Usando óxido de utério como ferramenta não invasiva e não letal para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos

Resumo

Este artigo descreve a técnica de diluição de óxido de deutério em dois mamíferos, um insetívoro e carnívoro, para determinar a água total do corpo, a massa corporal magra, a massa de gordura corporal e o consumo de água.

Resumo

Sistemas de pontuação de condições corporais e índices de condição corporal são técnicas comuns utilizadas para avaliar o estado de saúde ou aptidão de uma espécie. Os sistemas de pontuação de condições corporais são dependentes e têm potencial para serem altamente subjetivos. Os índices de condição corporal podem ser confundidos com forrageamento, os efeitos do peso corporal, bem como problemas estatísticos e inferenciais. Uma alternativa aos sistemas de pontuação de condição corporal e índices de condição corporal é usar um isótopo estável, como óxido de deutério para determinar a composição corporal. O método de diluição de óxido de deutério é uma técnica quantitativa repetível usada para estimar a composição corporal em humanos, vida selvagem e espécies domésticas. Além disso, a técnica de diluição de óxido de deutério pode ser usada para determinar o consumo de água de um animal individual. Aqui, descrevemos a adaptação da técnica de diluição de óxido de deutério para avaliação da composição corporal em morcegos marrons grandes (Eptesicus fuscus) e para avaliar o consumo de água em gatos (Felis catis).

Introdução

Sistemas de pontuação de condições corporais e índices de condição corporal são técnicas comuns utilizadas para avaliar o estado de saúde ou aptidão de uma espécie^1,2. Muitas espécies domésticas e zoológicas possuem sistemas únicos de pontuação de condição corporal (BCS) que são usados para avaliar o tecido gorduroso muscular e superficial de um animal³. No entanto, a avaliação do BCS depende do avaliador — o que significa que o BCS é uma medida objetiva ou semiquantitativa quando avaliada por um avaliador treinado. Em espécies de animais selvagens, os índices de condição corporal são comumente usados em vez de BCS e são baseados em uma proporção de massa corporal ao tamanho do corpo ou massa corporal ao antebraço². Os índices de condição corporal são muitas vezes confundidos com os efeitos da forrageamento e podem ser confundidos pelo tamanho do corpo, bem como problemas estatísticos e inferenciais⁴.

Uma alternativa aos sistemas de pontuação de condições corporais e índices de condição corporal é usar um isótopo estável para determinar a composição corporal. Um isótopo estável comumente usado é o óxido de deutério (D₂O), uma forma não radioativa de água na qual os átomos de hidrogênio são isótopos de deutério. O método de diluição de óxido de deutério descrito neste estudo pode ser uma técnica não subjetiva, quantitativa e repetitiva usada para estimar a composição corporal em humanos⁵ e uma ampla gama de espécies^4,6,7. Essa técnica pode ser vantajosa para estudar a composição corporal na vida selvagem. Por exemplo, pode ser usado para avaliar mudanças longitudinalnais na composição corporal, como antes e depois de uma ação de gestão. No entanto, em algumas espécies de animais selvagens o óxido de deutério pode superestimar o teor real de água⁸. Portanto, ao adaptar a técnica para uma espécie, é importante validar o método comparando o método de óxido de deutério à análise de carcaças para espécies não ameaçadas de extinção. Para espécies ameaçadas e ameaçadas, um método não destrutivo, como a absorção de raios-X duplo (DXA), deve ser considerado como um método alternativo de comparação ao método destrutivo padrão-ouro da análise completa da carcaça.

Além da composição corporal, a técnica d₂O de diluição pode ser usada para determinar o consumo de água de um animal individual⁹. Essa aplicação única de D₂O pode ser usada para responder não apenas perguntas de pesquisa, mas pode ser útil para avaliar o consumo de água de animais individuais abrigados em grandes ambientes sociais.

Aqui, descrevemos a adaptação da técnica de diluição D₂O para avaliar a composição corporal em um insetoivore, grandesmorcegos marrons ( Eptesicus fuscus), e para avaliar o consumo de água em um carnívoro, gatos (Felis catis).

Protocolo

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Missouri e conduzidos a permissão de coleta científica do Departamento de Conservação da Vida Selvagem (MDC) do Missouri (Permit #16409 e #17649).

1. Preparação da solução de estoque estéril, isotônica, salinada D₂O

1. Faça uma solução de estoque de 50 mL de 9,0 g/L salinado D₂O.
   1. Pesar 450 mg de NaCl de grau farmacêutico e transferir toda a NaCl para um béquer esterilizado de 100 mL. Registre a quantidade exata de NaCl para 4 lugares decimais no caderno de laboratório.
   2. Utilizando um cilindro graduado estéril, meça 50 g de ≥ 99,8% de óxido de deutério e transfira para o béquer estéril contendo o NaCl. Registre a quantidade exata de óxido de deutério para 4 lugares decimais no caderno ou planilha do laboratório.
   3. Filtrar 10 mL de força isosmótica NaCl (9,0 g/L) através de um filtro de disco estéril não pirogênico com poros submicron (0,2 μm).
   4. Conecte uma agulha de 20 G ao filtro de disco estéril não pirogênico com poros submicron (0,2 μm) equipados com um barril de seringa de 10 mL. Insira no septo de um frasco vazio estéril de 100 mL.
   5. Conecte um tubo de vácuo a uma agulha de 22 G e insira a agulha no septo do frasco vazio estéril de 100 mL.
   6. Despeje 10 mL da solução de estoque no barril de seringa. Ligue lentamente o vácuo até que a solução de estoque D₂O comece a filtrar lentamente o frasco estéril. Continue a derramar a solução de estoque D₂O no barril de seringa até que todos os 50 mL sejam filtrados.
      NOTA: A solução de estoque pode precisar ser diluída ou concentrada dependendo da dose necessária. A dose de D₂O variará com base na espécie e na sensibilidade do método analítico. Para gatos, a solução de trabalho foi usada para administrar uma dose de 0,7 g/kg D₂O. A solução de estoque descrita acima minimiza a quantidade de solução NaCl introduzida subcutâneamente ao animal, ao mesmo tempo em que permite medição precisa da dose. Para pequenos mamíferos, como morcegos, essa concentração deve ser diluída a uma solução de trabalho como 0,1600 g/mL. Esta concentração permite que a dose de 0,75 g/kg D₂O seja medida com precisão e administrada em aproximadamente 100 μL ou menos solução NaCl.

2. Preparação de solução de trabalho de ações d₂O estéril, isotônica e salinada para morcegos

1. Pesar um frasco estéril vazio de 10 mL e registrar peso para 4 lugares decimais mais próximos. Escala de tare.
2. Use uma seringa de 1,0 mL para transferir 0,65 mL da solução de estoque D₂O para o frasco estéril vazio de 10 mL. Peso recorde de D₂O a 4 lugares decimais. Escala de tare.
3. Calcule o volume de D₂O no frasco vazio de 10 mL. Use a seguinte equação.
   
   onde W é registrado peso e D é a densidade de 99,8% D₂O (1.107 g/mL).
4. Use o volume calculado e o peso conhecido do D₂O para determinar o volume de sorolo isotônico necessário para fazer ~0,1600 g/mL solução de trabalho.
5. Insira no septo do frasco estéril de 10 mL, a agulha de 22 G (anexada ao tubo de vácuo). Insira no septo do frasco estéril de 10 mL, a agulha de 20 G (anexada a um filtro de seringa de 0,22 μm equipado com um barril de seringa de 10 mL).
6. Despeje a massa/volume calculado de NaCl isotônico no barril de seringa e ligue o vácuo para permitir um gotejamento lento no frasco estéril de 10 mL.
7. Registre o peso do frasco e garanta que seja criada uma solução de trabalho de ~0,1600 g/mL.

3. Determinação da composição corporal de morcegos marrons grandes (Eptesicus fucsus) com D₂O

NOTA: A solução de estoque de D₂O utilizada no protocolo é de 0,1598 g/mL. Antes de coletar sangue, certifique-se de que a remoção de até 200 μL de sangue será ≤ 10% do volume sanguíneo total do morcego e está dentro das diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais (IACUC) para a coleta de sangue. Todos os animais devem ser presos ou abdômen empalideceu para garantir um estômago vazio. Uma refeição recente poderia alterar o peso do animal resultando em resultados confusos, uma vez que os cálculos para determinar a gordura corporal dependem da massa corporal do animal.

1. Anestesiar um grande morcego marrom.
   1. Use 5,0% de isoflurano para indução. Mantenha um plano estável de anestesia utilizando 0,5%-3,0% isoflurane.
   2. Determine a profundidade adequada da anestesia testando o reflexo da retirada do pedal (beliscando os dedos dos dedos do morcego). O morcego não deve responder à sensação e a taxa respiratória deve permanecer lenta e estável. Ajuste isoflurano conforme necessário para manter um plano estável de anestesia.
   3. Nível de isoflurano recorde, frequência cardíaca, frequência respiratória e outras informações conforme exigido pela IACUC.
2. Pesar o grande morcego marrom e registrar o peso para 4 lugares decimais.
3. Limpe o uropatagium (membrana traseira) sobre a veia interfmoral com uma almofada de preparação de álcool e deixe secar. Aplique uma fina camada de geleia de petróleo sobre a veia interfmoral.
4. Use uma agulha de 29 G para perfurar a porção dorsal da veia interfmoral e coletar 100 μL de sangue usando tubos capilares de heparina de sódio plástico. Certifique-se de misturar o sangue inteiro com a heparina de sódio, rolando suavemente cada tubo após a coleta e rotular o tubo.
5. Usando uma máquina DXA calibrada para pequenos mamíferos, obtenha três varreduras DXA do morcego¹⁰.
6. Determine a massa (em g) de D₂O para injetar multiplicando o peso do morcego em kg pela dose D₂O de 0,75 g/kg. Determine o volume da dose calculada D₂O (V) dividindo o peso da dose D₂O pela concentração da solução de trabalho.
   
   
7. Use uma seringa de insulina com uma agulha de 29 G presa para elaborar o volume de D₂O calculado. Pesar o D₂O, seringa de insulina e agulha. Registre para 4 lugares decimais.
8. Injete o D₂O subcutâneamente sobre a região do quadril dorsal do morcego anestesiado.
9. Permita que o morcego se recupere da anestesia e registre o tempo de injeção.
10. Imediatamente após a injeção, pesar a seringa de insulina agora vazia com a agulha de 29 G presa. Registre o peso para 4 lugares decimais.
11. Determine a dose de D₂O injetada subtraindo o peso pós-injeção da seringa de insulina da seringa de insulina D₂O de pré-injeção. Registre para 4 lugares decimais.
12. Dentro de 30 minutos após a coleta de sangue, use uma centrífuga hematocrita para girar cada tubo capilar por 5 minutos. Se a centrífuga hematocrita permitir múltiplas velocidades, definidas para 10.000 x g.
13. Use uma tesoura afiada para cortar o tubo capilar plástico entre todo o sangue e o plasma. Use uma pipeta de 200 μL para expelir o plasma diretamente em um tubo de armazenamento rotulado de 500 μL.
14. Após o período de equilíbrio, colete mais 100 μL de sangue da veia interfmoral.
    NOTA: O período de equilíbrio variará de acordo com as espécies e se os morcegos entrarem no torpor. Para morcegos marrons grandes, normalmente 2 h é suficiente para o período de equilíbrio.
15. Separe o plasma em um segundo rotulado, tubo superior do parafuso de microcentrífuga de 500 μL repetindo a etapa 3.13. Guarde amostras a -20 °C ou mais frias até a análise.

4. Análise de espectrofotometria infravermelha de transformação de fourier

1. Defina a temperatura de um banho de areia a 60 °C para facilitar a destilação (permitir a separação da água e D₂O de outros componentes sanguíneos).
2. Pipette 50 μL de cada amostra de plasma e padrão no interior de uma tampa de tubo de microcentrífuga cônica de 1,5 mL. Incluindo padrões contendo concentrações conhecidas de D₂O como controle de qualidade.
   NOTA: Idealmente cada animal terá três réplicas por amostra e a média das três réplicas relatadas. Devido ao volume amostral limitado e ao volume de amostra necessário para o equipamento FT-IR utilizado pelos autores, não foram realizadas réplicas para as amostras de morcegos. Se alguma amostra contiver menos de 50 μL de plasma, pipeta a quantidade de amostra na tampa do tubo de microcentrífuga cônica e registre o volume.
3. Mantenha a tampa de microcentrífuga de cabeça para baixo e aparafusar o tubo de microcentrífuga cônica de 1,5 mL na tampa. Coloque o tubo invertido (de cabeça para baixo) com a tampa em contato com a areia no banho de areia por um mínimo de 12 h (durante a noite).
4. Após 12 h, retire a tampa e substitua por uma nova tampa limpa. Pulse o tubo de microcentrífuga por 10 s em uma centrífuga.
5. Crie os seguintes padrões: 0 ppm (0 mg D₂O em 1 L água destilada), 293 ppm (293 mg D₂O em 1 L água destilada), 585 ppm (585 mgD₂O em 1 L água destilada), 878 ppm (878 mg D₂O em 1 L água destilada) e 1170 ppm D₂O (1170 mg D₂O em 1 L água destilada).
   NOTA: Os valores acima são sugeridos para uma curva padrão. Valores alternativos como 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, e assim por diante podem ser utilizados.
6. Instale uma célula de transmissão líquida no espectrômetro infravermelho de transformação infravermelha (FTIR)(Tabela de Materiais). Encha a célula com metanol e conecte a porta de injeção. Lentamente encha a célula com água de fundo enquanto remove cuidadosamente a seringa de metanol para reduzir o risco de bolhas de ar. Anexar tubos à porta de saída para permitir a remoção das amostras após a análise.
7. Prepare o software de espectrômetro FTIR (Tabela de Materiais) para análise de D₂O na água. As configurações do parâmetro para o software espectrômetro utilizado neste protocolo estão listadas na Tabela 1.
8. Colete uma amostra de fundo usando a água diluente, filtrada de 0,22 μm, destilada. Esta deve ser a mesma água usada para os padrões.
9. Injete 40 μL do 0 ppm D₂O e grave o espectro. Salve o espectro como um arquivo de valores separados (CSV) de comma.
10. Continue injetando e salvar o espectro de todos os padrões para criar uma curva padrão.
11. Repita o fundo e a curva padrão a cada 60-90 min.
12. Injete 40 μL de cada amostra destilada na célula de transmissão líquida e salve o espectro.
    NOTA: Altere o volume de injeção das normas e as amostras destiladas com base no volume da célula de transmissão líquida. Use uma célula de transmissão líquida de volume menor se o volume de amostra estiver abaixo de 40 μL ou diluir 1:1 com água destilada de fundo.
13. Determine a concentração de D₂O de cada amostra do espectro FTIR usando um programa de planilha como descrito por Jennings et al.¹¹ ou o software espectral. Quando as réplicas são realizadas, use a concentração média para calcular a composição corporal.

5. Cálculo da composição corporal

1. Converta o enriquecimento de deutério (ppm) em concentração de átomo para cada amostra usando a seguinte equação¹²:
   
   onde x é o enriquecimento de deuterium medido (ppm) da amostra e 0,0001557 é a fração mole do deutério relatada em Viena Standard Mean Ocean Water (VSMOW)¹³.
2. Calcule a água total do corpo para cada amostra usando a seguinte equação^4,12,14:
   )
   onde e é o enriquecimento medido (átomo%) de deutério na amostra após correção de fundo, B é a massa de injeção em g, e 0,998 é a concentração de D₂O injetado.
   NOTA: A troca de deutério com hidrogênio labile causa uma superestimação de 2% da massa total de água corporal. A água total do corpo deve ser corrigida reduzindo a estimativa total de massa de água corporal em 2% do peso corporal.
3. Estimar a massa sem gordura (massa magra do corpo e todos os outros componentes não gordos) de cada morcego usando a seguinte equação:
   
   NOTA: Use o valor convencionalmente aceito de 0,732 para o teor de umidade fracionada da massa corporal magra para morcegos saudáveis, euhidratados, não lactantes. O teor de umidade fracionada de massa sem gordura pode mudar na lactação de grandes marrons com base na semana pós-parto¹⁵. Para outras espécies, use os valores publicados na literatura ou determine o teor de umidade fracionada da massa corporal magra antes de realizar cálculos da massa corporal magra.
4. Esquete a massa de gordura corporal usando a seguinte equação:
   
5. Converta a massa de gordura corporal em g para por cento de massa de gordura corporal usando a seguinte equação:
   

6. Determinação da composição da água em um carnívoro (Felis catus, gato doméstico)

1. Prepare a solução de estoque como descrito na seção 1.
2. Pesar cada gato para os 3 lugares decimais mais próximos e registrar peso. Calcule a dose de cada gato conforme descrito na etapa 3.6 usando uma dose D₂O de 0,70 g/kg.
3. Prepare cada dose conforme descrito nos passos 3.7-3.8. usando uma seringa de 3 mL ou 5 mL com uma agulha de 22 G em vez de uma seringa de insulina.
4. Colete 500 μL de sangue inteiro e, posteriormente, administre subcutâneamente os tubos de parafuso de 0,7 g/kg D₂O. Centrífuga saem de 2.000 x g por 15 min e armazene plasma em tubos de parafuso de microcentrífuga de 1,5 mL a -20°C até a análise.
5. Colete 500 μL de sangue inteiro 4 h após a injeção. Centrífuga de sangue inteiro a 2.000 x g por 15 min e armazenar plasma em tubos superiores de microcentrífugade de 1,5 mL a -20 °C até a análise.
6. Colete 500 μL de sangue inteiro 14 dias após a injeção. Centrífuga de sangue inteiro a 2.000 x g por 15 min e armazenar plasma em tubos superiores de microcentrífugade de 1,5 mL a -20 °C até a análise.
   NOTA: O número de dias entre a coleta de sangue pode ser baseado nas necessidades experimentais e no período pós-injeção em que o D₂O pode ser detectado acima dos níveis de fundo. Quatorze dias foi a duração dos blocos de tratamento dietético de Hooper et al.⁹.
7. Realizar análises ft-ir de acordo com a seção 4 e calcular a composição corporal de acordo com a seção 5 deste protocolo.
8. Calcule o consumo de água em mL/dia usando as seguintes equações:
   
   
   
   onde a TBW é água corporal total, D₂O inicial e D₂O final são as concentrações medidas em ppm nas amostras D₂O pós-injeção.

Resultados

A técnica de diluição de óxido de deutério pode ser usada para avaliar a composição corporal de uma variedade de espécies. Para demonstrar a adaptabilidade, estamos relatando o primeiro uso da técnica de diluição de óxido de deutério em uma espécie de morcego insetívoro norte-americano, Eptesicus fuscus,o grande morcego marrom para resultados representativos. Um platô de cronometragem foi concluído tomando amostras de sangue de injeção pré e pós-D₂...

Discussão

O uso de óxido de deutério para determinar a TBW tem sido usado desde a década de 1940^e é usado em humanos e uma variedade de espécies domésticas e da vida selvagem^4,6,7. Outras técnicas não destrutivas foram desenvolvidas, incluindo análise de impedância bioelétrica (BIA), DXA e ressonância magnética quantitativa (RQ). Cada método tem vantagens e desvantagens que devem ser consideradas ante...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 micron non-pyrogenic disk filter	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile
1.5 mL conical microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-9701	1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap
10 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	clear, sterile glass injection unit
10 mL syringe	Becton Dickinson	305219	sterile 10 mL syringe individually wrapped
100 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	clear, sterile glass injection unit
20 gauge needle	Exel	26417	needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel
22 gauge needle	Exel	26411	needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel
deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-25G	99.9 atom % D
isofluorane	Vetone	3060	fluriso isoflurane, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR standard software
petroleum jelly	Vaseline	305212311006	Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant
plastic capillary tubes	Innovative Med Tech	100050	sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length
Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell	International Crystal Laboratory	0005D-875	0.05 mm Pathlength
sodium chloride	EMD Millipore	1.37017	suitable for biopharmaceutical production
Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer	ThermoFisher Scientific	269-169400	discontinued model, newer models available