哺乳類の体組成と水消費量を評価するための非侵襲的で非致死的なツールとしての重水素酸化物の使用

要約

この記事では、全体水、赤身の体重、体脂肪量、および水の消費量を決定するために、昆虫と肉食動物の2つの哺乳類における重水素酸化物希釈技術について説明します。

要約

身体状態スコアリングシステムおよび身体状態指数は、種の健康状態または適合性を評価するために使用される一般的な技術である。身体状態スコアリングシステムは、評価者に依存し、非常に主観的である可能性を有する。身体状態指数は、採餌、体重の影響、統計的および没収的な問題によって混乱する可能性があります。体の状態スコアリングシステムと体の状態のインデックスの代替は、体組成を決定する重水素酸化物などの安定同位体を使用しています。重水素酸化物希釈法は、ヒト、野生生物、および国内種の体組成を推定するために使用される反復可能な定量的手法である。さらに、重水素酸化物希釈技術は、個々の動物の水消費量を決定するために使用することができる。ここでは、大きな褐色コウモリ(エプテシカス・フスカス)における体組成を評価し、猫の水消費量を評価するための重水素酸化物希釈技術の適応について説明する。

概要

身体状態スコアリングシステムおよび身体状態指数は、種^1、2の健康状態または適合性を評価するために使用される一般的な技術である。多くの国産および動物学の種は、動物の筋肉と表面性脂肪組織を評価するために使用されるユニークな体の状態スコアリング(BCS)システムを持っています³.ただし、BCS 評価は評価者に依存し、トレーニングを受けた評価者によって評価された場合、BCS は客観的または半定量的な測定になります。野生動物種では、身体状態指数はBCSではなく一般的に使用され、前腕²に対する体重と体の大きさまたは体重の比率に基づいています。身体状態のインディシスは、しばしば採餌の影響によって混乱し、体の大きさだけでなく、統計的および没収的な問題⁴によって混乱することができます。

体の状態スコアリングシステムと体の状態のインデックスの代替は、体組成を決定するために安定した同位体を使用しています。一般的に用いられる安定同位体は、水素原子が重水素同位体である非放射性水である重水素酸化物_(D2O)である。本研究で説明した重水素酸化物希釈法は、ヒト⁵および広範囲の種^4、6、7における体組成を推定するために用いられる非主観的、定量的、および反復可能な技術であり得る。この技術は、野生生物の体組成を研究するのに有利です。たとえば、管理アクションの前後など、体組成の縦方向の変化を評価するために使用できます。しかし、いくつかの野生生物種の重水素酸化物は、実際の水分含有量を過大評価することができます⁸.従って、種に対する技術を適応させる場合、非絶滅危惧種の重水素法とカーカス分析を比較して、その方法を検証することが重要である。絶滅危惧種や絶滅危惧種の場合、二重X線吸収測定(DXA)などの非破壊法は、完全な死体分析のゴールドスタンダード破壊法との代替比較方法として考慮されるべきである。

体組成に加えて_、D2O希釈技術は、個々の動物⁹の水消費量を決定するために使用することができる。この_D2Oのユニークな応用は、研究の質問に答えるだけでなく、大きな社会的な環境に収容されている個々の動物の水消費量を評価するのに役立ちます。

ここでは、昆虫、大きな茶色のコウモリ(エッテシカス・フスカス)、肉食動物、猫(フェリス・カティス)の水消費量を評価するための体組成を評価するための_D2O希釈技術の適応について説明します。

プロトコル

ここに記載されているすべての実験は、ミズーリ大学動物管理使用委員会によって承認され、ミズーリ州保全省(MDC)野生生物科学収集許可(許可#16409と#17649)の下で実施されました。

1. 滅菌、等張、食剤_D2Oストック溶液の調製

1. 9.0 g/Lの50 mLのストック溶液を作る D_{2 O.}
   1. 450 mgの医薬品グレードのNaClを計量し、すべてのNaClを100mLの殺菌ビーカーに移します。ラボノートにNaClの正確な量を小数点以下4桁に記録します。
   2. 無菌の段階的なシリンダーを使用して、99.8%以上の重水素酸化物の50gを測定し、NaClを含む無菌ビーカーに移します。実験室のノートまたはスプレッドシートで4の小数点以下の位置に重水素酸化物の正確な量を記録します。
   3. サブミクロン孔(0.2μm)を有する非発熱性滅菌ディスクフィルターを介して、イソスモティック強度NaCl(9.0 g/L)のフィルター10 mLをフィルターします。
   4. 10 mLシリンジバレルを取り付けたサブミクロンの細孔(0.2μm)を備えた非火性無菌ディスクフィルターに20G針を取り付けます。100 mLの無菌の空のバイアルの中隔に挿入します。
   5. 22 G針に真空管を取り付け、100 mLの無菌バイアルの中隔に針を差し込みます。
   6. 10 mLのストック溶液をシリンジ樽に注ぎます。D2 Oストック溶液がゆっくりと滅菌バイアルにろ過し始めるまで、真空をゆっくりとオンにします。50 mLがろ過されるまで_、D2Oストック溶液をシリンジバレルに注ぎ続けます。
      注:ストック溶液は、必要な用量に応じて希釈または濃縮する必要があります。_D2Oの用量は、分析方法の種および感度に基づいて変化する。猫の場合、働く溶液は、0.7 g/kg D₂Oの用量を投与するために使用された。上述のストック溶液は、用量の正確な測定を可能にしながら、動物に皮下に導入されるNaCl溶液の量を最小限に抑える。コウモリなどの小型哺乳類の場合、この濃度は0.1600g/mLなどの働く溶液に希釈する必要があります。この濃度により、0.75 g/kg_{D 2}O の用量を正確に測定し、約 100 μL 以下の NaCl 溶液で投与することができます。

2. 滅菌、等張性、コウモリ用の_D2Oストック用溶液の調製

1. 10 mLの空の生殖バイアルの重さ、および最も近い4の小数点以下の場所に重量を記録する。タレスケール。
2. 1.0 mLのシリンジを使用して_、D2Oストック溶液の0.65mLをタールした10mLの無菌バイアルに移します。D₂O から小数点以下 4 桁の重みを記録します。タレスケール。
3. 10 mL空のバイアルで_D2Oの体積を計算します。次の式を使用します。
   
   ここで、Wは重みを記録し、Dは 99.8% D₂O (1.107 g/mL) の密度です。
4. D₂Oの計算された体積と既知の重量を使用して、〜0.1600 g/mLの働き溶液を作るのに必要な等張生理液の体積を決定します。
5. 10 mLの滅菌バイアル、22G針(真空管に取り付けられた)の中隔に挿入します。10 mLの滅菌バイアルの中隔に挿入し、20G針(10mLシリンジバレルを取り付けた0.22μmの注射器フィルターに取り付けた)。
6. 計算された等張NaClの質量/体積をシリンジバレルに注ぎ、真空をオンにして無菌10mLバイアルにゆっくりと滴り落ちるようにします。
7. バイアルの重量を記録し、〜0.1600 g/mLの働く溶液が作成されていることを確認します。

3. 大きな茶色のコウモリ_(D2Oを持つエプテシカス・フツーカス)の体組成の決定

注: プロトコルで使用される D₂O のストックソリューションは 0.1598 g/mL です。血液を採取する前に、最大200μLの血液を除去することは、コウモリの全血液量の10%であり、血液採取のための制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が定めたガイドラインの範囲内であることを確認してください。すべての動物は空腹を確実にするために絶食または腹部を触診する必要があります。最近の食事は、体脂肪を決定するための計算が動物の体重に依存するので、混乱した結果をもたらす動物の体重を変更する可能性があります。

1. 大きな茶色のコウモリを麻酔する。
   1. 誘導には5.0%のイソファフルランを使用してください。0.5%-3.0%イソファフルランを使用して麻酔の安定した平面を維持します。
   2. ペダル離脱反射(バットのつま先をつまむ)をテストすることによって、適切な麻酔の深さを決定します。コウモリは感覚に反応すべきではなく、呼吸数はゆっくりと安定したままであるべきです。麻酔の安定した平面を維持するために必要に応じてイソファフルランを調整します。
   3. IACUCが要求するイソルランレベル、心拍数、呼吸数、その他の情報を記録する。
2. 大きな茶色のバットの重量を量り、小数点以下4位に重量を記録します。
3. アルコールの準備パッドでインターフェモラル静脈の上にウロパタギウム(尾膜)をきれいにし、乾燥させます。インターフェモラル静脈の上に石油ゼリーの薄い層を適用します。
4. 29G針を使用して、インターフェラール静脈の背部を穿刺し、プラスチック製のヘパリン毛管チューブを使用して100μLの血液を採取します。採取後に各チューブをそっと転がしてヘパリンナトリウムと全血を適切に混合し、チューブにラベルを付けます。
5. 小型哺乳類用に較正されたDXAマシンを使用して、コウモリ¹⁰の3つのDXAスキャンを取得する。
6. kg のバット重量に 0.75 g/kg の D₂O 線量を掛けて注入する D₂O の質量 (g 単位) を決定します。D2O線量の重量を働く溶液の濃度で割ることによって計算された_D2O用量(V)の体積を決定する。
   
   
7. 計算された_D2Oの体積を引き出すために29 G針が付いているインスリン注射器を使用する。_D2O、インスリンシリンジ、および針を計量する。小数点以下4桁に記録します。
8. 麻酔バットの腰の後部に皮下に_D2Oを注入する。
9. コウモリが麻酔から回復し、注射の時間を記録できるようにします。
10. 注射直後に、29G針を装着して現在空のインスリン注射器を秤量する。小数点以下4桁の重みを記録します。
11. インスリン注射前の注射後の注射量を、プレインジェクション_D2O充填されたインスリンシリンジから差し引くことによって注入された_D2Oの用量を決定する。小数点以下4桁に記録します。
12. 30分以内に、ヘマトクリット遠心分離機を使用して、各毛細管を5分間回転させます。ヘマトクリット遠心分離機で複数の速度が可能な場合は、10,000 x gに設定します。
13. 全血と血漿の間のプラスチック毛管を切断するために鋭いはさみを使用してください。200 μLピペットを使用して、プラズマをラベル付きの500 μL貯蔵チューブに直接排出します。
14. 平衡期間の後、インターフェモラル静脈からさらに100μLの血液を採取する。
    注:平衡期間は種によって異なり、コウモリが魚雷に入る場合。大きな茶色のコウモリの場合、通常2時間は平衡期間に十分です。
15. ステップ3.13を繰り返して、プラズマを第2ラベル付きの500μLマイクロ遠心ねじトップチューブに分離します。サンプルは分析まで-20°C以上に保存してください。

4. フーリエ変換赤外線分光度測定法分析

1. 砂浴の温度を60°Cに設定して蒸留を容易にします(他の血液成分から水と_D2Oを分離できるようにします)。
2. 各プラズマサンプルのピペット50μLと1.5 mLの円錐型マイクロ遠心チューブキャップの内側に標準。品質管理として_D2Oの既知の濃度を含む規格を含む。
   注:理想的には、各動物はサンプルごとに3つの反復を有し、報告された3つの反復の平均を有する。著者が利用するFT-IR装置に必要なサンプル量とサンプル量が限られているため、コウモリのサンプルに対しては複製は行われなかった。サンプルに50μL未満のプラズマが含まれている場合は、サンプル量を円錐型マイクロ遠心管キャップにピペットで取り付け、体積を記録します。
3. マイクロ遠心栓キャップを逆さまに保ち、1.5 mL円錐形のマイクロ遠心チューブをキャップにねじ込みます。キャップをキャップ付きの逆(逆さま)チューブを砂浴中の砂浴に合わせて、最低12時間(一晩)置きます。
4. 12時間後、キャップを取り外し、新しいクリーンキャップに交換します。遠心分離機で10sのマイクロ遠心チューブをパルスします。
5. 以下の基準を作成する:0 ppm(1L蒸留水で0mgD2O)、293ppm(1L蒸留水で293mg D_2O)、585ppm(585 mg D 2 O) 1 L蒸留水、878 ppm (878 mg D₂O 1 L 蒸留水)、および 1170 ppm D₂O (1 L 蒸留水で 1170 mg D₂O) を使用します。
   注: 上記の値は、標準曲線に推奨されます。250 ppm、500 ppm、750 ppm などの代替値を使用できます。
6. フーリエ変換赤外線分光度測定 (FTIR) 分光計 (材料表) に液体透過セルを取り付けます。セルにメタノールを充填し、注入口を接続します。慎重に気泡のリスクを低減するためにメタノール注射器を除去しながら、ゆっくりとバックグラウンドの水でセルを充填します。出力ポートにチューブを取り付けて、サンプルの後分析を除去できるようにします。
7. 水の中のD₂Oの分析のためのFTIR分光計ソフトウェア(材料のテーブル)を準備します。このプロトコルで使用される分光器ソフトウェアのパラメータ設定を表1に示します。
8. 希釈液、0.22 μm 濾過、蒸留水を使用して、バックグラウンドサンプルを収集します。これは、標準に使用されるのと同じ水でなければなりません。
9. 0ppm_D2Oの40μLを注入し、スペクトルを記録します。スペクトルをカンマ区切り値(CSV)ファイルとして保存します。
10. すべての標準のスペクトルを挿入して保存し、標準カーブを作成します。
11. 背景と標準曲線を 60 ~90 分ごとに繰り返します。
12. 蒸留したサンプルを液体透過セルに40μL注入し、スペクトルを保存します。
    注:液体透過セルの容積に基づいて、標準および蒸留サンプルの注入量を変更します。サンプル体積が40μL未満の場合、またはバックグラウンド蒸留水で1:1を希釈する場合は、より小さな体積液体透過セルを使用してください。
13. Jenningsら¹¹またはスペクトルソフトウェアによって記述されるように、スプレッドシートプログラムを使用してFTIRスペクトルからの各サンプルの_D2Oの濃度を決定する。反復が行われる場合は、平均濃度を使用して体組成を計算します。

5. 体組成の計算

1. 重水素濃縮(ppm)を、次式¹²を用いて各サンプルの原子濃度に変換する。
   
   ここでxは、試料の測定された重水素濃縮(ppm)と0.0001557が、ウィーン標準平均海洋水(VSMOW)13で報告された重水素のモル分数である。
2. 次の式⁴,^12,14を使用して、各サンプルの総体水^を計算します。
   )
   ここで、E は測定されたエンリッチメント (原子%)バックグラウンド補正後の試料中の重水素の、Bはg中の注入質量、および0.998は注入された_D2Oの濃度である。
   注:陰唇水素との重水素交換は、総体水量の2%の過大評価を引き起こします。総体水は、体重の2%によって総体水質量推定値を減らすことによって補正する必要があります。
3. 次の式を使用して、各コウモリの無脂肪質量(赤身の体重と他のすべての非脂肪成分)を推定します。
   
   注:健康でユーハイドレートされた非授乳コウモリのリーンボディ質量の分率水分含有量には、従来受け入れられている値 0.732 を使用します。無脂肪質量の分数水分含有量は、産後第¹⁵週に基づいて大きな茶色を授乳中に変化する可能性があります。他の種の場合は、文献に掲載されている値を使用するか、リーンボディ質量の計算を実行する前に、除脂肪体重の分数水分量を決定します。
4. 次の式を使用して体脂肪質量を推定します。
   
5. 次の式を使用して、g の体脂肪質量をパーセント体脂肪量に変換します。
   

6. 食後の水組成の決定 (フェリス・カトゥス、 飼猫)

1. セクション 1 の説明に従って、ストック ソリューションを準備します。
2. 各猫の体重を小数点以下3桁にし、重みを記録します。ステップ3.6で説明した各ネコの用量を、0.70g/kgのD_2O用量を用いて計算する。
3. ステップ 3.7-3.8 で説明されているように各用量を準備します。インスリン注射器の代わりに22 G針で3 mLまたは5 mLシリンジを使用する。
4. 全血500μLを採取し、その後、0.7 g/kg D₂O.遠心分離体全血を2,000 x gで15分間投与し、分析まで-20°Cで1.5mLマイクロ遠心スクリュートップチューブにプラズマを貯蔵します。
5. 全血4時間の注入後に500μLを集める。全血を2,000 x gで15分間遠心分離し、分析まで-20°Cの1.5mLマイクロ遠心スクリュートップチューブにプラズマを貯蔵します。
6. 注射後14日間、全血500μLを採取する。全血を2,000 x gで15分間遠心分離し、分析まで-20°Cの1.5mLマイクロ遠心スクリュートップチューブにプラズマを貯蔵します。
   注:採血の間隔の日数は、実験の必要性と、D₂Oがバックグラウンドレベルより上で検出できる注射後の期間に基づいて行うことができます。14日間はフーパーらから食事治療ブロックの長さ^だった.
7. セクション4に従ってFT-IR解析を行い、このプロトコルのセクション5に従って体組成を計算する。
8. 次の式を使用して、mL/日の水消費量を計算します。
   
   
   
   ここでTBWは全体水、初期_D2Oおよび最終_D2Oは、注入後の_D2Oサンプル中のppmで測定された濃度である。

結果

重水素酸化希釈技術は、様々な種の体組成を評価するために使用することができる。適応性を実証するために、北米の昆虫コウモリ種、エッテシカス・フスカス、代表的な結果のための大きな茶色のコウモリで重水素酸化物希釈技術の最初の使用を報告しています。タイミングプラトーは、平衡期間が不明な種で行われるべきとして、プレ_D2O注射血液?...

ディスカッション

重水素酸化物の使用は、1940年代¹⁷年以降に使用されており、ヒトおよび様々な国内および野生生物種^4、6、7に使用されている。生体電気インピーダンス解析(BIA)、DXA、定量磁気共鳴(QMR)など、その他の非破壊技術が開発されています。各方法には、体組成を評価するための特定の方法論を選択する前に考?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 micron non-pyrogenic disk filter	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile
1.5 mL conical microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-9701	1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap
10 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	clear, sterile glass injection unit
10 mL syringe	Becton Dickinson	305219	sterile 10 mL syringe individually wrapped
100 mL sterile glass vial for injection	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	clear, sterile glass injection unit
20 gauge needle	Exel	26417	needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel
22 gauge needle	Exel	26411	needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel
deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-25G	99.9 atom % D
isofluorane	Vetone	3060	fluriso isoflurane, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR standard software
petroleum jelly	Vaseline	305212311006	Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant
plastic capillary tubes	Innovative Med Tech	100050	sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length
Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell	International Crystal Laboratory	0005D-875	0.05 mm Pathlength
sodium chloride	EMD Millipore	1.37017	suitable for biopharmaceutical production
Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer	ThermoFisher Scientific	269-169400	discontinued model, newer models available