Utilisation de l’oxyde de deutérium comme outil non invasif et non létal pour évaluer la composition corporelle et la consommation d’eau chez les mammifères

Résumé

Cet article décrit la technique de dilution d’oxyde de deutérium dans deux mammifères, un insectivore et un carnivore, pour déterminer l’eau totale de corps, la masse maigre de corps, la masse grasse de corps, et la consommation d’eau.

Résumé

Les systèmes de notation de l’état corporel et les indices de l’état corporel sont des techniques courantes utilisées pour évaluer l’état de santé ou l’aptitude d’une espèce. Les systèmes de notation de l’état corporel dépendent de l’évaluateur et ont le potentiel d’être très subjectifs. Les indices de l’état corporel peuvent être confondus par la recherche de nourriture, les effets du poids corporel, ainsi que les problèmes statistiques et inférants. Une alternative aux systèmes de notation de l’état du corps et aux indices de l’état corporel est l’utilisation d’un isotope stable comme l’oxyde de deutérium pour déterminer la composition corporelle. La méthode de dilution de l’oxyde de deutérium est une technique quantitative répétable utilisée pour estimer la composition corporelle chez les humains, la faune et les espèces domestiques. En outre, la technique de dilution de l’oxyde de deutérium peut être utilisée pour déterminer la consommation d’eau d’un animal individuel. Ici, nous décrivons l’adaptation de la technique de dilution d’oxyde de deutérium pour évaluer la composition corporelle chez les grandes chauves-souris brunes (Eptesicus fuscus) et pour évaluer la consommation d’eau chez les chats (Felis catis).

Introduction

Les systèmes de notation de l’état corporel et les indices de l’état corporel sont des techniques courantes utilisées pour évaluer l’état de santé ou l’aptitude d’une espèce^1,2. Beaucoup d’espèces domestiques et zoologiques ont des systèmes uniques de notation de l’état corporel (BCS) qui sont utilisés pour évaluer le muscle d’un animal et le tissu adipeux superficiel³. Toutefois, l’évaluation de la SCB repose sur l’évaluateur, ce qui signifie que le SBC est une mesure objective ou semi-quantitative lorsqu’elle est évaluée par un évaluateur formé. Chez les espèces sauvages, les indices de l’état corporel sont couramment utilisés plutôt que le BCS et sont basés sur un rapport entre la masse corporelle et la taille corporelle ou la masse corporelle et^{l’avant-bras 2}. Les indicis de condition de corps sont souvent confondus par les effets de la recherche de nourriture et peuvent être confondus par la taille du corps aussi bien que les problèmes statistiques et inferentiels^4.

Une alternative aux systèmes de notation de l’état du corps et aux indices de l’état corporel consiste à utiliser un isotope stable pour déterminer la composition corporelle. Un isotope stable couramment utilisé est l’oxyde de deutérium (D₂O), une forme d’eau non radioactive dans laquelle les atomes d’hydrogène sont des isotopes de deutérium. La méthode de dilution de l’oxyde de deutérium décrite dans cette étude peut être une technique non subjective, quantitative et reproductible utilisée pour estimer la composition corporelle chez l’homme⁵ et un large éventail d’espèces^4,6,7. Cette technique peut être avantageuse pour l’étude de la composition corporelle de la faune. Par exemple, il peut être utilisé pour évaluer les changements longitudinals dans la composition du corps, comme avant et après une action de gestion. Cependant, chez certaines espèces sauvages, l’oxyde de deutérium peut surestimer la teneur réelle en eau⁸. Par conséquent, lors de l’adaptation de la technique pour une espèce, il est important de valider la méthode en comparant la méthode de l’oxyde de deutérium à l’analyse des carcasses pour les espèces non menacées. Pour les espèces menacées et en voie de disparition, une méthode non destructive comme l’absorptiométrie à rayons X double (DXA) devrait être considérée comme une méthode de comparaison alternative à la méthode destructrice de l’analyse complète des carcasses.

En plus de la composition du corps, la technique de dilution D₂O peut être utilisée pour déterminer la consommation d’eau d’un animal individuel⁹. Cette application unique de D₂O peut être utilisée pour répondre non seulement aux questions de recherche, mais peut être utile pour évaluer la consommation d’eau des animaux individuels hébergés dans de grands milieux sociaux.

Ici, nous décrivons l’adaptation de la technique de dilution D₂O pour évaluer la composition corporelle chez un insectivore, grandes chauves-souris brunes (Eptesicus fuscus), et pour évaluer la consommation d’eau chez un carnivore, les chats (Felis catis).

Protocole

Toutes les expériences décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Université du Missouri et menées en vertu du permis de collecte scientifique de la faune du Missouri Department of Conservation (MDC) (Permit #16409 et #17649).

1. Préparation de la solution stérile, isotonique, salinisée D₂O stock

1. Faire une solution de stock de 50 ml de 9,0 g/L salinated D₂O.
   1. Peser 450 mg de NaCl de qualité pharmaceutique et transférer tous les NaCl dans un bécher stérilisé de 100 ml. Enregistrez la quantité exacte de NaCl à 4 décimales dans le cahier de laboratoire.
   2. À l’aide d’un cylindre gradué stérile, mesurez 50 g d’oxyde de deutérium de 99,8 % et transférez-le dans le bécher stérile contenant le NaCl. Enregistrez la quantité exacte d’oxyde de deutérium à 4 décimales dans le cahier de laboratoire ou la feuille de calcul.
   3. Filtrer 10 mL de force isosmotique NaCl (9,0 g/L) à travers un filtre à disque stérile non pyrogénique avec des pores submicrons (0,2 m).
   4. Fixez une aiguille de 20 G au filtre à disque stérile non pyrogénique avec des pores submicrons (0,2 m) mladants munis d’un baril de seringue de 10 ml. Insérer dans le septum d’un flacon stérile de 100 ml.
   5. Fixez un tube à vide à une aiguille de 22 G et insérez l’aiguille dans le septum du flacon vide stérile de 100 ml.
   6. Verser 10 ml de la solution de bouillon dans le baril de seringue. Allumez lentement le vide jusqu’à ce que la solution de stock D₂O commence à filtrer lentement dans le flacon stérile. Continuer à verser la solution de bouillon D₂O dans le baril de seringue jusqu’à ce que tous les 50 mL soient filtrés.
      REMARQUE : La solution de stock peut devoir être diluée ou concentrée selon la dose requise. La dose de D₂O variera en fonction de l’espèce et de la sensibilité de la méthode analytique. Pour les chats, la solution de travail a été utilisée pour administrer une dose de 0,7 g/kg D₂O. La solution de stock décrite ci-dessus minimise la quantité de solution NaCl introduite sous-cutanée à l’animal tout en permettant une mesure précise de la dose. Pour les petits mammifères comme les chauves-souris, cette concentration doit être diluée à une solution de travail telle que 0,1600 g/mL. Cette concentration permet de mesurer et d’administrer avec précision la dose de 0,75 g/kg D₂O dans une solution NaCl d’environ 100 L ou moins.

2. Préparation de la solution de travail stérile, isotonique, salinisée D₂O pour les chauves-souris

1. Peser une fiole stérile vide de 10 ml et enregistrer le poids aux 4 décimales les plus proches. Échelle de tare.
2. Utilisez une seringue de 1,0 ml pour transférer 0,65 ml de la solution de stock D₂O à la fiole stérile vide de 10 ml. Poids record de D₂O à 4 décimales. Échelle de tare.
3. Calculer le volume de D₂O dans le flacon vide de 10 ml. Utilisez l’équation suivante.
   
   où W est enregistré poids et D est la densité de 99,8% D₂O (1.107 g/mL).
4. Utilisez le volume calculé et le poids connu du D₂O pour déterminer le volume de solution saline isotonique nécessaire pour effectuer une solution de travail de 0,1600 g/mL.
5. Insérer dans le septum du flacon stérile de 10 ml, l’aiguille de 22 G (attachée au tube à vide). Insert into the septum of the 10 mL sterile vial, the 20 G needle (attached to a 0.22 μm syringe filter fitted with a 10 mL syringe barrel).
6. Verser la masse calculée/volume de NaCl isotonique dans le baril de seringue et allumer le vide pour permettre un goutte-à-goutte lent dans le flacon stérile de 10 ml.
7. Enregistrez le poids de la fiole et assurez-vous de créer une solution de travail de 0,1600 g/mL.

3. Détermination de la composition corporelle des grosses chauves-souris brunes (Eptesicus fucsus) avec D₂O

REMARQUE: La solution de stock de D₂O utilisée dans le protocole est de 0,1598 g/mL. Avant de recueillir du sang, assurez-vous que l’élimination de jusqu’à 200 L de sang sera de 10 % du volume sanguin total de la chauve-souris et qu’elle fait partie des lignes directrices établies par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (CCIO) pour la collecte du sang. Tous les animaux doivent être jeûnés ou l’abdomen palpé pour assurer un estomac vide. Un repas récent pourrait modifier le poids de l’animal entraînant des résultats confus puisque les calculs pour déterminer la graisse corporelle reposent sur la masse corporelle de l’animal.

1. Anesthésiez une grosse chauve-souris brune.
   1. Utilisez 5,0% isoflurane pour l’induction. Maintenir un plan stable d’anesthésie à l’aide de 0,5 % à 3,0 % d’isoflurane.
   2. Déterminer la profondeur d’anesthésie appropriée en testant le réflexe de sevrage de la pédale (pincement des orteils de la chauve-souris). La chauve-souris ne doit pas réagir à la sensation et le taux respiratoire doit rester lent et stable. Ajuster l’isoflurane au besoin pour maintenir un plan stable d’anesthésie.
   3. Enregistrez le niveau d’isoflurane, la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire, et d’autres informations comme exigé par IACUC.
2. Peser la grosse chauve-souris brune et enregistrer le poids à 4 décimales.
3. Nettoyer l’uropatagium (membrane de queue) sur la veine interfémorale avec un tampon de préparation à l’alcool et laisser sécher. Appliquer une fine couche de gelée de pétrole sur la veine interfémorale.
4. Utilisez une aiguille de 29 G pour percer la partie dorsale de la veine interfémorale et recueillir 100 L de sang à l’aide de tubes capillaires en sodium plastique héparine. Assurer un mélange adéquat du sang entier avec l’héparine de sodium en roulant doucement chaque tube après la collecte et étiqueter le tube.
5. À l’aide d’une machine DXA calibrée pour les petits mammifères, obtenir trois scans DXA de la chauve-souris¹⁰.
6. Déterminer la masse (en g) de D₂O à injecter en multipliant le poids de la chauve-souris en kg par la dose D₂O de 0,75 g/kg. Déterminer le volume de la dose d’O D₂O (V) calculée en divisant le poids de la dose D₂O par la concentration de la solution de travail.
   
   
7. Utilisez une seringue d’insuline avec une aiguille de 29 G attachée pour calculer le volume de D₂O calculé. Pesez le D₂O, la seringue à insuline et l’aiguille. Enregistrement à 4 décimales.
8. Injecter le D₂O sous-cutanée sur la région de la hanche dorsal de la chauve-souris anesthésié.
9. Permettre à la chauve-souris de se remettre de l’anesthésie et enregistrer l’heure de l’injection.
10. Immédiatement après l’injection, peser la seringue d’insuline maintenant vide avec l’aiguille de 29 G attachée. Enregistrez le poids à 4 décimales.
11. Déterminer la dose de D₂O injectée en soustrayant le poids post-injection de la seringue d’insuline de la seringue d’insuline remplie de pré-injection D₂O. Enregistrement à 4 décimales.
12. Dans un délai de 30 minutes après la collecte de sang, utilisez une centrifugeuse hématocrit pour faire tourner chaque tube capillaire pendant 5 min. Si la centrifugeuse hematocrit permet plusieurs vitesses, réglé à 10 000 x g.
13. Utilisez un ciseaux pointus pour couper le tube capillaire en plastique entre le sang entier et le plasma. Utilisez une pipette de 200 l pour expulser le plasma directement dans un tube de stockage étiqueté de 500 l.
14. Après la période d’équilibre, recueillir un autre 100 L de sang de la veine interfémorale.
    REMARQUE : La période d’équilibre varie selon les espèces et si les chauves-souris entrent en torpeur. Pour les grosses chauves-souris brunes, généralement 2 h est suffisant pour la période d’équilibre.
15. Séparer le plasma en un deuxième tube de vis microcentrifuge de 500 l en répétant l’étape 3.13. Conserver les échantillons à -20 oC ou plus froid jusqu’à l’analyse.

4. Analyse de spectrophotométrie infrarouge à transformation Fourier

1. Fixer la température d’un bain de sable à 60 oC pour faciliter la distillation (permettre la séparation de l’eau et D₂O des autres composants sanguins).
2. Pipette 50 l de chaque échantillon de plasma et standard à l’intérieur d’un bouchon conique de 1,5 ml de tube microcentrifuge. Y compris les normes contenant des concentrations connues de D₂O comme contrôle de la qualité.
   REMARQUE : Idéalement, chaque animal aura trois répliques par échantillon et la moyenne des trois répliques signalées. En raison du volume limité de l’échantillon et du volume d’échantillons requis pour l’équipement FT-IR utilisé par les auteurs, aucune réplique n’a été effectuée pour les échantillons de chauves-souris. Si un échantillon contient moins de 50 l de plasma, pipette l’échantillon s’élève sur le bouchon conique du tube microcentrifuge et enregistre le volume.
3. Gardez le bouchon de microcentrifuge à l’envers et vissez le tube conique de 1,5 ml sur le bouchon. Placez le tube inversé (à l’envers) avec le bouchon en contact avec le sable dans le bain de sable pendant un minimum de 12 h (nuit).
4. Après 12 h, retirer le bouchon et le remplacer par un nouveau bouchon propre. Pulser le tube de microcentrifuge pendant 10 s dans une centrifugeuse.
5. Créez les normes suivantes : 0 ppm (0 mg D₂O en 1 L d’eau distillée), 293 ppm (293 mg D₂O en 1 L d’eau distillée), 585 mg D₂O en 1 L d’eau distillée), 878 ppm (878 mg D₂O en 1 L d’eau distillée), et 1170 ppm D₂O (1170 mg D₂O en 1 L d’eau distillée).
   REMARQUE : Les valeurs ci-dessus sont suggérées pour une courbe standard. Des valeurs alternatives telles que 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, et ainsi de suite peuvent être utilisées.
6. Installer une cellule de transmission liquide dans le spectrophotomètre spectrophotométry infrarouge de transformation Fourier (FTIR) (Tableau des matériaux). Remplissez la cellule de méthanol et connectez le port d’injection. Remplissez lentement la cellule d’eau de fond tout en enlevant soigneusement la seringue de méthanol pour réduire le risque de bulles d’air. Fixer le tube au port de sortie pour permettre l’enlèvement des échantillons après l’analyse.
7. Préparer le logiciel de spectromètre FTIR (Table of Materials) pour l’analyse de D₂O dans l’eau. Les paramètres du logiciel de spectromètre utilisé dans ce protocole sont énumérés dans le tableau 1.
8. Recueillir un échantillon de fond à l’aide du diluant, de l’eau distillée filtrée à 0,22 m. Cela devrait être la même eau utilisée pour les normes.
9. Injecter 40 oL du 0 ppm D₂O et enregistrer les spectres. Enregistrer les spectres en tant que fichier de valeurs séparées par virgule (CSV).
10. Continuez d’injecter et d’enregistrer les spectres de toutes les normes pour créer une courbe standard.
11. Répétez l’arrière-plan et la courbe standard toutes les 60 à 90 min.
12. Injecter 40 L de chaque échantillon distillé dans la cellule de transmission liquide et enregistrer les spectres.
    REMARQUE : Modifier le volume d’injection des normes et des échantillons distillés en fonction du volume de la cellule de transmission liquide. Utilisez une cellule de transmission liquide à plus petit volume si le volume de l’échantillon est inférieur à 40 L ou diluez 1:1 avec de l’eau distillée de fond.
13. Déterminer la concentration de D₂O de chaque échantillon à partir des spectres FTIR à l’aide d’un programme de feuilles de calcul tel que décrit par Jennings et coll.¹¹ ou le logiciel spectral. Lorsque des répliques sont effectuées, utilisez la concentration moyenne pour calculer la composition du corps.

5. Calcul de la composition corporelle

1. Convertir l’enrichissement du deutérium (ppm) en concentration en pourcentage d’atome pour chaque échantillon en utilisant l’équation suivante¹²:
   
   où x est l’enrichissement mesuré de deutérium (ppm) de l’échantillon et 0,0001557 est la fraction de taupe de deutérium rapportée dans Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW)¹³.
2. Calculez l’eau corporelle totale pour chaque échantillon à l’aide de l’équation suivante^4,12,14:
   )
   où E est l’enrichissement mesuré (atome%) de deutérium dans l’échantillon après correction de fond, B est la masse d’injection dans g, et 0,998 est la concentration de D₂O injecté.
   REMARQUE : L’échange de deutérium avec l’hydrogène labile provoque une surestimation de 2 % de la masse totale d’eau du corps. L’eau corporelle totale devrait être corrigée en réduisant l’estimation totale de la masse de l’eau corporelle de 2 % du poids corporel.
3. Estimer la masse sans gras (masse maigre du corps et tous les autres composants non gras) de chaque chauve-souris en utilisant l’équation suivante :
   
   REMARQUE : Utilisez la valeur conventionnellement acceptée de 0,732 pour la teneur en humidité fractionnaire de la masse maigre du corps pour les chauves-souris saines, euhydrated, non-lactatantes. La teneur en humidité fractionnaire de la masse sans gras peut changer en lactant de gros bruns basés sur la semaine post-partum¹⁵. Pour d’autres espèces, utilisez les valeurs publiées dans la littérature ou déterminez la teneur en humidité fractionnaire de la masse maigre avant d’effectuer des calculs de la masse maigre du corps.
4. Estimer la masse grasse du corps à l’aide de l’équation suivante :
   
5. Convertir la masse grasse du corps en g à pourcentage de masse grasse du corps en utilisant l’équation suivante:
   

6. Détermination de la composition de l’eau chez un carnivore (Felis catus, chat domestique)

1. Préparer la solution de stock telle que décrite à la section 1.
2. Pesez chaque chat aux 3 décimales les plus proches et enregistrez le poids. Calculez la dose pour chaque chat telle que décrite à l’étape 3.6 à l’aide d’une dose D₂O de 0,70 g/kg.
3. Préparer chaque dose telle que décrite dans les étapes 3.7-3.8. à l’aide d’une seringue de 3 ml ou 5 ml avec une aiguille de 22 G au lieu d’une seringue à insuline.
4. Recueillir 500 l de sang entier et ensuite administrer sous-cutanée le 0,7 g/kg D₂O. Centrifuge à 2 000 x g pendant 15 min et stocker le plasma dans des tubes de 1,5 mL de microcentrifuge à -20 oC jusqu’à l’analyse.
5. Recueillir 500 l de sang entier 4 h après l’injection. Centrifuger le sang entier à 2 000 x g pendant 15 min et stocker le plasma dans des tubes de 1,5 mL de vis microcentrifuge à -20 oC jusqu’à analyse.
6. Recueillir 500 l de sang entier 14 jours après l’injection. Centrifuger le sang entier à 2 000 x g pendant 15 min et stocker le plasma dans des tubes de 1,5 mL de vis microcentrifuge à -20 oC jusqu’à analyse.
   REMARQUE : Le nombre de jours entre la collecte de sang peut être basé sur les besoins expérimentaux et la période post-injection au cours de laquelle D₂O peut être détecté au-dessus des niveaux de fond. Quatorze jours était la longueur des blocs de traitement diététique de Hooper et autres⁹.
7. Effectuez une analyse FT-IR selon la section 4 et calculez la composition du corps en fonction de la section 5 de ce protocole.
8. Calculez la consommation d’eau en mL/jour en utilisant les équations suivantes :
   
   
   
   où le TBW est l’eau corporelle totale, le D₂O initial et le D₂O final sont les concentrations mesurées en ppm dans les échantillons post-injection D₂O.

Résultats

La technique de dilution de l’oxyde de deutérium peut être utilisée pour évaluer la composition corporelle d’une variété d’espèces. Pour démontrer l’adaptabilité, nous rapportons la première utilisation de la technique de dilution d’oxyde de deutérium dans une espèce de chauve-souris insectivore nord-américaine, Eptesicus fuscus, la grande chauve-souris brune pour des résultats représentatifs. Un plateau de chronométrage a été complété en pré- et ap...

Discussion

L’utilisation de l’oxyde de deutérium pour déterminer TBW a été utilisé depuis les années 1940¹⁷ et est utilisé chez l’homme et une variété d’espèces domestiques et sauvages^4,6,7. D’autres techniques non destructives ont été développées, y compris l’analyse d’impédance bioélectrique (BIA), DXA, et la résonance magnétique quantitative (QMR). Chaque méthode présente des ava...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 micron non-pyrogenic disk filter	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile
1.5 mL conical microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-9701	1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap
10 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	clear, sterile glass injection unit
10 mL syringe	Becton Dickinson	305219	sterile 10 mL syringe individually wrapped
100 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	clear, sterile glass injection unit
20 gauge needle	Exel	26417	needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel
22 gauge needle	Exel	26411	needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel
deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-25G	99.9 atom % D
isofluorane	Vetone	3060	fluriso isoflurane, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR standard software
petroleum jelly	Vaseline	305212311006	Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant
plastic capillary tubes	Innovative Med Tech	100050	sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length
Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell	International Crystal Laboratory	0005D-875	0.05 mm Pathlength
sodium chloride	EMD Millipore	1.37017	suitable for biopharmaceutical production
Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer	ThermoFisher Scientific	269-169400	discontinued model, newer models available