포유류의 체성분과 물 소비를 평가하기 위한 비침습적이고 비치명적인 도구로 중수소 산화물을 사용

요약

이 기사에서는 두 포유류의 중수소 산화물 희석 기술, 곤충 및 육식 동물에 대해 설명하여 총 체수, 순수 체질량, 체지방 질량 및 물 소비를 결정합니다.

초록

신체 상태 점수 매기기 시스템 및 신체 상태 지수는 종의 건강 상태 또는 적합성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 신체 상태 채점 시스템은 평가자 에 의존하며 주관적 일 가능성이 있습니다. 신체 상태 지수는 통계 및 추론 문제뿐만 아니라 체중의 효과, 위조에 의해 혼동 될 수 있습니다. 신체 상태 점수 매기기 시스템 및 신체 상태 지수에 대한 대안은 중수소 산화물과 같은 안정적인 동위원소를 사용하여 체성분을 결정하는 것입니다. 중수소 산화물 희석 방법은 인간, 야생 동물 및 국내 종의 체성분을 추정하는 데 사용되는 반복적이고 정량적인 기술입니다. 부가적으로, 중수소 산화물 희석 기술은 개별 동물의 물 소비를 결정하는데 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 큰 갈색 박쥐(Eptesicus fuscus)에서체성분을 평가하고 고양이의 물 소비를 평가하기위한 중수소 산화물 희석 기술의 적응을 설명합니다(펠리스 카티스).

서문

신체 상태 점수 매기기 시스템 및 신체 상태 지수는 종^1,2의건강 상태 또는 체력을 평가하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 많은 국내 및 동물학 종은 동물의 근육과 표면 지방 조직을 평가하는 데 사용되는 독특한 신체 상태 점수 (BCS) 시스템을 가지고^3. 그러나 BCS 평가는 평가자(BCS가 숙련된 평가자가 평가할 때 객관적 또는 반정량적 측정임을 의미)에 의존합니다. 야생 동물 종에서, 바디 상태 지수는 BCS 보다는 오히려 일반적으로 이용되고 바디 질량에 바디 질량 또는 팔뚝에 바디 질량의 비율에 근거를 두는^2. 신체 상태 인디시스는 종종 위조의 효과에 의해 혼동하고 통계 및 추론 문제뿐만 아니라 신체 크기에 의해 혼동 될 수있다⁴.

신체 상태 점수 매기기 시스템 및 신체 상태 지수에 대한 대안은 안정된 동위원소를 사용하여 신체 구성을 결정하는 것입니다. 일반적으로 사용되는 안정동위원소 중 하나는 수소원자가 중수소 동위원소인 비방사성 형태의 물인 중수소 산화물(D2 O)입니다. 본 연구에서 기술된 중수소 산화물 희석 방법은 인간⁵ 및 다양한 종^4,6,7에서체성분을 추정하는 데 사용되는 비주관적, 정량적 및 반복가능한 기술일 수 있다. 이 기술은 야생 동물의 신체 구성을 연구하는 데 유리할 수 있습니다. 예를 들어, 관리 작업 전후와 같은 신체 구성의 세로 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 일부 야생 동물 종 중수소 산화물은 실제 수분 함량을 과대 평가할 수 있다^8. 따라서, 종에 대한 기술을 적응할 때, 중수소 산화물 방법을 비멸종종에 대한 시체 분석과 비교하여 그 방법을 검증하는 것이 중요하다. 멸종 위기에 처한 종의 경우 이중 X선 흡수법(DXA)과 같은 비파괴 적 방법을 완전한 시체 분석의 금 표준 파괴 방법에 대한 대체 비교 방법으로 간주해야 합니다.

체 조성 이외에,_D2O 희석 기술은 개별 동물의 물 소비를 결정하는 데 사용될 수^{있다 9.} D2 O의이 독특한 응용 프로그램은 연구 질문에 답하는 데 사용할 수 있지만, 큰 사회적 환경에서 보관된 개별 동물의 물 소비를 평가하는 데 유용할 수 있습니다.

여기서, 곤충, 큰 갈색박쥐(Eptesicus fuscus)에서체성분을 평가하고, 육식동물,고양이(Felis catis)에서물 소비를 평가하기 위한_D2O 희석 기술의 적응을 설명한다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 실험은 미주리 대학교 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 미주리 주 보호부(MDC) 야생 동물 과학 수집 허가(허가 #16409 및 #17649)에 따라 수행되었습니다.

1. 멸균, 동위 원소, 살균 D₂O 스톡 솔루션의 준비

1. 9.0 g/L의 50 mL 스톡 솔루션을 Salinated_D2O로 만듭니다.
   1. 450 mg의 제약 등급 NaCl을 측정하고 모든 NaCl을 100 mL, 멸균 된 비커로 옮니다. 실험실 노트북에서 NaCl의 정확한 양을 소수점 4자리까지 기록합니다.
   2. 멸균 석판 실린더를 사용하여, ≥99.8% 중수소 산화물의 50 g을 측정하고 NaCl을 함유하는 멸균 비커로 옮긴다. 실험실 노트북 또는 스프레드시트에서 소수점 이하 4자리까지 의 중수소 산화물의 정확한 양을 기록합니다.
   3. 서브미크론 기공 (0.2 μm)을 가진 비 발열 성 멸균 디스크 필터를 통해 이등변 강도 NaCl (9.0 g / L)의 10 mL을 필터링합니다.
   4. 10 mL 주사기 배럴이 장착 된 서브 미크론 기공 (0.2 μm)이있는 비 발열 식 멸균 디스크 필터에 20G 바늘을 부착하십시오. 100 mL 멸균 빈 바이알의 중격에 삽입하십시오.
   5. 진공관을 22 G 바늘에 부착하고 바늘을 100 mL 멸균 빈 바이알의 중격에 삽입합니다.
   6. 스톡 용액 10 mL을 주사기 통에 붓습니다. _D2O 스톡 용액이 멸균 바이알로 천천히 걸기 시작할 때까지 진공을 천천히 켭니다. 모든 50 mL이 여과 될 때까지_D2O 스톡 용액을 주사기 배럴에 계속 붓습니다.
      참고: 스톡 용액은 필요한 용량에 따라 희석하거나 농축해야 할 수 있습니다. _D2O의 투여량은 분석 방법의 종 및 민감도에 따라 달라질 것이다. 고양이의 경우, 작업 용액은 0.7 g / kg_D2O의 용량을 투여하는 데 사용되었습니다. 위에서 설명한 스톡 솔루션은 동물에게 피하적으로 도입된 NaCl 용액의 양을 최소화하면서도 정확한 투여량을 측정할 수 있습니다. 박쥐와 같은 작은 포유동물의 경우 이 농도는 0.1600 g/mL와 같은 작동 용액으로 희석되어야 합니다. 이 농도는 0.75 g/kg_D2O의 투여량을 약 100 μL 이하의 NaCl 용액에서 정확하게 측정및 투여할 수 있게 한다.

2. 박쥐를위한 멸균, 동위 원소, 살균 D₂O 재고 작업 솔루션의 준비

1. 10 mL의 빈 멸균 바이알의 무게와 가장 가까운 4 소수점 장소에 무게를 기록합니다. 타레 스케일.
2. 1.0 mL 주사기를 사용하여_D2O 스톡 용액의 0.65 mL를 타르, 10 mL 빈 멸균 바이알로 이송한다. D₂O에서 4 자리 수의 가중치를 기록합니다. 타레 스케일.
3. 10 mL 빈 바이알에서_D2O의 부피를 계산합니다. 다음 방정식을 사용합니다.
   
   W가 중량을 기록하고 D는 99.8% D₂O(1.107 g/mL)의 밀도입니다.
4. _D2O의 계산된 부피와 알려진 중량을 사용하여 ~ 0.1600 g/mL 작동 용액을 만드는 데 필요한 동위 원소 식염수의 부피를 결정합니다.
5. 10 mL 멸균 바이알의 중격에 삽입, 22 G 바늘 (진공 튜브에 부착). 10 mL 멸균 바이알의 중격에 삽입, 20G 바늘 (10 mL 주사기 배럴장착 0.22 μm 주사기 필터에 부착).
6. 계산된 동위 원소 NaCl의 질량/부피를 주사기 통에 붓고 진공을 켜서 멸균 된 10 mL 바이알에 천천히 물방울을 허용합니다.
7. 바이알의 무게를 기록하고 ~ 0.1600 g / mL 작업 솔루션이 생성되었는지 확인하십시오.

3. D₂O로 큰 갈색 박쥐(에프테시쿠스 fucsus)의체성분 의 결정

참고 : 프로토콜에 사용되는_D2O의 재고 솔루션은 0.1598 g / mL입니다. 혈액을 수집하기 전에, 혈액의 최대 200 μL을 제거하는 것은 박쥐의 총 혈액 량의 ≤ 10 %가 될 것이며 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 혈액 수집을위한 지침을 수립한 내에 있는지 확인하십시오. 모든 동물은 공복을 보장하기 위해 금식하거나 복부를 촉지해야합니다. 최근 식사는 동물의 체지방을 결정하는 계산이 동물의 체질량에 의존하기 때문에 동물의 체중을 변화시킬 수 있습니다.

1. 큰 갈색 박쥐를 마취.
   1. 유도를 위해 5.0 % 이소플루란을 사용하십시오. 0.5%-3.0% 이소플루란을 사용하여 마취의 안정된 평면을 유지하십시오.
   2. 페달 철수 반사 (박쥐의 발가락을 꼬집어)를 테스트하여 적절한 마취 깊이를 결정합니다. 박쥐는 감각에 반응하지 않아야하며 호흡속도는 느리고 안정적으로 유지되어야합니다. 마취의 안정적인 평면을 유지하기 위해 필요에 따라 이소플루란을 조정합니다.
   3. IACUC에서 요구하는 기록 이소플루란 수준, 심박수, 호흡률 및 기타 정보를 기록합니다.
2. 큰 갈색 박쥐의 무게와 4 소수 자릿수에 무게를 기록합니다.
3. 알코올 준비 패드로 계우로 파파타늄 (꼬리 막)을 간 정맥위에 청소하고 건조시키십시오. 페도랄 정맥 에 석유 젤리의 얇은 층을 적용합니다.
4. 29 G 바늘을 사용하여 페도럴 정맥의 등쪽 부분을 뚫고 플라스틱 헤파린 모세 혈관을 사용하여 100 μL의 혈액을 수집합니다. 수집 후 각 튜브를 부드럽게 압연하여 전혈과 헤파린의 적절한 혼합을 확인하고 튜브에 라벨을 붙입니다.
5. 작은 포유류를 위해 보정 된 DXA 기계를 사용하여 박쥐^10의3 개의 DXA 스캔을 얻습니다.
6. 박쥐 무게를 kg에 0.75 g/kg의_D2O 용량으로 곱하여 주입하는_D2O의 질량(g)을 결정합니다. 계산된_{D2 O}투여량(V)의 부피를_D2O 투여량의 무게를 작업 용액의 농도로 나누어 결정한다.
   
   
7. _D2O계산된 부피를 끌어들이기 위해 29G 바늘이 부착된 인슐린 주사기를 사용한다. D₂O, 인슐린 주사기 및 바늘을 계량합니다. 소수점 4자리로 기록합니다.
8. D2O를 마취된 박쥐의 등쪽 엉덩이 부위에 피하주사한다.
9. 박쥐가 마취에서 회복하고 주사 시간을 기록 할 수 있습니다.
10. 주입 직후, 29 G 바늘이 부착된 지금 빈 인슐린 주사기를 무게. 소수점 4자리까지 가중치를 기록합니다.
11. 주입 전_{D2 O}충전 된 인슐린 주사기로부터 인슐린 주사기의 주입 후 중량을 빼서 주입 된_D2O의 용량을 결정합니다. 소수점 4자리로 기록합니다.
12. 혈액 수집 후 30분 이내에 헤마토크릿 원심분리기를 사용하여 각 모세관을 5분 동안 회전시면 됩니다. 헤마토크릿 원심분리기가 여러 속도를 허용하는 경우, 10,000 x g로설정합니다.
13. 날카로운 가위를 사용하여 전혈과 혈장 사이에 플라스틱 모세관을 절단하십시오. 200 μL 파이펫을 사용하여 플라즈마를 라벨이 부착된 500 μL 저장 튜브로 직접 배출합니다.
14. 평형 기간 후, 여과 정맥에서 또 다른 100 μL의 혈액을 수집합니다.
    참고: 평형 기간은 종에 따라 달라지며 박쥐가 토퍼로 들어가는 경우 다릅니다. 큰 갈색 박쥐의 경우, 일반적으로 2 h는 평형 기간에 충분합니다.
15. 플라즈마를 3.13단계를 반복하여 제2 라벨, 500 μL 마이크로원심분리기 스크류 상단 튜브로 분리한다. 시료를 분석할 때까지 -20°C 또는 더 추운 온도에서 보관하십시오.

4. 푸리에 변환 적외선 분광광도 분석

1. 증류를 용이하게 하기 위해 모래 목욕의 온도를 60°C로 설정합니다(다른 혈액 성분에서 물과_D2O를분리할 수 있음).
2. 각 플라즈마 샘플의 피펫 50 μL 및 표준1.5 mL 원점 미세 원심 분리튜브 캡의 내부에 표준. 품질 관리로_D2O의 알려진 농도를 포함하는 표준을 포함.
   참고: 각 동물은 샘플당 3개의 복제본을 가지며 보고된 3개의 복제본의 평균을 가지게 됩니다. 저자가 사용하는 FT-IR 장비에 필요한 제한된 샘플 부피와 샘플 의 부피로 인해 박쥐 샘플에 대한 복제가 수행되지 않았습니다. 어떤 견본이 플라즈마의 50 μL 미만을 포함하는 경우에, 원엽 미세 원심 분리튜브 캡에 견본 양을 파이펫하고 부피를 기록합니다.
3. 미세원심분리기 캡을 거꾸로 유지하고 1.5mL 원원원소 미세원원지 튜브를 캡에 끼십시오. 반역(거꾸로) 튜브를 모래 욕조에 모래와 접촉하여 최소 12시간(하룻밤)동안 놓습니다.
4. 12시간 후, 뚜껑을 제거하고 새 깨끗한 캡으로 교체하십시오. 원심 분리기에서 10초 동안 미세 원심 분리튜브를 펄스합니다.
5. 다음 표준 만들기: 0 ppm (0 mg D₂O 1 L 증류수), 293 ppm (293 mg D₂O 1 L 증류수), 585 ppm (585 mg D₂O in 1 L 증류수), 878 ppm (878 mg D₂O 1 L 증류수), 및 1170 ppm_D2O (1 L 증류수에서 1170 mg_D2O).
   참고: 위의 값은 표준 곡선에 대해 제안됩니다. 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm 등과 같은 대체 값을 사용할 수 있습니다.
6. 푸리에 형질전환 적외선 분광광도계(FTIR) 분광계(재료 표)에 액체 투과셀을설치합니다. 셀에 메탄올을 채우고 주입 포트를 연결합니다. 메탄올 주사기를 조심스럽게 제거하여 기포의 위험을 줄이면서 배경을 가진 물로 천천히 세포를 채웁니다. 튜브를 출력 포트에 부착하여 분석 후 샘플을 제거할 수 있습니다.
7. 물에서_D2O의 분석을 위해 FTIR 분광계 소프트웨어(재료 표)를준비하십시오. 이 프로토콜에 사용된 분광계 소프트웨어의 파라미터 설정은 표 1에나열되어 있습니다.
8. 희석제, 0.22 μm 여과, 증류수를 사용하여 배경 샘플을 수집합니다. 이 표준에 사용되는 것과 동일한 물이어야 합니다.
9. 0 ppm_D2O의 40 μL을 주입하고 스펙트럼을 기록합니다. 스펙트럼을 CSV(쉼표 분리된 값) 파일로 저장합니다.
10. 모든 표준의 스펙트럼을 계속 주입하고 저장하여 표준 곡선을 만듭니다.
11. 60-90분마다 배경 및 표준 곡선을 반복합니다.
12. 각 증류시료를 액체 투과 셀에 40 μL을 주입하고 스펙트럼을 저장합니다.
    참고: 액체 투과 셀의 부피에 따라 표준 및 증류시료의 주입 량을 변경합니다. 시료 부피가 40 μL 미만이거나 배경 증류수로 1:1 희석하는 경우 더 작은 부피의 액체 투과 셀을 사용하십시오.
13. Jennings et al.¹¹ 또는 스펙트럼 소프트웨어에 의해 설명된 바와 같이 스프레드시트 프로그램을 사용하여 FTIR 스펙트럼으로부터각 샘플의_D2O의 농도를 결정한다. 복제가 수행될 때 평균 농도를 사용하여 신체 구성을 계산합니다.

5. 체성분 계산

1. 다음 방정식^12를사용하여 중수소 농축(ppm)을 각 시료에 대한 원자 퍼센트 농도로 변환합니다.
   
   여기서 x는 시료의 측정된 중수소 농축(ppm)이고 0.0001557은 비엔나 표준 평균 해수(VSMOW)^13에서보고된 중수소의 두더지 분율이다.
2. 다음 방정식^4,12,14를사용하여 각 샘플에 대한 총 체수를 계산합니다.
   )
   여기서 E는 측정 된 농축 (원자 %) 배경 보정 후 시료에서 중수소의 B는 g의 주사 질량이고, 0.998은 주입된_D2O의 농도이다.
   참고: 중수소와 의연한 수소의 교환은 총 체수 질량의 2% 과대 평가를 일으킵니다. 총 체수 량은 체중의 2 %에 의해 총 체수 질량 추정을 감소시켜 수정되어야한다.
3. 다음 방정식을 사용하여 각 박쥐의 무지방 질량(마른 체질량 및 기타 모든 비지방 성분)을 추정합니다.
   
   참고: 건강에 좋은, 유수화, 비 수유 박쥐를 위해 순수 체질량의 분수 함량에 대해 0.732의 종래 허용 값을 사용합니다. 무지방 질량의 분수 수분 함량은 산후 주^15에기초하여 큰 갈색을 수유에 변화시킬 수 있다. 다른 종의 경우, 문헌에 게시 된 값을 사용하거나 마른 체질량의 계산을 수행하기 전에 마른 체질량의 분수 함량을 결정합니다.
4. 다음 방정식을 사용하여 체지방 질량을 추정합니다.
   
5. 다음 방정식을 사용 하 여 백분율 체 지방 질량g에서 체 지방 질량변환:
   

6. 육식 에서물 조성의 결정(펠리스 카투스,국산 고양이)

1. 섹션 1에 설명된 대로 재고 솔루션을 준비합니다.
2. 각 고양이를 가장 가까운 소수점 3자리로 측정하고 체중을 기록합니다. 0.70 g/kg의_D2O 용량을 사용하여 3.6 단계에서 설명한 대로 각 고양이의 복용량을 계산합니다.
3. 단계 3.7-3.8에 설명된 대로 각 복용량을 준비한다. 인슐린 주사기 대신 22 G 바늘로 3 mL 또는 5 mL 주사기를 사용.
4. 전혈 500 μL을 수집하고 후 피하 로 투여 0.7 g/ kg_{D2 O.}원심 분리전 에서 2,000 x g 에 15 분 및 저장 플라즈마 1.5 mL microcentrifuge 나사 상단 튜브 -20°C 분석 까지.
5. 500 μL의 전혈 4 시간 주사 후 를 수집합니다. 15 분 동안 2,000 x g에서 전혈을 원심 분리하고 1.5 mL 미세 원심 분리기 나사 상부 튜브에 혈장 -20 °C에서 분석 할 때까지 저장합니다.
6. 주사 후 14일 동안 전혈 500 μL을 모으자. 15 분 동안 2,000 x g에서 전혈을 원심 분리하고 1.5 mL 미세 원심 분리기 나사 상부 튜브에 혈장 -20 °C에서 분석 할 때까지 저장합니다.
   참고: 혈액 수집 사이의 일 수는 실험적 필요와_D2O가 배경 수준 이상으로 검출될 수 있는 사후 주입 기간에 근거할 수 있습니다. 14일은 후퍼 등에서 식이 치료 블록의^{길이였다. 9}.
7. 섹션 4에 따라 FT-IR 분석을 수행하고 이 프로토콜의 섹션 5에 따라 체성분을 계산합니다.
8. 다음 방정식을 사용하여 mL/일의 물 소비를 계산합니다.
   
   
   
   여기서 TBW는 총 체수, 초기_D2O 및 최종_D2O는 주사 후_D2O 샘플에서 ppm으로 측정된 농도이다.

결과

중수소 산화물 희석 기술은 다양한 종의 체성분을 평가하는데 사용될 수 있다. 적응성을 입증하기 위해, 우리는 북미 곤충 박쥐 종, Eptesicus fuscus,대표적인 결과를위한 큰 갈색 박쥐에서 중수소 산화물 희석 기술의 첫 번째 사용을보고하고 있습니다. 타이밍 고원은 평형 기간이 알려지지 않은 모든 종으로 수행해야하는 바와 같이 사전 및 사후 D₂O 주입 혈액 ?...

토론

TBW를 결정하기 위해 중수소 산화물의 사용은 1940년대^{부터 사용되어} 왔으며 인간 및 다양한 국내 및 야생 동물 종^4,6,7에사용되어 왔다. 생체 전기 임피던스 분석 (BIA), DXA 및 정량 자기 공명 (QMR)을 포함한 다른 비파괴 기술이 개발되었습니다. 각 방법에는 신체 구성을 평가하기위한 특정 방법론을 선택하기 전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 micron non-pyrogenic disk filter	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile
1.5 mL conical microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-9701	1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap
10 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	clear, sterile glass injection unit
10 mL syringe	Becton Dickinson	305219	sterile 10 mL syringe individually wrapped
100 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	clear, sterile glass injection unit
20 gauge needle	Exel	26417	needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel
22 gauge needle	Exel	26411	needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel
deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-25G	99.9 atom % D
isofluorane	Vetone	3060	fluriso isoflurane, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR standard software
petroleum jelly	Vaseline	305212311006	Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant
plastic capillary tubes	Innovative Med Tech	100050	sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length
Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell	International Crystal Laboratory	0005D-875	0.05 mm Pathlength
sodium chloride	EMD Millipore	1.37017	suitable for biopharmaceutical production
Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer	ThermoFisher Scientific	269-169400	discontinued model, newer models available