标准平均海水 （VSMOW）¹³中报告的二元数的摩尔部分。
2. 使用以下方程^4、12、14计算每个样本的总体水量:
   )
   其中 E 是测量的富集（原子%）背景校正后样品中的二聚体，B为g的注射质量，0.998为注射_D2O的浓度。
   注: 与实验室氢的铀交换会导致对身体总水质量的2%高估。身体总水应通过将总水体估计减少 2% 的体重来纠正。
3. 使用以下等式估计每只蝙蝠的无脂肪质量（瘦体质量和所有其他非脂肪成分）:
   
   注:使用常规接受值 0.732 表示瘦体质量的馏分水分含量，用于健康、补水、非哺乳蝙蝠。无脂肪质量的小部分水分含量可以改变在哺乳大棕色的基础上，产后周^15。对于其他物种，在计算瘦体质量之前，请使用文献中公布的值或确定瘦体质量的馏分水分含量。
4. 使用以下方程估计身体脂肪质量:
   
5. 使用以下公式将身体脂肪质量（g）以 g 转换为身体脂肪质量百分比:
   

6. 肉食类水中水成分的测定（费利斯猫，家猫）

1. 如第 1 节所述，准备库存解决方案。
2. 称每只猫最接近小数点后3位，并记录重量。使用 0.70 g/kg 的 D₂O 剂量计算步骤 3.6 中描述的每只猫的剂量。
3. 按照步骤 3.7_3.8 中所述准备每种剂量。使用 3 mL 或 5 mL 注射器，使用 22 G 针头，而不是胰岛素注射器。
4. 收集500μL全血，然后分皮下施用0.7克/千克D₂O.在2000 x g下将全血离心15分钟，并将血浆储存在1.5 mL微离心螺顶管中，直至分析。
5. 注射后收集500μL全血4小时。在2000 x g下将全血离心15分钟，并将血浆储存在1.5 mL微离心螺杆顶部管中，直至分析。
6. 注射后14天收集500μL全血。在2000 x g下将全血离心15分钟，并将血浆储存在1.5 mL微离心螺杆顶部管中，直至分析。
   注:采血之间的天数可以基于实验需求和注射后期间，其中_D2O可以检测到高于背景水平。14天是来自胡珀等人的膳食治疗块^的长度。
7. 根据第 4 节执行 FT-IR 分析，并根据本协议第 5 节计算身体组成。
8. 使用以下公式计算以 mL/日表示的耗水量:
   
   
   
   其中 TBW 是总体水，初始 D₂O 和最终 D₂O 是注射后 D₂O 样品中以 ppm 为单位测量的浓度。

结果

氧化氧化稀释技术可用于评估各种物种的身体组成。为了证明适应性，我们报道了在北美昆虫蝙蝠物种Eptesicus fuscus（大棕色蝙蝠）中首次使用氧化氮稀释技术，以取得代表性的结果。通过采集_{D2 O}注射前和后注血样本，完成定时高原，如对任何不为平衡期未知的物种进行。经测定，在非蝙蝠注射后两小时，足以进行平衡。随着平衡时间的已知，确定了13只野?...

讨论

自20世纪40^{年代以来，}利用氧化氮测定TBW，并用于人类和各种家养和野生动物物种^4、6、7。其他非破坏性技术已经开发，包括生物电阻抗分析 （BIA）、DXA 和定量磁共振 （QMR）。每种方法都有优点和缺点，在选择评估身体成分的特定方法之前应考虑。该协议选择使用DXA作为氧化氮的比较方法，以评估身体成分?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 micron non-pyrogenic disk filter	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile
1.5 mL conical microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-9701	1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap
10 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	clear, sterile glass injection unit
10 mL syringe	Becton Dickinson	305219	sterile 10 mL syringe individually wrapped
100 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	clear, sterile glass injection unit
20 gauge needle	Exel	26417	needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel
22 gauge needle	Exel	26411	needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel
deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-25G	99.9 atom % D
isofluorane	Vetone	3060	fluriso isoflurane, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR standard software
petroleum jelly	Vaseline	305212311006	Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant
plastic capillary tubes	Innovative Med Tech	100050	sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length
Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell	International Crystal Laboratory	0005D-875	0.05 mm Pathlength
sodium chloride	EMD Millipore	1.37017	suitable for biopharmaceutical production
Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer	ThermoFisher Scientific	269-169400	discontinued model, newer models available