用于筛选小分子抑制剂的NADH耦合ATPase分析的半高通量自适应

摘要

一种烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）与ATPase的检测已应用于小分子肌苷抑制剂的半高通量筛选。此动力学测定以 384 孔微孔板格式运行，总反应体积仅为每孔 20 μL。该平台应适用于几乎任何ADP生产酶。

摘要

ATPase酶利用三磷酸腺苷中储存的游利用能量，催化体内各种不会自发发生的内发性生化过程。这些蛋白质对细胞生活的各个方面都至关重要，包括新陈代谢、细胞分裂、对环境变化的反应和运动。这里提出的协议描述了一种烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）耦合ATPase测定，该检测已适用于小分子ATPase抑制剂的半高通量筛选。该测定已应用于心脏和骨骼肌肌苷II，两个基于行为蛋白的分子运动ATPases，作为原理证明。ATP的水解通过测定中的酶反应与NADH的氧化结合。首先，由 ATPase 生成的 ADP 通过丙酮激酶 （PK） 再生为 ATP。PK催化磷酸二苯丙酸酯（PEP）与丙酮类酯的平行过渡。随后，乳酸通过乳酸脱氢酶（LDH）降低为乳酸盐，同时催化NADH的氧化。因此，ATP浓度的下降与NADH浓度的下降直接相关，随后是NADH内在荧光的变化。只要在反应系统中有PEP，ADP浓度仍然很低，避免由其自己的产品抑制ATPase酶。此外，ATP 浓度几乎保持不变，产生线性时间课程。荧光被持续监测，从而便于估计数据的质量，并有助于过滤出潜在的伪影（例如，由复合沉淀或热变化引起的）。

引言

肌苷是水解三磷酸腺苷（ATP）的机械化学能量传感器，用于在真核细胞1、2中沿活性素细胞骨架的丝状物产生定向运动。它们在结构和动力学上都适应了细胞内的各种功能，如细胞器的传输、肌肉收缩或细胞骨骼张力的产生1，2。肌苷超级家族由属于人类基因组3、4中12个不同肌苷类的+40肌苷基因表示。肌苷类的成员在一系列高度多样化的疾病中扮演着不同的角色，如几种癌症、神经系统疾病、骨骼肌病和肥大性心肌病5、6。鉴于这些分子马达的生理和病理功能很多，它们越来越被公认为各种条件的药物靶点，^{这并不奇怪。}最近，在发现新的肌苷抑制剂8、9、10和活化^剂11方面取得了重大进展，并改善了现有^抑制剂12的特性。^13,14,15.

烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）耦合ATPase测定早已用于测量各种酶的ATPase活性，如肉质性视网膜Ca²⁺泵ATPase 16，DNA修复ATPase Rad5417，AAA+ATPase p97¹⁸或微管马达运动体¹⁹。测定采用 ATP 再生循环。ATPase产生的二磷酸腺苷（ADP）通过丙酮酸激酶（PK）再生为ATP，将一个磷酸二醇酸（PEP）分子并联转化为丙酮酸盐。随后，通过乳酸脱氢酶（LDH）将丙酮酸酯降低为乳酸盐。这反过来又氧化了NADH的一个分子到NAD。因此，NADH浓度作为时间的函数的降低等于ATP水解率。只要 PEP 可用，ATP 再生循环就使 ATP 浓度几乎保持不变，ADP 浓度处于低水平。这导致线性时间课程，使得确定初始反应速率变得简单，并有助于避免ADP¹⁹对产品抑制。虽然NADH耦合ATPase测定已经适应了96井^格式20，但高反应量（±150 μL）由于试剂需求较高，使得它不太适合快速筛选大量化合物。替代方法，如麦芽绿测定19，21，它依赖于检测由ATPase酶产生的磷酸盐，被证明更适合小型化和高通量^{筛选22,23,24.}然而，端点测定更有可能受到几个工件的影响（下文讨论），如果没有全日制课程，这些伪像可能仍未被发现。

在这里，NADH耦合ATPase测定已针对小分子抑制剂的半高通量筛选进行了优化。骨骼和心肌肌苷II和肌苷抑制剂blebbisatin^8，副阿米诺巴他丁13和准硝基布利他妥丁12用于证明测定的力量，它依赖于NADH荧光作为读出。该协议适用于筛选专注于任何ADP生产酶的项目。

研究方案

1. 制备库存溶液和试剂

1. 通过在蒸馏水中溶解结晶DTT至最终浓度为1000 mM，制备二硫二硫醇（DTT）库存溶液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
2. 通过将蒸馏水中的结晶ATP溶解至100 mM的最终浓度，制备ATP库存溶液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
3. 制备含有70mM 3-（N-变形）丙烷酸（MOPS）、10mM MgCl 2、0.9mM乙二醇-乙二醇（β-氨基乙醚）-N、N、N、N-四乙酸（EGTA）和3mMNaN3的10xNADH缓冲液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。储存在4°C。
4. 制备含有10 mM MOPS和0.1 mM EGTA的1x肌苷缓冲液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。储存在4°C。将牛血清白蛋白 （BSA） 和 DTT 添加到 0.1% 的最终浓度（w/v%）和 1 mM，分别在使用前。
5. 准备含有4 mM MOPS、0.1 mM EGTA、2 mM MgCl₂和3 mM NaN₃的1x肌素缓冲液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。储存在4°C。将 BSA 和 DTT 添加到 0.1% 的最终浓度（包括/v%）和 1 mM，分别在使用前。
6. 通过在 10x NADH 缓冲液中溶解结晶 NADH 到最终浓度为 5.5 mM，制备 NADH 库存溶液。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
7. 通过将 10x NADH 缓冲液中的结晶 PEP 溶解到 50 mM 的最终浓度，制备 PEP 库存溶液。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
8. 通过在甘油和10x NADH缓冲液混合物中溶解冻干LDH粉末制备LDH库存溶液（50%:50%）到最终浓度为2000 U/mL。离心溶液，以去除任何未溶解的蛋白质存在（7，197 x g， 20 °C， 10 分钟）。小心地将上清液转移到干净的离心管中。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
9. 通过在甘油和10x NADH缓冲液混合物中溶解冻干PK粉末制备PK库存溶液（50%:50%）最终浓度为10000 U/mL。离心溶液，以去除任何未溶解的蛋白质存在（7，197 x g， 20 °C， 10 分钟）。小心地将上清液转移到干净的离心管中。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
10. 通过加入100μL蒸馏水，重新形成冻干心脏和骨骼肌肌肌酸II样品，以获得10mg/mL库存溶液，分别对应于±37.9 μM和+40.8 μM肌苷浓度（单体）。有关详细信息，请参阅制造商的说明。
11. 从兔子肌肉丙酮粉制备F-actin，如帕迪和斯普^迪奇25所述。

2. 测量小分子抑制剂的ATPase活性和抑制作用

1. 准备复合板。
   1. 溶解优质二甲基硫酸盐（DMSO）中感兴趣的化合物。
   2. 从 DMSO 中的 10 mM 化合物浓度开始创建 15 步串行 1:2 稀释。
   3. 使用多通道移液器将样品转移到三联体（每块12.5 μL）的384孔聚丙烯板中。在复合板上对一个化合物（而不是三列）使用两行，以尽量减少可能受边缘效应影响的井数。将每个化合物的第二行的最后三口作为负控制（仅限 DMSO）。请勿将板上的第一行和最后一行用于复合稀释。
   4. 将纯 DMSO 传输到第一行的井中（保留用于 NADH 校准）。
   5. 使用最后一行进行正控制。
      注:此处使用了DMSO中浓度为4 mM的副阿米诺比沙丁。
2. 通过稀释Actin缓冲液中的Actin股票溶液，为每个测定板（384孔黑壁聚苯乙烯微板）制备4500μL的20μM稀释剂溶液。使用 5 mL 移液器上下移液 30x，彻底混合溶液，通过打破活性素细丝来降低粘度和异质性。离心溶液，以去除任何沉淀的蛋白质存在（7，197 x g，20 °C， 10 分钟）。小心地将上清液转移到干净的离心管中。
3. 准备含有LDH和PK酶（"酶混合"）的主混合物。对于每个测定板，将171.4μL的LDH溶液、171.4μL的PK溶液和3189.3μL或3252.9 μL肌苷缓冲液分别结合在15 mL锥形离心管中，用于涉及心脏或骨骼肌肌黄蛋白II的测定。此时不要添加任何肌苷，以避免聚集和降水。
4. 准备包含所有基板的主混合物（"基板混合"）。对于每个板，将 ATP 的 162.1 μL、162.1 μL 的 PEP 和 324.1 μL 的 NADH 溶液组合在 15 mL 锥形离心管中。此时不要添加 actin 以避免聚集和沉淀。
5. 创建七步串行 1:2 稀释 NADH，以便从 250 μM 开始校准。
   1. 将12.3 μL的NADH库存溶液与257.7μL肌苷缓冲液混合在1.5 mL微离心管中。
   2. 亚细亚135 μL肌苷缓冲液放入7个1.5 mL微离心管中。
   3. 将135 μL溶液从第一管转移到第二管中，并通过移液混合。重复，直到达到^第7管。
   4. 使用最后一根管作为无 NADH 控制（仅限缓冲器）。
6. 使用 8 通道移液器，将 20 μL 的 NADH 校准解决方案以三联成片将 20 μL 传输到化片的第一行。
7. 在酶混合物中加入68 μL的心脏或4.2 μL的骨骼肌肌肌苷II。漩涡简要。
8. 除第一行外，使用自动分配器将制备的肌苷酶混合物的8.4 μL分给测定盘的每个孔。
9. 使用配备 100 nL 销工具头的自动液体处理系统，将 100 nL 溶液从复合板转移到含有酶混合物的测定板。
10. 使用微板摇床在室温1200rpm下摇动测定板1分钟。
11. 在基材混合物中加入4，052 μL的离心反应液溶液。漩涡简要。
12. 将 11.6 μL 的 actin-基质混合物放入测定板（第一行除外）的每个孔中，使用自动分配器启动酶反应。
13. 使用微板摇床在室温1200rpm下摇动测定板1分钟。
14. 将测定板在 101 x g下离心 30 s。
15. 确保板式读卡器的内部温度稳定在 25°C。装入板并摇动 30 s。此摇动步骤是必要的，使液体表面的形状在每个孔中相似，并留出时间使板达到测量温度。
16. 以 45 秒的间隔记录 NADH 荧光 30 分钟扫描板。使用 380 nm、10 nm 带宽激励滤波器和 470 nm 24 nm 带宽发射滤波器，以及 425 nm 截止双色镜。在高浓度模式下运行测量。在运行检测之前，优化闪烁次数、探测器增益、板尺寸和测量高度。
    注: 最终测定条件为 300 nM 心脏/20 nM 骨骼肌肌肌苷 II，10 μM 肌素，40 U/mL LDH，200 U/mL PK，220 μM NADH，1 mM PEP，1 mM ATP 在缓冲液中包含 10 mM MOPS （pH = 7.0），2 mM MgCl₂，0.15 mM EGTA，0.1 毫克/毫克 BSA，0.5% （v/v） DMSO 和 1 mM DTT。总体积为 20 μL/井。最高最终化合物浓度为50μM.20μM对αnoblebisatin，在0.5%DMSO中充当正对照，仅0.5%DMSO是负对照。 所有测量均以三次进行。

3. 分析数据

1. 根据每口井的时间绘制观察到的荧光强度。
2. 执行简单的线性回归，以确定每个井的荧光响应的斜率和截距。斜率与 ATP （NADH） 消耗率成正比，而截距与测量开始时的 NADH 浓度成正比（t = 0 s）。
3. 通过绘制板块第一行获得的截距与 NADH 浓度的截距，为 NADH 构建校准曲线。确保截距线性取决于 NADH 浓度。
   注: 截距估计 t = 0 s 处的实际荧光强度，其可信度远高于 t = 0 s 的原始荧光强度读数的平均值。
4. 执行简单的线性回归以获得 NADH 校准线的斜率和截距。
   注: 截距描述荧光背景信号（不存在 NADH），而斜率对应于该特定实验中 1 M NADH 溶液的外推/理论荧光强度。
5. 将其余油井获得的荧光响应斜率除以 NADH 校准线的斜率，以将荧光变化转换为 ATP 消耗率。
6. 根据抑制剂的浓度绘制 ATP 消耗率图。
7. 要确定抑制常数，请使用适当的统计软件将剂量-响应数据拟合到以下二次方程，对应于简单的一对一结合平衡模型:
   
   其中Y是 ATP 消费率，Y _min是 ATP 消费率，没有抑制剂，Y_最大值是理论 ATP 消耗率在 100% 抑制，K _I是抑制常数，[E] t和[I]_t分别是酶（肌苷）和抑制剂的总浓度。

结果

用于筛选实验的典型板布局图如图1所示。第一行和最后一行分别保留用于NADH校准和正控制（20μM准阿米诺比沙丁，0.5%DMSO）。其余行（B到O）用于测试化合物的抑制活性。在这里，从DMSO中的10 mM化合物浓度开始的15步序1:2稀释被制备并从复合板转移到测定板，使测定板上的最高最终化合物浓度为50μM（以0.5%DMSO为单位）。两行用于获取一种化合?...

讨论

协议中的关键步骤

通过运行多个仅带负控制（无抑制剂的 ATPase 反应）的板，优化板材布局。仔细检查结果，查看反应速率的模式。例如，这些可能由"非结合"板的亲水表面涂层的边缘效应和/或缺陷引起。如果观察到图案，请更改板类型和/或板布局，以尽量减少伪影。例如，典型的剂量反应曲线（带三重的 16 浓度，总计 48 点）可以排列在 384 孔板上的三列或两?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate)	Sigma	A7699
Aurora FRD-IB Dispenser	Aurora Discovery, Inc.	00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter	A31841
Blebbistatin	AMRI	N/A	Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)	Akron Biotech	AK1391
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30	Eppendorf	022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP	Eppendorf	022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma	D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma	D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel	Thermo Scientific	4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel	Thermo Scientific	4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma	E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader	PerkinElmer	2104-0010
Glycerol	Sigma	G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)	Sigma	L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)	Sigma	M2670
Microplate Shaker	VWR	12620-926
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural	Greiner Bio-One	784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)	Sigma	M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)	Cytoskeleton	MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)	Cytoskeleton	MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)	Sigma	N8129
NaN3 (Sodium azide)	Sigma	71289
NaOH (Sodium hydroxide)	Sigma	S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)	PerkinElmer	2100-5850	Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)	PerkinElmer	2100-5390	Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase	PerkinElmer	2100-4270	Barcode 418
OriginPro 2017 software	OriginLab	N/A
para-Aminoblebbistatin	AMRI	N/A	Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin	AMRI	N/A	Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)	Sigma	P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)	Sigma	P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder	Pel Freez Biologicals	41995-2