Использование оксида дейтерия в качестве неинвазивного, нелетального инструмента для оценки состава тела и потребления воды у млекопитающих

Резюме

В этой статье описывается техника разбавления оксида дейтерия у двух млекопитающих, инсективора и плотоядных, чтобы определить общую воду тела, мышечную массу тела, жировую массу и потребление воды.

Аннотация

Системы оценки состояния тела и индексы состояния тела являются общими методами, используемыми для оценки состояния здоровья или пригодности вида. Системы оценки состояния тела зависят от оценщика и могут быть весьма субъективными. Индексы состояния тела могут быть сбиты с толку кормления, эффекты массы тела, а также статистические и inferential проблемы. Альтернативой системы оценки состояния тела и индексы состояния тела использует стабильный изотоп, такой как оксид дейтерия, чтобы определить состав тела. Метод разбавления оксида дейтерия является повторяемым, количественным методом, используемым для оценки состава тела людей, диких животных и домашних видов. Кроме того, метод разбавления оксида дейтерия может быть использован для определения потребления воды отдельным животным. Здесь мы описываем адаптацию метода разбавления оксида дейтерия для оценки состава тела у больших коричневых летучих мышей(Eptesicus fuscus) и для оценки потребления воды у кошек(Felis catis).

Введение

Системы оценки состояния тела и индексы состояния тела являются общими методами, используемыми для оценки состояния здоровья или пригодности вида^1,2. Многие отечественные и зоологические виды имеют уникальные системы оценки состояния тела (BCS), которые используются для оценки мышц животного и поверхностной жировой ткани^3. Однако оценка БКС опирается на оценщика, что означает, что БКС является объективным или полуколичественным измерением при оценке квалифицированным оценщиком. В дикой природе, состояние тела индексы обычно используются, а не BCS и основаны на соотношении массы тела к размеру тела или массы тела предплечья². Состояние тела indicis часто путают последствия кормления и могут быть сбиты с толку размер тела, а также статистические и inferential проблемы⁴.

Альтернативой системы оценки состояния тела и индексы состояния тела использует стабильный изотоп для определения состава тела. Одним из часто используемых стабильных изотопов является оксид дейтерия (D₂O), нерадиоактивная форма воды, в которой атомы водорода являются изотопами дейтерия. Метод разбавления оксида дейтерия, описанный в данном исследовании, может быть несубъективным, количественным и повторяемым методом, используемым для оценки состава тела у людей⁵ и широкого круга видов^4,6,7. Этот метод может быть выгодным для изучения состава тела в дикой природе. Например, он может быть использован для оценки продольных изменений в составе тела, таких как до и после действия управления. Однако, в некоторых видах дикой природы оксида дейтерия может переоценить фактическое содержание воды⁸. Поэтому при адаптации метода для вида важно проверить метод, сравнив метод оксида дейтерия с анализом туши для видов, не находящихся под угрозой исчезновения. Для видов, находящихся под угрозой исчезновения и находящихся под угрозой исчезновения, неразрушающий метод, такой как двойной рентгеновская абсорфтиометрия (DXA), следует рассматривать в качестве альтернативного метода сравнения с золотым стандартом разрушительного метода полного анализа туши.

В дополнение к составу тела, d₂O разбавления техника может быть использована для определения потребления воды отдельных животных⁹. Это уникальное приложение D₂O может быть использовано для ответа не только на исследовательские вопросы, но может быть полезно для оценки потребления воды отдельных животных (ы) размещены в больших социальных условиях.

Здесь мы описываем адаптацию d₂O разбавления техники для оценки состава тела в насекомояле, большие коричневые летучие мыши (Eptesicus fuscus), и для оценки потребления воды в плотоядных, кошек (Felis catis).

протокол

Все эксперименты, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Миссури и проведены в рамках Департамента охраны природы штата Миссури (MDC) разрешение на научную коллекцию дикой природы (Permit #16409 and #17649).

1. Подготовка стерильного, изотонического, засоленного раствора D₂O

1. Сделать 50 мл бульонного раствора 9,0 г/л засоленным D₂O.
   1. Взвесить 450 мг фармацевтического сорта NaCl и переложить все NaCl в 100 мл стерилизованного стакана. Запишите точное количество NaCl до 4 десятичных мест в лабораторной записной книжке.
   2. Используя стерильный цилиндр, измерьте 50 г оксида дейтерия 99,8% и перенесите в стерильный стакан, содержащий NaCl. Запишите точное количество оксида дейтерия до 4 десятичных мест в лабораторной записной книжке или электронной таблице.
   3. Фильтр 10 мл изосмотической силы NaCl (9,0 г/л) через непирогенный стерильный дисковый фильтр с субмикронными порами (0,2 мкм).
   4. Прикрепите иглу 20 G к непирогенному стерильному дисковому фильтру с субмикронными порами (0,2 мкм), оснащенными бочкой шприца 10 мл. Вставьте в перегородку стерильной пустой флакон 100 мл.
   5. Прикрепите вакуумную трубку к игле 22 G и вставьте иглу в перегородку стерильной пустой флакон 100 мл.
   6. Налейте 10 мл бульонного раствора в бочку шприца. Медленно включите вакуум до тех пор, пока раствор запаса D₂O не начнет медленно фильтроваться в стерильный флакон. Продолжайте залить раствор запаса D₂O в бочку шприца до тех пор, пока не будут отфильтрочены все 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Склад раствор может быть разбавлен или концентрирован в зависимости от необходимой дозы. Доза D₂O будет варьироваться в зависимости от вида и чувствительности аналитического метода. Для кошек рабочий раствор использовался для введения дозы 0,7 г/кг D₂O. Биржевое решение, описанное выше, сводит к минимуму количество раствора NaCl, введенного подкожно животному, в то же время позволяя точно измерять дозу. Для мелких млекопитающих, таких как летучие мыши, эта концентрация должна быть разбавлена рабочим раствором, таким как 0.1600 g/mL. Эта концентрация позволяет точно измерить дозу 0,75 г/кг D₂O и вводить его примерно в 100 л или менее в растворе NaCl.

2. Подготовка стерильных, изотонических, засоленных D₂O складе рабочего решения для летучих мышей

1. Взвесьте 10 мл пустой стерильный флакон и рекордный вес до ближайших 4 десятичных мест. Масштаб Таза.
2. Используйте шприц объемом 1,0 мл для передачи 0,65 мл раствора запаса D₂O в tared, 10 мл пустой стерильный флакон. Рекордный вес D₂O до 4 десятичных мест. Масштаб Таза.
3. Рассчитайте объем D₂O в пустом флаконе 10 мл. Используйте следующее уравнение.
   
   где W зарегистрирован вес и D плотность 99,8% D₂O (1,107 г/мл).
4. Используйте расчетный объем и известный вес D₂O, чтобы определить объем изотонического соля, необходимого для изготовления рабочего решения в размере 0,1600 г/мл.
5. Вставьте в перегородку стерильной флакона 10 мл, иглу 22 G (прикрепленная к вакуумной трубке). Вставьте в перегородку стерильной флакона 10 мл, иглу 20 G (прилагается к фильтру шприца 0,22 мкм, оснащенному бочкой шприца 10 мл).
6. Налейте рассчитанную массу/объем изотонического NaCl в бочку шприца и включите вакуум, чтобы позволить медленное капельное в стерильный флакон 10 мл.
7. Запишите вес флакона и убедитесь, что создается рабочее решение стоимостью 0,1600 г/мл.

3. Определение состава тела больших коричневых летучих мышей (Eptesicus fucsus) с D₂O

ПРИМЕЧАНИЕ: Складраствор D₂O, используемый в протоколе, равен 0,1598 г/мл. Перед сбором крови убедитесь, что удаление до 200 л крови составит 10% от общего объема крови летучей мыши и находится в рамках Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) установленных руководящих принципов для сбора крови. Все животные должны быть поститься или живот пальпированные для обеспечения пустой желудок. Недавнее питание может изменить вес животного в результате confounded результаты, поскольку расчеты для определения жира полагаться на массу тела животного.

1. Анестезируйте большую коричневую летучую мышь.
   1. Используйте 5,0% изолюран для индукции. Поддержание стабильной плоскости анестезии с использованием 0,5%-3,0% изолюран.
   2. Определите надлежащую глубину анестезии, испытав рефлектор отмены педали (защипывание ног летучей мыши). Летучая мышь не должна реагировать на ощущение и частота дыхания должна оставаться медленной и стабильной. Отрегулируйте изолюран по мере необходимости для поддержания стабильной плоскости анестезии.
   3. Запись изофруранового уровня, частота сердечных приступов, частота дыхания и другую информацию, как того требует IACUC.
2. Взвесьте большую коричневую летучую мышь и запишите вес до 4 десятичных мест.
3. Очистите уропатагиум (хвостовую мембрану) над межнравственной веной с помощью спиртовой подготовительной прокладки и дайте высохнуть. Нанесите тонкий слой вазелина на межнравственное вену.
4. Используйте 29 G иглу, чтобы проколоть локальную часть межнравственной вены и собрать 100 л крови с помощью пластиковых натрия гепарина капиллярных труб. Обеспечить адекватное смешивание всей крови с гепарином натрия, аккуратно прокатки каждой трубки после сбора и этикетки трубки.
5. Используя машину DXA, откалиброванный для мелких млекопитающих, получите три DXA-сканирования летучей мыши^10.
6. Определить массу (в г) D₂O, чтобы впрыснуть путем умножения веса летучей мыши в кг на дозу D₂O 0,75 г/кг. Определите объем рассчитанной дозы D₂O (V) путем деления веса дозы D₂O на концентрацию рабочего раствора.
   
   
7. Используйте инсулиновый шприц с иглой 29 G, прикрепленной для составления объема расчета D₂O. Взвесьте D₂O, инсулиновый шприц и иглу. Запись до 4 десятичных мест.
8. Введите D₂O подкожно над областью терпящих суставов бедра обезожданной летучей мыши.
9. Разрешить летучей мыши, чтобы оправиться от анестезии и записывать время инъекции.
10. Сразу же после инъекции, взвесить теперь пустой инсулин шприц с 29 G иглы прилагается. Запись веса до 4 десятичных мест.
11. Определите дозу D₂O вводят путем вычитания после инъекционного веса инсулина шприц из предварительной инъекции D₂O заполнены инсулиншом. Запись до 4 десятичных мест.
12. В течение 30 минут после сбора крови, использовать центрифугу гематокрита, чтобы спина каждой капиллярной трубки в течение 5 минут. Если центрифуга гематокрита позволяет на несколько скоростей, то установлена до 10 000 х г.
13. Используйте острые ножницы, чтобы сократить пластиковые капиллярные трубки между всей крови и плазмы. Используйте пипетку объемом 200 л, чтобы изгнать плазму непосредственно в маркированную трубку для хранения 500 л.
14. После периода равновесия соберите еще 100 л крови из интерфеморальной вены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Период равновесия будет варьироваться в зависимости от вида, и если летучие мыши идут в оцепенение. Для больших коричневых летучих мышей, как правило, 2 ч достаточно для периода равновесия.
15. Разделите плазму на вторую маркированную, 500 микроцентрифуги винт верхней трубки, повторяя шаг 3.13. Храните образцы при -20 градусах Цельсия или холоднее до анализа.

4. Анализ инфракрасной спектрометрии Фурье-трансформер

1. Установите температуру песочной ванны до 60 градусов по Цельсию, чтобы облегчить дистилляцию (позволяет отделить воду и D₂O от других компонентов крови).
2. Пипетка 50 л каждого образца плазмы и стандартные на внутренней стороне 1,5 мл конической микроцентрифуги трубки крышка. Включая стандарты, содержащие известные концентрации D₂O в качестве контроля качества.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале каждое животное будет иметь три реплики на образец и в среднем из трех реплик сообщили. Из-за ограниченного объема выборки и объема образцов, необходимых для оборудования FT-IR, использованного авторами, репликации не были выполнены для образцов летучих мышей. Если какой-либо образец содержит менее 50 кЛ плазмы, пипетка количество образца на конической микроцентрифуговой трубки крышка и записывать объем.
3. Держите крышку микроцентрифуги вверх дном и винт 1,5 мл конической микроцентрифуги трубки на крышку. Поместите перевернутую (вверх ногами) трубку с крышкой в контакте с песком в песчаной ванне минимум на 12 ч (ночь).
4. После 12 ч снимите крышку и замените новой, чистой крышкой. Импульс микроцентрифуговой трубки в течение 10 с в центрифуге.
5. Создайте следующие стандарты: 0 промилле (0 мг D₂O в 1 л дистиллированной воды), 293 промилле (293 мг D₂O в 1 L дистиллированной воды), 585 ppm (585 мг D₂O в 1 L дистиллированной воды), 878 ppm (878 мг D₂O в 1 L дистиллированной воды), и 1170 ppm D₂O (1170 мг D₂O в 1 L дистиллированной воды).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения выше предлагаются для стандартной кривой. Альтернативные значения, такие как 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, и так далее могут быть использованы.
6. Установите жидкую клетку передачи в спектрометр инфракрасного спектрометрии Фурье (FTIR)(Таблица материалов). Заполните ячейку метанолом и соедините порт инъекций. Медленно заполните клетку фоновой водой, тщательно удаляя метанол шприц, чтобы уменьшить риск пузырьков воздуха. Прикрепите трубку к выходному порту, чтобы позволить удалить образцы после анализа.
7. Подготовьте программное обеспечение спектрометра FTIR(Таблица материалов) для анализа D₂O в воде. Параметры параметров для программного обеспечения спектрометра, используемого в этом протоколе, перечислены в таблице 1.
8. Соберите фоновый образец, используя разбавив, 0,22 мкм-фильтруется, дистиллированной воды. Это должна быть та же вода, которая используется для стандартов.
9. Введите 40 qL 0 ppm D₂O и запишите спектры. Сохранить спектры как запятую разделенных значений (CSV) файл.
10. Продолжайте вводить и сохранять спектры всех стандартов, чтобы создать стандартную кривую.
11. Повторите фон и стандартную кривую каждые 60–90 минут.
12. Введите 40 л каждого дистиллированного образца в жидкую клетку передачи и сохраните спектры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменить объем инъекций стандартов и дистиллированных образцов на основе объема жидкой клетки передачи. Используйте меньшую литую ячейку передачи жидкости, если объем образца ниже 40 л или разбавляйте 1:1 с фоновой дистиллированной водой.
13. Определите концентрацию D₂O каждого образца из спектра FTIR с помощью программы электронных таблиц, описанной Дженнингсом и др.¹¹ или спектральным программным обеспечением. Когда репликации выполняются, используйте среднюю концентрацию для расчета состава тела.

5. Расчет состава тела

1. Преобразуйте обогащение дейтерия (ppm) в концентрацию атома в процентах для каждого образца, используя следующее уравнение^12:
   
   где х является измеренное дейтерия обогащения (ppm) образца и 0.0001557 является моль фракции дейтерия сообщили в Вене Стандартный средний океан воды (VSMOW)¹³.
2. Рассчитайте общую воду тела для каждого образца, используя следующее уравнение^4,12,14:
   )
   где E является измеренное обогащение (атом) дейтерия в образце после фоновой коррекции, B является инъекционной массой в г, и 0,998 является концентрацией инъекций D₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Deuterium обмен с лабильным водородом вызывает 2% завышение общей массы воды тела. Общая вода в организме должна быть исправлена за счет уменьшения общей массы воды тела на 2% от массы тела.
3. Оцените обезжиренное массу (мышечную массу тела и все другие обезжиренные компоненты) каждой летучей мыши, используя следующее уравнение:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте условно принятое значение 0,732 для дробного содержания влаги мышечной массы тела для здоровых, эвгидратированных, не-лактирующих летучих мышей. Содержание дробной влаги в обезжиреновой массе может меняться в лактирующих больших коричневых на основе послеродовой недели¹⁵. Для других видов, использовать значения, опубликованные в литературе или определить содержание дробной влаги мышечной массы тела до выполнения расчетов мышечной массы тела.
4. Оцените жировую массу с помощью следующего уравнения:
   
5. Преобразуйте массу жировых отложений в г в процент жировой массы, используя следующее уравнение:
   

6. Определение состава воды у плотоядного(Felis catus,домашняя кошка)

1. Подготовьте акционерное решение, описанное в разделе 1.
2. Взвесьте каждую кошку до ближайших 3 десятичных мест и рекордный вес. Рассчитайте дозу для каждой кошки, как описано в шаге 3.6 с помощью дозы D₂O 0,70 г/кг.
3. Подготовьте каждую дозу, как описано в шагах 3.7'3.8. с помощью шприца 3 мл или 5 мл с иглой 22 G вместо инсулинового шприца.
4. Соберите 500 л цельной крови и впоследствии вводят подкожно 0,7 г/кг D₂O. Центрифуга цельной крови при 2000 х г в течение 15 мин и храните плазму в 1,5 мл микроцентрифуга винтовых верхних трубок при -20 градусов до анализа.
5. Соберите 500 л цельной крови 4 ч после инъекции. Центрифуга цельной крови на 2000 х г в течение 15 минут и хранить плазму в 1,5 мл микроцентрифуга винт верхние трубы при -20 градусов по Цельсию до анализа.
6. Соберите 500 л цельной крови 14 дней после инъекции. Центрифуга цельной крови на 2000 х г в течение 15 минут и хранить плазму в 1,5 мл микроцентрифуга винт верхние трубы при -20 градусов по Цельсию до анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дней между сбором крови может быть основано на экспериментальных потребностях и периоде после инъекции, в котором D₂O может быть обнаружен выше фоновых уровней. Четырнадцать дней была продолжительность диетического лечения блоков от Хупер и др.⁹.
7. Выполняйте анализ FT-IR в соответствии с разделом 4 и вычисляйте состав тела в соответствии с разделом 5 этого протокола.
8. Рассчитайте потребление воды в мл/день, используя следующие уравнения:
   
   
   
   где TBW является общей воды тела, первоначальные D₂O и окончательный D₂O являются концентрации, измеренные в промилле в пост-инъекции D₂O образцов.

Результаты

Техника разбавления оксида дейтерия может быть использована для оценки состава тела различных видов. Чтобы продемонстрировать приспособляемость, мы сообщаем о первом использовании техники разбавления оксида дейтерия в североамериканских насекомоядных видов летуч...

Обсуждение

Использование оксида дейтерия для определения TBW был использован с 1940-х^{годов 17} и используется в организме человека и различных домашних и диких видов^4,6,7. Были разработаны другие неразрушающие методы, включая биоэлектриче?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 micron non-pyrogenic disk filter	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile
1.5 mL conical microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-9701	1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap
10 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	clear, sterile glass injection unit
10 mL syringe	Becton Dickinson	305219	sterile 10 mL syringe individually wrapped
100 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	clear, sterile glass injection unit
20 gauge needle	Exel	26417	needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel
22 gauge needle	Exel	26411	needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel
deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-25G	99.9 atom % D
isofluorane	Vetone	3060	fluriso isoflurane, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR standard software
petroleum jelly	Vaseline	305212311006	Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant
plastic capillary tubes	Innovative Med Tech	100050	sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length
Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell	International Crystal Laboratory	0005D-875	0.05 mm Pathlength
sodium chloride	EMD Millipore	1.37017	suitable for biopharmaceutical production
Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer	ThermoFisher Scientific	269-169400	discontinued model, newer models available