Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ist für die Bildgebung und Analyse der Dynamik der Zellorientierung und des Gewebewachstums in der Drosophila-Bauchepithelie konzipiert, während die Fruchtfliege einer Metamorphose unterzogen wird. Die hier beschriebene Methodik kann auf die Untersuchung verschiedener Entwicklungsstadien, Gewebe und subzellulärer Strukturen in Drosophila oder anderen Modellorganismen angewendet werden.

Zusammenfassung

Innerhalb mehrzelliger Organismen weisen reife Gewebe und Organe hohe Ordnungsgrade in den räumlichen Anordnungen ihrer Konstituentenzellen auf. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die sensorische Epithelie, bei der Zellen der gleichen oder unterschiedlichen Identitäten über die Zell-Zell-Adhäsion zusammengeführt werden, die hochorganisierte planare Muster zeigt. Zellen richten sich in der gleichen Richtung aneinander aus und zeigen über große Entfernungen eine äquivalente Polarität an. Diese Organisation der reifen Epithelie wird im Laufe der Morphogenese etabliert. Um zu verstehen, wie die planare Anordnung der reifen Epithelie erreicht wird, ist es entscheidend, die Zellorientierung und Wachstumsdynamik mit hoher raumzeitlicher Genauigkeit während der Entwicklung in vivo zu verfolgen. Robuste Analysetools sind auch unerlässlich, um lokale zu globale Übergänge zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Drosophila-Pupa ist ein ideales System zur Bewertung orientierter Zellformveränderungen, die der epitheliaalen Morphogenese zugrunde liegen. Das pupal entwickelnde Epithel bildet die äußere Oberfläche des unbeweglichen Körpers und ermöglicht eine langfristige Bildgebung intakter Tiere. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Zellverhalten sowohl auf globaler als auch auf lokaler Ebene in der pupalen Abdominalepidermis zu abbilden und zu analysieren, während es wächst. Die beschriebene Methodik kann leicht an die Abbildung von Zellverhalten in anderen Entwicklungsstadien, Geweben, subzellulären Strukturen oder Modellorganismen angepasst werden.

Einleitung

Um ihre Rolle zu erfüllen, verlassen sich Epithelgewebe voll und ganz auf die räumliche Organisation ihrer zellulären Komponenten. In den meisten Epithelien werden Zellen nicht nur gegeneinander gepackt, um eine präzise Kopfsteinpflasterschicht zu schaffen, sondern sie orientieren sich relativ zu den Körperachsen.

Die funktionelle Bedeutung einer präzisen Gewebeorganisation wird bei sensorischen Epithelien wie dem Wirbeltier-Innenohr und der Netzhaut deutlich. Im ersten Fall richten sich Haar- und Stützzellen in eine bestimmte axiale Richtung aus, um mechanische Eingänge wie Schall und Bewegung^1,2effizient zu erkennen. In ähnlicher Weise ist die räumliche Organisation der Photorezeptorzellen unerlässlich, um optimale optische Eigenschaften durch die Netzhaut zu erreichen³. Die räumliche Kontrolle der Zellposition und -orientierung ist daher von besonderer Bedeutung für die richtige physiologische Funktion.

Drosophila ist ein holometabolous Insekt, das eine vollständige Transformation seiner Larvenkörperstrukturen durch Metamorphose durchläuft, was zu seinem erwachsenen Gewebe führt. Die Drosophila Pupa ist ein ausgezeichnetes Modell für die nichtinvasive Live-Bildgebung einer Vielzahl von dynamischen Ereignissen, einschließlich Entwicklungszellmigration⁴, Zellteilung und Wachstumsdynamik⁵, Muskelkontraktion⁶, Zelltod⁷, Wundreparatur⁸und Zellorientierung⁹. Bei der erwachsenen Drosophilaweist das äußere Epithel einen hohen Ordnungsgrad auf. Dies ist leicht an der Anordnung von Trichomen (d.h. Zellvorsprüngen, die aus einzelnen Epithelzellen stammen) und sensorischen Borsten auf der gesamten Körperoberfläche der Fliege¹⁰zu beobachten. Tatsächlich sind Trichome in parallelen Reihen ausgerichtet, die den Luftstrom¹¹leiten. Die Morphogenese der adulten Epithelie und die geordnete Anordnung der einzelnen Zellen beginnt während der Embryogenese und kulminiert in pupalen Stadien. Während in Embryonen Zellteilungen, Intercalationen und Formänderungen alle verringern Gewebeordnung^12,13, wird dies in späteren Stadien der Entwicklung, vor allem in Pupal-Stadien, wenn die Fliege nähert Reife⁹.

Die immobile Drosophila pupa bietet ein ideales System zur Bewertung von Zellform- und Orientierungsänderungen. Die pupalabdominale Epidermis bietet besondere Vorteile. Während die Vorläufer des erwachsenen Kopfes, Thorax, Genitalien und Anhängsel wachsen und aus Larvenstadien gemustert werden, beginnen die Histoblasten, die in die Larvenepidermis integriert sind, erst bei der Verpuptaration zu wachsen und zu differenzieren¹⁴. Diese Funktion ermöglicht die Verfolgung aller räumlich-zeitlichen Ereignisse, die an der Etablierung der Gewebeordnung in ihrer Gesamtheit beteiligt sind⁹.

Histoblasten werden während der embryonalen Entwicklung an kontralateralen Positionen in jedem mutmaßlichen Bauchsegment spezifiziert. Die dorsale Abdominalepidermis des Erwachsenen leitet sich von dorsolater lokalisierten Histoblastnestern ab, die an den vorderen und hinteren Fächern^15,16vorhanden sind. Wenn sich Histoblasten ausdehnen und die Larvenepithelzellen (LECs) ersetzen, verschmelzen die kontralateralen Nester an der dorsalen Mittellinie und bilden ein Konfluentblatt^17,18,19,20.

Diese Arbeit beschreibt 1) eine Methodik zur Zerlegung, Montage und langfristigen Live-Bildgebung der Drosophila-Pupae und 2) Analysemethoden, um die Dynamik der zellulären Orientierung und des Wachstums bei hoher raumzeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, das alle erforderlichen Schritte von der ersten Pupae-Vorbereitung (d.h. Inszenierung und Bildgebung) bis hin zur Extraktion und Quantifizierung von Richtungs- und Orientierungsmerkmalen abdeckt. Wir beschreiben auch, wie lokale Gewebeeigenschaften aus der Analyse von Zellklonen ableiten. Alle beschriebenen Schritte sind minimalinvasiv und ermöglichen langfristige Live-Analysen. Die hier beschriebenen Methoden können leicht angepasst und auf andere Entwicklungsstadien, Gewebe oder Modellorganismen angewendet werden.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll ist in fünf Schritte unterteilt: (1) Inszenierung der Welpen, (2) Vorbereitung der Pupae für die Bildgebung, (3) Live-Bildgebung der wachsenden Bauchepithelie, (4) Generierung genetischer Mosaike, (5) Datenverarbeitung und -analyse (einschließlich Abschnitten, die beschreiben, wie die Zellorientierungsdynamik anhand von Zellknotenumrissen und Wachstumsdynamik enthoben wird).

1. Inszenierung von Drosophila-Welpen vor der Bildgebung

1. Kulturfliegen des entsprechenden Genotyps auf Standardmedium in Kunststofffläschchen bei 25 °C für 5 Tage (ca. 12 h) nach Dereiablage (AEL).
   HINWEIS: Die Metamorphose beginnt innerhalb der Einschließung der Drittsternlarven in den Pupal-Fall bei 120 h AEL bis 0 h nach Pupariumbildung (APF). Dieser Übergang ist leicht zu erkennen, da Larven die Fütterung und Bewegung stoppen und die Operkuläre Region gebildet wird (Abbildung 1A) bei 0-12 h APF. Das Puparium ist zunächst weich und weiß, härtet aber nach und nach aus und bräunt.
2. Weiße Prepupae (0 h APF) mit einem feuchten Pinsel in eine frische Kunststoffflasche geben. Tiere können je nach versuchsweise bis zum gewünschten Alter bei unterschiedlichen Temperaturen gehalten werden.
   HINWEIS: Die Pupabildung (d. h. Die Verpupation) tritt bei 12 h APF auf, wenn der Kopf und die Anhängsel der erwachsenen Fliege vollständig verfeinert sind (Abbildung 1A). Zu diesem Zeitpunkt ist der Pupal-Fall vollständig von der Pupa getrennt, so dass seine vollständige Entfernung (Abbildung 1A).

2. Vorbereitung von Pupae für Live-Bildgebung

HINWEIS: Nach der Inszenierung werden die Pupae wie unten beschrieben seziert und montiert (siehe auch Abbildung 1).

1. Mit Hilfe der Zange die inszenierten Pupae von der Wand der Durchstechflasche entfernen.
2. Kleben Sie die ventrale Seite jeder Pupa auf einem Glasschlitten, der mit doppelseitigem Klebeband bedeckt ist. Tippen Sie vorsichtig auf die Kopfspiracles (d.h. operkuläre Region) und die dorsale Oberfläche der Pupa mit den Spitzen der Zange, um die Haftung des Pupalgehäuses auf dem Band zu gewährleisten (Abbildung 1A,B).
   HINWEIS: Die dorsale Oberfläche sollte nach oben treten, um die Zerlegung des Gehäuses und die Wiederherstellung der Pupa zu erleichtern.
3. Beginnen Sie die Zerlegung unter einem Stereomikroskop, indem Sie das Operculum vorsichtig mit den Zangen aus dem Puparium entfernen (Abbildung 1C).
4. Legen Sie eine Spitze der Zange in einem flachen Winkel zwischen dem Pupalgehäuse und der Pupa-Oberfläche durch die Operkuläre Öffnung ein. Reißen Sie das Gehäuse seitlich von Kopf zu Schwanz in einer oder mehreren Schaukeln, um zu vermeiden, die Pupa zu kneifen (Abbildung 1D). Falten Sie das rissige Pupal-Gehäuse an den Seiten zurück, während Sie weiter zum hinteren Ende(Abbildung 1E) gehen.
   HINWEIS: Das Pupal-Gehäuse ist ziemlich steif und knackt leicht. Bei hoher Luftfeuchtigkeit oder insbesondere genotypischen Hintergründen wird der Pupal-Fall weicher und das Reißen schwieriger. In diesen Fällen kann das Knacken des Pupal-Gehäuses durch Stechen seiner freien Kanten mit beiden Spitzen der Zange unterstützt werden.
5. Entfernen Sie die Pupilpe aus dem geöffneten Pupal-Gehäuse, indem Sie die Zange vorsichtig unter das Tier einsetzen und vorsichtig nach oben ziehen (Abbildung 1F). Der Pupa klebt an der Spitze der Zange (Abbildung 1G-H).
6. Übertragen Sie die Pupa mit Hilfe der Zange auf eine Glasbodenschale und legen Sie sie auf einen kleinen Tropfen gasdurchlässigem Halocarbonöl ab (Abbildung 1I). Halten Sie die Pupa vorsichtig an der ventralen Seite, um mögliche Gewebeschäden zu vermeiden.
   HINWEIS: Der Tropfen Halocarbonöl muss klein sein, mit einem Durchmesser von etwa weniger als der Hälfte der Länge der Pupa. Eine solche Menge reicht aus, um die Pupilbe durch Kapillarität am Glas zu befestigen und die Optik für Öl-Tauchziele zu korrigieren.
7. Rollen Sie ein Stück nasses Gewebepapier an den Rändern der Schale, um die Feuchtigkeit zu erhalten. Bedecken Sie die Schale, um eine Austrocknung der Pupae während der Bildgebung zu vermeiden.
   HINWEIS: Sowohl weibliche als auch männliche Pupas können für die Bildgebung verwendet werden. Wir empfehlen, die dritten Bauchsegmente (AIII) als Referenz-Bauchmetamere zu verwenden, da sie in Größe, Form und Musterung in beiden Geschlechtern nahezu identisch ist.

3. Live-Bildgebung von wachsenden Bauchepithelien

HINWEIS: Ein invertiertes konfokales Laserscanning-Mikroskop, das mit einem 40x/1,3 NA-Öl-Tauchobjektiv ausgestattet ist, wurde verwendet, um Pupae in verschiedenen Entwicklungsstadien abzubilden.

1. Richten Sie die Pupa über den Öltropfen auf der Glasbodenschale entsprechend der Domäne und dem zu bewertenden Prozess aus (z.B. dorsolateral für die langfristige Live-Bildgebung der frühen Ausdehnung der Dorsalnester oder dorsal, um ihre späte Ausdehnung und Gewebeumgestaltung abzubilden). Siehe Abbildung 1J,K und Abbildung 4.
2. Übertragen Sie die Glasbodenschale mit den montierten Welpen auf die Mikroskopstufe und konzentrieren Sie sich mit dem übertragenen Licht auf die Oberfläche des Bauchbereichs.
   HINWEIS: Auch wenn dieses Protokoll für die Bildgebung an invertierten Mikroskopen optimiert ist, ist es auch möglich, die Bildgebung auf einem aufrechten Mikroskop durchzuführen. In diesem Fall wird die Probe auf der Mikroskopbühne platziert, wobei die Glasbodenfläche nach oben gerichtet ist. Das Halocarbonöl hält jede Pupa an einem Meniskus.
3. Stellen Sie die Erfassungsparameter ein: 1) die Anzahl der Z-Scheiben liegt in der Regel zwischen 20 und 40, um eine entsprechende zweidimensionale (2D) Rekonstruktion der Abdominalepidermis zu ermöglichen; 2) Schrittgröße zwischen jeder Scheibe (z. B. 1 Mikrometer); 3) Zeitintervall für die Aufzeichnung (ein 5-min-Intervall eignet sich für Hochtreueanalysen der Zellorientierungsdynamik); und 4) Rahmenauflösung (z. B. 1024 x 1024).
4. Schalten Sie die entsprechenden Laser ein (d. h. 488 nm und 561 nm, um GFP- bzw. RFP-Fluorophore zu visualisieren) und passen Sie die Laserleistung und die Gain/Offset-Einstellungen an, um die markierten Zellen zu visualisieren. Verwenden Sie die geringstmögliche Laserleistung (im Bereich von 5 % bis 20 %) photobleaching und phototoxicity.
5. Mit der angeschlossenen motorisierten Stufe und der Mikroskop-Multipositionserfassungssoftware können Sie die Position und die entsprechenden Z-Stack-Grenzwerte für mehrere Welpen manuell festlegen.

4. Generierung genetischer Mosaike zum Folgen des Verhaltens von Zellklonen

HINWEIS: Wir verwenden eine mitotische Rekombination, um genetische Mosaike im Bauchepithel über eine standortspezifische Rekombination (FLP/FRT-System^21,22) zu induzieren (Abbildung 2).

1. Querfräuzierliche Weibchen, die ein Hitzeschock-induzierbares Flippase-Transgen (hs-FLP), ein FLP-Erkennungsziel (FRT) an einem bestimmten genomischen Standort (z. B. FRT-Standort an Position 40A am L-Arm des Chromosoms 2) und ein erkennbarer zellulärer Marker (z.B. Ubi-RFP.nls oder Ubi-GFP.nls) distal zur FRT-Stelle, mutierte Männchen, die eine FRT-Stelle am äquivalenten genomischen Standort tragen (Abbildung 2A-C).
   HINWEIS: Autonome und nichtautonome Effekte innerhalb oder außerhalb von Klonen für einen genverlust der Funktion könnten unter Verwendung spezifischer rezessiver Allele untersucht werden, die für die FRT-Site distal sind.
2. Generieren Sie FLP/FRT-Somatische Klone in den Histoblasten durch Hitzeschockbehandlung im dritten Instar-Larvenstadium der Nachkommenschaft des Kreuzes. Dies geschieht durch Untertauchen der Kunststofffläschchen mit den Tieren in einem Wasserbad bei 37 °C für 45 min bis 1 h in der Wanderlarven (LIII) Stufe.
   HINWEIS: Der empfindliche Zeitraum für die mitotische Rekombination ist die G2-Phase des Zellzyklus. Histoblasten werden in G2 während der gesamten Larvenentwicklung verhaftet.
3. Punkte Sie Zwillingsklone für Abwesenheit (d. h. mutierte Zellen) oder verbesserte (d. h. wildtypige Zwillingsfleckenzellen) des fluoreszierenden Proteinmarkers ab 16 h APF ab (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Im Durchschnitt machen 45 min bis 1 h bei 37 °C nur etwa 2 x 3 Zwillingsklone pro Interessengebiet (z. B. das Bauchhemisegment). Pupae mit einer zu hohen Klondichte (z. B. mehr als vier Zwillingsklone pro Hemisegment) sollten aus weiteren quantitativen Analysen verworfen werden.
4. Bei der Klonidentifikation, Bild lebende Welpen in der gewünschten Phase und für die gewünschte Zeit, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.

5. Datenverarbeitung und -analysen

HINWEIS: Die Daten werden mit ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) verarbeitet.

1. Unterscheiden Sie die Zellausrichtungsdynamik von den Umrissen der Zellverknüpfung.
   1. Projizieren Sie die Z-Stack-Slices, die durch konfokale Mikroskopie in 2D erworben wurden, mit der Funktion Maximale Intensitätsprojektion (Maximum Intensity Projection, MIP) von ImageJ.
      HINWEIS: Die Anzahl der Slices pro Stapel sollte auf ein Minimum beschränkt werden, um zu vermeiden, dass Makrophagen unter der Epidermis patrouillieren.
   2. Legen Sie ein planares Koordinatensystem fest, das zuverlässige Gewebemarkierungen (z. B. A/P-Fachgrenzen) für die Analyse jedes Datasets identifiziert (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Die Verwendung der gleichen planaren Referenzen für jeden Datensatz ermöglicht den Vergleich mehrerer Messungen.
   3. Verwenden Sie das OrientationJ-Plugin (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) von ImageJ^23,24 auf lokalen Zellkanten, um qualitative und quantitative Orientierungswerte zu erhalten. Das Plugin rendert farbcodierte Overlays auf Eingabebildern basierend auf lokalen Ausrichtungen und stellt numerische Werte bereit, wenn es im quantitativen Modus verwendet wird (Abbildung 3B'B'' und Abbildung C'C'''').
      HINWEIS: Das OrientationJ-Plugin basiert auf Struktur-Tensoren, 2 x 2-Matrix von Eigenwerten, die aus Gradienten- und Richtungsderivaten abgeleitet sind (siehe Referenzen^23,24 für eine detaillierte Beschreibung).
   4. Verwenden Sie die Option OrientationJ-Verteilung, um Zellenkantenausrichtungen relativ zum planaren Koordinatensystem (d. h. Zellkantenausrichtungskarten)(Abbildung 3B) zu kodieren. Die Distributionsoption befindet sich unter dem Plugin-Menü in ImageJ. Die Einstellungen sind: Gaußsche Fenster sigma = 1 Pixel; Kubischer Spline = Gradient; Mindestkoscherität = 20%; Minimale Energie = 1%. Zellenkantenausrichtungen werden als farbcodiertes Bild mit der Option Farbvermessung des Plugins (Hue = Ausrichtung; Sättigung = Koscherität; und Helligkeit = Eingabebild).
      HINWEIS: Bereiche, die Hintergrundfluoreszenz enthalten, liefern keine Richtungsinformationen und müssen manuell von der Analyse ausgeschlossen werden. Einstellungen mit hohen Schwellenwerten reduzieren die Pixel, die in den verarbeiteten Bildern berücksichtigt werden.
   5. Verwenden Sie die Option OrientationJ Measure, um zelluläre Ausrichtungen und gerichtete Zell-Zell-Ausrichtung (d. h. Koherenz) zu quantifizieren (Abbildung 3C). Die Option Messen befindet sich im Plugin-Menü in ImageJ. Generieren Sie kleine benachbarte, nicht überlappende Bereiche von Interesse (ROIs) mit gleichem Gewicht (64 x 64 Pixel, ca. 20 x 20 m) innerhalb des bereichs, der von den Histoblasts belegt wird (Abbildung 3C).
   6. Berechnen Sie die vorherrschende lokale Ausrichtung (d. h. die gemittelte Ausrichtung zwischen benachbarter Zellen-gemittelten Zellkantenausrichtungskarte) und Koherenz aus den ROIs. Die Software berechnet die vorherrschende Ausrichtung und lokale Koherenz innerhalb jedes ROI (Abbildung 3C).
      ANMERKUNG: Die größten und kleinsten Eigenwerte des von OrientationJ geschätzten Strukturtensors werden verwendet, um die Koherenz als Verhältnis zwischen ihrer Differenz und ihrer Summe zu berechnen. Die Koscherenz wird zwischen Werten von 0 x 1 begrenzt. Der Wert 1 gibt die vollständige Ausrichtungsgleichmäßigkeit an, während ein Wert von 0 isotrope Bereiche ohne Ausrichtung angibt.
   7. Analysieren Sie die berechneten Orientierungs- und Koherenzwerte aus mehreren Bildern mit freien Softwarepaketen wie PAST²⁵. Axialdaten wie Orientierungswerte (in Grad) werden durch Richtungsstatistiken entsprechend beschrieben.
   8. Berechnen Sie über die Software die mittlere Richtung und die kreisförmige Varianz für jeden Satz von Orientierungsverteilungen. Die statistische Signifikanz der Differenz zwischen der Verteilung der Ausrichtungen zwischen verschiedenen Genotypen oder Bedingungen wird mit dem nichtparametrischen Mardia-Watson-Wheeler-Test (W-Test) für gleiche Verteilungen bestimmt.
   9. Berechnen Sie die statistische Signifikanz der Koherenzdifferenz unter Anwendung des nicht-parametrischen Kolmogorov-Smirnov-Tests (K-S-Test). Daten grafisch nach Belieben anzeigen (Polarplots, Balkendiagramme, Boxplots usw.).
2. Wachstumsdynamik von Zellklonen
   HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen das Abrufen von geometrischen und Formparametern für Zellen aus 2D-MIP-Bildern, die den Klon(e) von Interesse enthalten. Für Vergleiche zwischen mehreren Klonen müssen Bilder mit den gleichen Einstellungen erfasst werden.
   1. Segmentieren Sie Klonbereiche, indem Sie ihre Konturen mit dem Werkzeug ImageJ-Freihandauswahl zeichnen.
   2. Berechnen Sie geometrische und Formparameter, indem Sie das Werkzeug Messungen festlegen von ImageJ unter dem Menü Analysieren verwenden. Aktivieren Sie die Optionen Area, Perimeter, Fit Ellipseund Shape Descriptor.
      ANMERKUNG: Dies ermöglicht das Abrufen verschiedener geometrischer Parameter, einschließlich der Fläche (Summe der Pixel innerhalb des Klons), des Umfangs (Summe des Pixels des Klonrahmens), des Seitenverhältnisses (AR, das Verhältnis zwischen der Haupt- und der Nebenachse der am besten passenden Legendre-Ellipse, die in den Klonrahmen eingeschrieben ist) und des Ausrichtungswinkels (d. h. des Winkels der Hauptachse des Klons relativ zur Anteroposterior-Grenze).
   3. Die Berechnung nichtdimensionaler Verhältnisse aus diesen Messungen ruft Formparameter ab. Dazu gehören Rundheit (4 x [Fläche]/x [Hauptachse]²), Rauheit (Solidität - Fläche/Konvexe Fläche) und Zirkularität (4 x [Fläche]/[Umfang]²).
      HINWEIS: Jeder der Formparameter stellt den Grad der Abweichung der Klone von idealen Formen wie einem Kreis oder einem begrenzten konvexen Rumpf dar und sie sind alle zwischen Werten von 0 und 1 begrenzt. Werte gleich 1 weisen auf maximale Symmetrie (d. h. minimale Komplexität) hin.
   4. Analysieren Sie geometrisch und Formparameter zwischen verschiedenen Genotypen oder Bedingungen mithilfe von Microsoft Excel und/oder PAST. Die statistische Signifikanz der Differenz wird anhand eines ungepaarten zweischwanzigen Schüler-T-Tests für gleichen Mittelwert oder des nicht-parametrischen Kolmogorov-Smirnov K-S-Tests für gleiche Verteilungen zwischen Bedingungen ermittelt. Die Daten können beliebig grafisch dargestellt werden (z.B. Balkendiagramme, Boxplots usw.). Siehe Abbildung 5.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Protokoll umfasst die Vorbereitung von Drosophila-Pupae für die langfristige Live-Bildgebung und die Verfahren zur Analyse der Zellorientierung und Wachstumsdynamik der Abdominalepidermis. Durch die Anwendung dieser Methode ist es möglich, hochauflösende Filme der sich entwickelnden Pupae für Zeiträume von bis zu 48 h ohne signifikante Photobleichung oder Phototoxizität zu erzeugen. Schnappschüsse, die die Abdominalepidermis (z.B. Histoblasten und LEC...

Diskussion

Die Langfristige Ordnung ist ein wesentliches Merkmal der meisten funktionellen physiologischen Einheiten. Bei der Morphogenese wird Ordnung durch die Integration komplexer Instruktionen erreicht, die mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision umgesetzt werden. Mehrere und mehrstufige Konsprossen sind in stereotype Gewebeanordnungen integriert.

Polarität und Richtung sind entscheidend für eine geordnete räumliche Anordnung während der Entwicklung. Polarität impliziert Symmetriebruch ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection