普帕尔阶段发育性皮瘤中组织定向和生长动力学的成像与分析

摘要

该协议旨在成像和分析果蝇在果蝇发生变质时，果蝇腹部上皮细胞定向和组织生长动力学。本文描述的方法可用于研究果蝇或其他模型生物体的不同发育阶段、组织和亚细胞结构。

摘要

在多细胞生物体中，成熟的组织和器官在其组成细胞的空间排列中表现出高度的秩序。感官上皮给出了一个显著的例子，其中相同或不同身份的细胞通过细胞粘附性（显示高度组织的平面模式）聚集在一起。单元格以相同的方向相互对齐，并在较大距离内显示等效极性。成熟的上皮体组织是在形态形成过程中建立的。为了理解成熟上皮的平面排列是如何实现的，在体内发育过程中以高时空保真度跟踪细胞方向和生长动力学至关重要。强大的分析工具对于识别和描述本地到全球的过渡也至关重要。果蝇小狗是一个理想的系统，用于评估定向细胞形状变化的基础上皮形态发生。上皮发育的皮毛构成不动体的外表面，允许对完整动物进行长期成像。此处描述的协议旨在成像和分析在皮球腹部表皮生长时全球和局部水平的细胞行为。所述方法可轻松适应其他发育阶段、组织、亚细胞结构或模型生物体的细胞行为成像。

引言

为了发挥自身的作用，上皮组织完全依赖于其细胞成分的空间组织。在大多数上皮上，细胞不仅相互挤合，以形成精确的鹅卵石层，而且相对于身体轴的方向。

精确组织组织的功能重要性在感觉上皮中显而易见，如脊椎动物内耳和视网膜。在第一种情况下，头发和支撑细胞以特定的轴向方向对齐，以有效感知机械输入，如声音和运动^11、22。同样，光受体细胞空间组织对于通过视网膜³实现最佳光学特性至关重要。因此，细胞位置和方向的空间控制对于适当的生理功能具有特别重要的意义。

果蝇是一种全息昆虫，通过蜕变，对幼虫体结构进行完全转化，导致其成年组织。果蝇pupa是一个优秀的模型，用于各种动态事件的非侵入性活成像，包括发育细胞迁移^4、细胞分裂和生长动力学^5、肌肉收缩^6、细胞死亡^7、伤口修复⁸和细胞定向^9。在成人果蝇中，外部上皮表现出高度的秩序。这很容易观察到的三角（即，细胞突起源自单上皮细胞）和感觉刷毛遍布苍蝇的身体表面^10。事实上，三角线排列在平行行引导气流^11。成人上皮的形态和单个细胞的有序排列在胚胎生成期间开始，并在胚胎阶段达到高潮。虽然在胚胎细胞分裂，杂交和形状的变化都减少组织顺序^12，13，这是在发育的后期阶段，特别是在pupal阶段，当苍蝇接近成熟^12,9。

不动的果蝇小狗提供了一个理想的系统来评估细胞的形状和方向变化。皮巴腹部表皮具有特殊优势。当成年头、胸腔、生殖器和附属物的前体生长并从幼虫阶段得到图案时，被集成到幼虫表皮中的组状细胞开始生长和区分，仅在幼崽^14。此功能允许跟踪所有参与建立组织秩序的时空事件^。

在胚胎发育期间，在每个假定腹段的相反位置指定了组织爆炸。成人的背腹部表皮来自地主位置的组震巢穴，存在于前和后舱^{15，16。15,}当组织爆炸扩大，取代幼虫上皮细胞（LECs），反向巢在背侧中线引信形成一个汇管板17，18，19，20。^17,18,19,20

本研究描述了1）一种对果蝇小狗进行解剖、安装和长期实时成像的方法，以及2）以高时空分辨率研究细胞定向和生长动力学的分析方法。此处提供了详细的协议，涵盖从初始 pupae 制备（即暂存和成像）到定向和方向特征的提取和定量所需的所有步骤。我们还描述了如何从细胞克隆的分析中推断局部组织特性。所述的所有步骤都是微创的，允许长期实时分析。此处描述的方法可以很容易地适应并应用于其他发育阶段、组织或模型生物体。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

注:该协议分为五个步骤:（1） 暂存小狗，（2） 准备小狗成像，（3） 生长的腹部上皮的活成像，（4） 生成遗传马赛克，（5） 数据处理和分析（包括描述如何从细胞结轮廓分析细胞方向动力学和细胞克隆的生长动力学的部分）。

1. 成像前分期使用果蝇小狗

1. 产卵（AEL）后，在25°C（±12小时）的塑料小瓶中培养标准基的相应基因型，5天（±12小时）。
   注:在幼虫形成（APF）后，在120 h AEL下，在第三颗恒星幼虫的禁闭范围内开始蜕变。这种过渡很容易识别，因为幼虫停止喂食和移动，并在0-12 h APF下形成操作区域（图1A）。紫杉最初是软和白色的，但逐渐变硬和晒黑。
2. 使用湿润的画笔将白色预食 （0 h APF） 转移到新鲜的塑料小瓶中。动物可以保持在不同的温度根据设计的实验，直到所需的年龄。
   注:Pupa形成（即，小狗）发生在12小时APF，当成人苍蝇的头部和附属物完全被避开时（图1A）。此时，pupal 大小箱与 pupa 完全分离，允许其完全删除（图 1A）。

2. 准备使用小狗进行现场成像

注: 暂存后，将解剖并安装图（另另见图 1）。

1. 在钳子的帮助下，从小瓶的墙壁上取下上演的小狗。
2. 将每支小狗的腹侧粘在玻璃滑道上，上面覆盖着双面胶带。用钳子的尖端轻轻敲击头螺旋藻（即操作区域）和pupa的背部表面，以确保脓壳与胶带的粘附（图1A，B）。
   注:背板表面应朝上，以方便对病例进行解剖和回收小狗。
3. 在立体显微镜下开始解剖，用钳子轻轻地从紫杉中取下手术图（图1C）。
4. 通过操作性开口，在钳子壳和 pupa 表面之间的浅角度插入钳子的一个尖端。在一个或多个摆动中，横向将箱子从头撕到尾，避免挤压 pupa（图1D）。继续向前端（图 1E），将破裂的 pupal 壳折叠回侧边。
   注:小壳外壳相当硬质，容易开裂。在湿度高或特别基因背景的情况下，脓肿情况变软，撕裂更加困难。在这些情况下，通过用钳子的两个尖端刺破其自由边缘，可以帮助 pupal 外壳的开裂。
5. 小心地将钳子插入动物下方并轻轻拉起，从打开的脓箱中取出小狗（图1F）。小狗将粘在钳子的尖端（图1G+H）。
6. 在钳子的帮助下将pupa转移到玻璃底盘，并放在一小滴透气的卤化碳油上（图1I）。轻轻地握住支室侧，以避免任何可能的组织损伤。
   注:卤化碳油的滴必须很小，直径大约不到普帕长度的一半。这种量足以通过毛细管将 pupa 粘附在玻璃上，并纠正用于油浸没目标的光学元件。
7. 在盘子边缘卷起一块湿纸巾以保持湿度。盖上盘子，避免在成像过程中使小狗脱水。
   注:女性和雄性小狗都可以用于成像。我们建议使用第三腹部段 （AIII） 作为参考腹部元粒，因为它在大小、形状和图案方面几乎在两性上相同。

3. 腹部上皮生长的实时成像

注:一种带 40x/1.3 NA 油浸没目标的倒置激光扫描共聚焦显微镜用于在不同发育阶段成像 Pupae。

1. 根据领域和要评估的过程，将 pupa 定向到玻璃底盘上的油滴上（例如，在地底上进行背底早期扩张的长期实时成像，或将拖底成像为其后期膨胀和组织重塑）。参见图 1J、K和图 4。
2. 将装有安装的小狗的玻璃底盘转移到显微镜阶段，并使用透射光聚焦腹部表面。
   注:即使此协议针对倒置显微镜上的成像进行了优化，也可以在直立显微镜上进行成像。在这种情况下，样品被放置在显微镜舞台上，玻璃底部表面朝上。卤化碳油将每一个小狗都放在半月板上。
3. 设置采集参数:1） Z 切片的数量通常在 20~40 之间，以便对腹部表皮进行适当的二维 （2D） 重建;2） 每片之间的步长大小（例如，1 微米）;3） 记录时间间隔（5 分钟间隔适用于细胞方向动力学的高保真分析）;和 4） 帧分辨率（例如，1024 x 1024）。
4. 打开适当的激光器（即 488 nm 和 561 nm，分别可视化 GFP 和 RFP 荧光波），并调整激光功率和增益/偏移设置以可视化标记的细胞。使用尽可能低的激光功率（范围为 5%+20%）尽量减少光漂白和光毒性。
5. 使用附加的电动级和显微镜多位置采集软件手动设置多普帕的位置和适当的 Z 堆栈限制。

4. 生成遗传马赛克以遵循细胞克隆的行为

注:我们采用线粒体重组，通过部位特异性重组（FLP/FRT系统^21，22）诱导腹部上皮的基因马赛克（^21,图2）。

1. 携带热休克诱导的Flippase转基因（hs-FLP）的跨处女，一个在特定基因组位置的FLP识别靶点（FRT）（例如， FRT位位于2号染色体L臂位置40A处，以及一个可识别的细胞标记（例如，Ubi-RFP.nls或Ubi-GFP.nls），远至FRT部位，与携带FRT位位的突变雄性在等效基因组位置（图2A+C）远。
   注:克隆体内或克隆外的自主和非自主效应可用于任何基因功能丧失，可利用与FRT位点远端的特定隐性等位基因进行研究。
2. 在十字后代的第三个星幼虫阶段通过热休克处理在原体上生成FLP/FRT体体克隆。在流浪幼虫（LIII）阶段，通过将含有动物的塑料小瓶浸入37°C的水浴中45分钟至1小时进行。
   注:线粒体重组的敏感期是细胞循环的 G2 相位。在整个幼虫发育过程中，在G2中逮捕了一些细胞。
3. 从16小时APF开始，对荧光蛋白标记物的缺失（即突变细胞）或增强（即野生型双斑细胞）水平进行评分（图2D）。
   注:平均而言，在37°C下，45分钟至1小时，每个感兴趣的区域（例如腹部中段）仅产生2-3个双胞胎克隆。从进一步的定量分析中，应该抛弃显示过高克隆密度的Pupae（例如，每个中段超过四个双胞胎克隆）。
4. 克隆鉴定后，图像活的pupae在所需的阶段和所需的时间长度，如上一节所述。

5. 数据处理和分析

注: 数据使用 ImageJ （imagej.nih.gov/ij/） 处理。

1. 区分细胞方向动力学和细胞结轮廓。
   1. 使用 ImageJ的最大强度投影（MIP） 函数，在 2D 中投影共聚焦显微镜获取的 Z 堆栈切片。
      注: 每个堆栈的切片数应保持在最小，以避免表皮下巡逻的巨噬细胞产生的焦点噪声失焦点。
   2. 设置平面坐标系，识别可靠的组织地标（例如，A/P 隔间边界），以便分析每个数据集（图 3A）。
      注: 为每个数据集使用相同的平面引用将允许比较多个测量值。
   3. 使用ImageJ^23，24,24的定向J插件（bigwww.epfl.ch/demo/orientation/）在局部细胞边缘获得定性和定量方向值。插件根据局部方向在输入图像上渲染颜色编码叠加，并在定量模式下使用时提供数值（图3B+B'和图 C_C''）。
      注:定向J插件基于结构张力，2 x 2 矩阵的 eigen值矩阵派生自梯度和方向导数（有关详细说明，请参阅参考^{文献 23，24）。,24}
   4. 使用"定向J分布"选项对相对于设置平面坐标系（即单元格边缘方向贴图）的单元格边缘方向进行颜色编码（图 3B）。在 ImageJ 中的插件菜单下找到"分发"选项。要采用的设置是:高斯窗口西格玛 = 1 像素;立方样条线 = 渐变;最小一致性 = 20%;最小能量 = 1%。单元格边缘方向显示为使用插件的颜色测量选项的颜色编码图像（Hue = 方向;饱和度 = 一致性;和亮度 = 输入图像）。
      注: 包含背景荧光的区域不提供任何方向信息，必须手动从分析中排除。高阈值设置可减少已处理图像中考虑的像素。
   5. 使用定向J测量选项量化细胞方向和方向细胞-细胞对齐（即一致性）（图3C）。"度量"选项位于 ImageJ 中的插件菜单下。在组织爆炸占用的区域内生成均匀重量（64 x 64 像素，约 20 μm x 20 μm）的较小相邻非重叠感兴趣区域 （ROIs）。Figure 3C
   6. 计算主要局部方向（即相邻单元格平均单元格边缘方向贴图之间的平均方向）和来自 RO 的一致性。该软件计算每个 ROI 中的主要方向和本地一致性（图3C）。
      注:定向J估计的结构拉伸量的最大和最小 eigen 值用于计算一致性，作为其差值和总和之间的比率。一致性在值 0+1 之间受约束。值 1 表示完全对齐均匀性，而值 0 表示无对齐的各向异性区域。
   7. 使用免费软件包（如 PAST^25）从多个图像中分析计算的方向和一致性值。方向统计对方向值（以度计）等轴向数据进行了适当的描述。
   8. 通过软件计算每组方向分布的平均方向和圆方差。使用非参数马尔迪亚-沃森-惠勒测试（W-test）确定不同基因型或条件之间方向分布差异的统计意义。
   9. 计算使用非参数科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫测试（K-S 检验）的一致性差异的统计显著性。根据需要以图形方式显示数据（极坐标图、条形图、框图等）。
2. 细胞克隆的生长动态
   注: 以下步骤允许从包含感兴趣的克隆的 2D MIP 图像中检索单元格的几何和形状参数。要比较多个克隆，必须使用相同的设置获取图像。
   1. 使用 ImageJ手绘选择工具绘制其轮廓来分割克隆区域。
   2. 使用"分析"菜单下的 ImageJ设置测量工具计算几何和形状参数。激活"区域"、周长、拟合椭圆和形状描述符选项。
      注: 这将允许检索不同的几何参数，包括区域（克隆内像素之和）、周长（克隆边框的像素总和）、纵横比（AR、刻在克隆边框中的最佳拟合图例椭圆的主要轴和次要轴之间的比率）和方向角度（即克隆主轴相对于前轴边界的角度）。
   3. 从这些测量中计算非维比可检索形状参数。这些包括圆度（4 x 面积*/x [主轴]^2）、粗糙度（固体 - 区域/凸区）和圆度（4°x [面积]/[周长]²）。
      注: 每个形状参数表示克隆与理想形状（如圆或界形凸体）的偏差程度，它们都边界在值 0 和 1 之间。值等于 1 表示最大对称性（即最小复杂性）。
   4. 使用 Microsoft Excel 和/或 PAST 以统计方式分析不同基因类型或条件之间的几何和形状参数。差异的统计意义是使用无对的双尾学生 t 检验等均值或非参数科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫 K-S 检验确定条件之间相等分布的 t 检验。数据可以按所需方式以图形方式显示（例如，条形图、框图等）。参见图 5。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

上述协议包括为长期活体成像制备果蝇小狗，以及分析腹部表皮细胞取向和生长动力学的程序。通过应用这种方法，可以生成发育中的普帕的高分辨率电影，时间长达48小时，而不会显著光漂白或光毒性。图4显示了描绘不同时间点和从不同角度方向的pupae的腹部表皮（例如，组织爆炸和LECs）的快照。对这些电影的后续分析能够识别和量化在扩?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

远程顺序是大多数功能性生理单元的基本特征。在形态生成过程中，通过集成以高时空精度实现的复杂指令来实现顺序。多级和多级约束被集成到定型的组织安排中。

极性和定向性对于开发过程中的有序空间排列至关重要。极性意味着在开发过程中对称性断裂。实现不对称是必要的，以确定胚胎前背（A/P）和多索温托（D/V）轴和成人组织^26。除了这种早期作...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection