Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Resumen

Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.

Resumen

Dentro de los organismos multicelulares, los tejidos y órganos maduros muestran altos grados de orden en las disposiciones espaciales de sus células constituyentes. Un ejemplo notable es dado por la epitelia sensorial, donde las células de las mismas o distintas identidades se reúnen a través de la adhesión de células celulares que muestran patrones planos altamente organizados. Las celdas se alinean entre sí en la misma dirección y muestran una polaridad equivalente a grandes distancias. Esta organización de la epitelia madura se establece en el curso de la morfogénesis. Para entender cómo se logra la disposición plana de la epitelia madura, es crucial realizar un seguimiento de la orientación celular y la dinámica de crecimiento con alta fidelidad espaciotemporal durante el desarrollo in vivo. Las herramientas analíticas sólidas también son esenciales para identificar y caracterizar las transiciones de local a global. La Drosophila pupa es un sistema ideal para evaluar los cambios orientados en la forma celular subyacentes a la morfogénesis epitelial. El epitelio pupal que desarrolla constituye la superficie externa del cuerpo inmóvil, permitiendo imágenes a largo plazo de animales intactos. El protocolo descrito aquí está diseñado para imaginar y analizar los comportamientos celulares a nivel global y local en la epidermis abdominal pupal a medida que crece. La metodología descrita se puede adaptar fácilmente a las imágenes de comportamientos celulares en otras etapas del desarrollo, tejidos, estructuras subcelulares u organismos modelo.

Introducción

Para lograr sus funciones, los tejidos epiteliales dependen plenamente de la organización espacial de sus componentes celulares. En la mayoría de las epitelias, las células no sólo se embalan unas contra otras para crear una capa de adoquines precisa, sino que se orientan en relación con los ejes del cuerpo.

La importancia funcional de la organización precisa del tejido es evidente en la epitelia sensorial, como el oído interno vertebrado y la retina. En el primer caso, el cabello y las células de apoyo se alinean en una dirección axial específica para detectar eficientemente entradas mecánicas como el sonido y el movimiento^1,2. Del mismo modo, la organización espacial de las células fotorreceptores es esencial para lograr propiedades ópticas óptimas por la retina^3. Por lo tanto, el control espacial de la posición y la orientación de la célula es de particular relevancia para la función fisiológica adecuada.

Drosophila es un insecto holometaboloso que sufre una transformación completa de sus estructuras corporales larvales a través de la metamorfosis, dando lugar a sus tejidos adultos. La Drosophila pupa es un excelente modelo para la imagen en vivo no invasiva de una variedad de eventos dinámicos, incluyendo la migración celular del desarrollo^4,división celular y dinámica de crecimiento⁵, contracción muscular⁶, muerte celular⁷, reparación de^{heridas 8}, y orientación celular⁹. En el Drosophilaadulto, el epitelio externo muestra un alto grado de orden. Esto se observa fácilmente en los arreglos de los tricomas (es decir, las protuberancias celulares procedentes de células epiteliales individuales) y las cerdas sensoriales en toda la superficie corporal de la mosca¹⁰. De hecho, los tricomas están alineados en filas paralelas que guían el flujo de aire¹¹. La morfogénesis de la epitelia adulta y la disposición ordenada de las células individuales comienza durante la embriogénesis y culmina durante las etapas pupales. Mientras que en las divisiones celulares embrionarias, intercalaciones, y cambios de forma todos disminuyen el orden^tisular12,¹³, esto se revierte en etapas posteriores de desarrollo, especialmente en etapas pupales, cuando la mosca se acerca a la madurez⁹.

La pupa Drosophila inmóvil proporciona un sistema ideal para evaluar la forma de la célula y los cambios de orientación. La epidermis abdominal pupal presenta ventajas especiales. Mientras que los precursores de la cabeza adulta, tórax, genitales, y apéndices crecen y se modelan desde etapas larvales, los histoblastos, que se integran en la epidermis larvaria, comienzan a crecer y diferenciar sólo en la pupariación¹⁴. Esta característica permite el seguimiento de todos los eventos espaciotemporales involucrados en el establecimiento del orden de los tejidos en su totalidad⁹.

Los histoblastos se especifican durante el desarrollo embrionario en posiciones contralaterales en cada segmento abdominal presuntivo. La epidermis abdominal dorsal del adulto deriva de nidos histoblastos localizados dorsolateralmente presentes en los compartimentos anterior y posterior^15,,16. A medida que los histoblastos se expanden, reemplazando las células epiteliales larvales (LEC), los nidos contralaterales se fusionan en la línea media dorsal formando una hoja confluente^17,18,19,20.

Este trabajo describe 1) una metodología para la disección, el montaje y la imagen en vivo a largo plazo de las drosophila pupae, y 2) métodos analíticos para estudiar la dinámica de la orientación celular y el crecimiento a alta resolución espaciotemporal. Aquí se proporciona un protocolo detallado, que abarca todos los pasos necesarios desde la preparación inicial de las pupas (es decir, la puesta en escena y la imagen) hasta la extracción y cuantificación de las características de direccionalidad y orientación. También describimos cómo inferir propiedades de tejido local del análisis de clones celulares. Todos los pasos descritos son mínimamente invasivos y permiten análisis en vivo a largo plazo. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar y aplicar fácilmente a otras etapas del desarrollo, tejidos u organismos modelo.

Protocolo

NOTA: Este protocolo se divide en cinco pasos: (1) la puesta en escena de las pupas, (2) la preparación de las pupas para la toma de imágenes, (3) imágenes en vivo de la epitelia abdominal en crecimiento, (4) generación de mosaicos genéticos, (5) procesamiento y análisis de datos (incluidas las secciones que describen cómo analizar la dinámica de orientación celular a partir de uniones de contorno celular y la dinámica de crecimiento a partir de clones celulares).

1. Escenificación de Drosophila pupae antes de la toma de imágenes

1. El cultivo vuela el genotipo adecuado en el medio estándar en viales de plástico a 25 oC durante 5 días (12 h) después de la puesta del huevo (AEL).
   NOTA: La metamorfosis comienza dentro del confinamiento de las larvas de la tercera estrella en el caso pupal a las 120 h de AEL hasta 0 h después de la formación del puparium (APF). Esta transición es fácilmente identificable, porque las larvas dejan de alimentarse y moverse y se forma la región opercular(Figura 1A)en 0-12 h APF. El puparium es inicialmente suave y blanco, pero progresivamente se endurece y se broncea.
2. Transfiera prepupae blanco (0 h APF) a un vial de plástico fresco con un pincel humedecido. Los animales se pueden mantener a diferentes temperaturas dependiendo del experimento diseñado hasta la edad deseada.
   NOTA: La formación de Pupa (es decir, pupación) se produce a las 12 h de APF, cuando la cabeza y los apéndices de la mosca adulta están totalmente aspersos (Figura 1A). En este momento el caso pupal está completamente separado de la pupa, permitiendo su eliminación completa (Figura 1A).

2. Preparación de pupas para imágenes en vivo

NOTA: Después de la puesta en escena, las pupas se diseccionan y montan como se describe a continuación (véase también la figura 1).

1. Retire las pupas por etapas de la pared del vial con la ayuda de los fórceps.
2. Pegue el lado ventral de cada pupa en una corredera de vidrio cubierta con cinta adhesiva de doble cara. Toque suavemente los espiráculos de la cabeza (es decir, región opercular) y la superficie dorsal de la pupa con las puntas de los fórceps para asegurar la adhesión de la caja pupal a la cinta (Figura 1A,B).
   NOTA: La superficie dorsal debe estar boca arriba para facilitar la disección del caso y la recuperación de la pupa.
3. Comience la disección bajo un estereomicroscopio retirando suavemente el opérculo del puparium con los fórceps (Figura 1C).
4. Inserte una punta de los fórceps en un ángulo poco profundo entre la caja pupal y la superficie de la pupa a través de la abertura opercular. Desgarrar el estuche de la cabeza a la cola lateralmente en uno o más columpios, evitando pellizcar la pupa (Figura 1D). Doble hacia atrás la caja pupal agrietada a los lados laterales mientras sigue avanzando hacia el extremo posterior (Figura 1E).
   NOTA: El estuche pupal es bastante rígido y se agrieta fácilmente. En caso de alta humedad o en particular fondos genotípicos, el caso pupal se vuelve más suave y el desgarro es más difícil. En estos casos, el agrietamiento de la caja pupal se puede ayudar pinchando sus bordes libres con ambas puntas de los fórceps.
5. Retire la pupa de la caja pupal abierta insertando cuidadosamente los fórceps debajo del animal y tirando suavemente hacia arriba (Figura 1F). La pupa se pegará a la punta de los fórceps(Figura 1G-H).
6. Transfiera la pupa con la ayuda de los fórceps a un plato de fondo de cristal y deposite encima de una pequeña gota de aceite de halocarbono permeable al gas(Figura 1I). Sostenga la pupa suavemente por el lado ventral para evitar cualquier posible daño tisular.
   NOTA: La gota de aceite de halocarbono tiene que ser pequeña, con un diámetro aproximadamente menos de la mitad de la longitud de la pupa. Dicha cantidad es suficiente para adherir la pupa al vidrio por capilaridad y para corregir la óptica para los objetivos de inmersión en aceite.
7. Enrolle un pedazo de papel de tejido húmedo en los bordes del plato para mantener la humedad. Cubra el plato para evitar la deshidratación de las pupas durante la toma de imágenes.
   NOTA: Tanto las pupas femeninas como las masculinas se pueden emplear para la toma de imágenes. Recomendamos emplear los terceros segmentos abdominales (AIII) como metamere abdominal de referencia, ya que es casi idéntico en ambos sexos en términos de tamaño, forma y patrón.

3. Imágenes en vivo de epitelia abdominal en crecimiento

NOTA: Se utilizó un microscopio confocal de escaneo láser invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40x/1.3 NA para crear imágenes de pupas en diferentes etapas del desarrollo.

1. Orientar la pupa sobre la gota de aceite en el plato de fondo de vidrio de acuerdo con el dominio y el proceso a evaluar (por ejemplo, dorsolateralmente para imágenes vivas a largo plazo de la expansión temprana de los nidos dorsales, o dorsalmente para imaginar su expansión tardía y remodelación del tejido). Vea la figura 1J,K y la figura 4.
2. Transfiera el plato de fondo de vidrio que contiene las pupas montadas a la etapa del microscopio y concéntrese en la superficie de la zona abdominal utilizando la luz transmitida.
   NOTA: Incluso si este protocolo está optimizado para la toma de imágenes en microscopios invertidos, también es posible realizar imágenes en un microscopio vertical. En ese caso, la muestra se coloca en la etapa del microscopio con la superficie de fondo de vidrio hacia arriba. El aceite de halocarbono sostiene cada pupa en un menisco.
3. Establecer los parámetros de adquisición: 1) el número de cortes Z suelen estar entre 20 y 40 para permitir la reconstrucción bidimensional (2D) adecuada de la epidermis abdominal; 2) tamaño del paso entre cada rebanada (por ejemplo, 1 micra); 3) intervalo de tiempo para la grabación (un intervalo de 5 minutos es adecuado para análisis de alta fidelidad de la dinámica de orientación celular); y 4) resolución de fotogramas (por ejemplo, 1024 x 1024).
4. Encienda los láseres apropiados (es decir, 488 nm y 561 nm para visualizar los fluoróforos GFP y RFP respectivamente) y ajuste la potencia láser y los ajustes de ganancia/desplazamiento para visualizar las celdas marcadas. Utilice la potencia láser más baja posible (en el rango de 5% a 20%) para minimizar el fotoblancada y la fototoxicidad.
5. Ajuste manualmente la posición y los límites de pila Z adecuados para varias pupas utilizando la etapa motorizada conectada y el software de adquisición de multiposición del microscopio.

4. Generación de mosaicos genéticos para seguir los comportamientos de los clones celulares

NOTA: Empleamos la recombinación mitótica para inducir mosaicos genéticos en el epitelio abdominal a través de la recombinación específica del sitio (sistema FLP/FRT^21,22) ( Figura2).

1. Hembras vírgenes cruzadas que llevan un transgén flippase inducible por choques térmicos (hs-FLP), un sitio de reconocimiento de FLP (FRT) en un lugar genómico específico (por ejemplo, Sitio FRT en la posición 40A en el brazo L del cromosoma 2), y un marcador celular reconocible (por ejemplo, Ubi-RFP.nls o Ubi-GFP.nls) distal al sitio FRT, a los machos mutantes que llevan un sitio FRT en la ubicación genómica equivalente (Figura 2A-C).
   NOTA: Los efectos autónomos y no autónomos dentro o fuera de los clones para cualquier pérdida de función genética podrían estudiarse empleando alelos recesivos específicos distales para el sitio FRT.
2. Generar clones somáticos FLP/FRT en los histoblastos mediante tratamiento de choque térmico en la tercera etapa larval instar de la progenie de la cruz. Esto se realiza sumergiendo los viales de plástico que contienen a los animales en un baño de agua a 37 oC durante 45 min a 1 h en la etapa de larvas errantes (LIII).
   NOTA: El período sensible para la recombinación mitótica es la fase G2 del ciclo celular. Los histoblastos son arrestados en G2 durante todo el desarrollo larvario.
3. Puntuar clones gemelos para detectar ausencias (es decir, células mutantes) o niveles mejorados (es decir, células de doble punto de tipo salvaje) del marcador de proteína fluorescente a partir de 16 h APF(Figura 2D).
   NOTA: En promedio, de 45 min a 1 h a 37 oC representa aproximadamente sólo 2 x 3 clones gemelos por región de interés (por ejemplo, el hemisegmento abdominal). Las pupas que muestren una densidad de clones demasiado alta (por ejemplo, más de cuatro clones gemelos por hemisegment) deben descartarse de otros análisis cuantitativos.
4. Tras la identificación del clon, las pupas vivas de la imagen en la etapa deseada y durante el tiempo deseado como se describe en la sección anterior.

5. Procesamiento y análisis de datos

NOTA: Los datos se procesan mediante ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

1. Distinga la dinámica de orientación de celda de los contornos de unión de celda.
   1. Proyecte las rodajas de pila Z adquiridas por microscopía confocal en 2D utilizando la función de proyección de intensidad máxima (MIP) de ImageJ.
      NOTA: El número de rebanadas por pila debe mantenerse al mínimo para evitar el ruido fuera de foco generado por los macrófagos que patrullan bajo la epidermis.
   2. Establezca un sistema de coordenadas planas que identifique puntos de referencia de tejido fiables (por ejemplo, límites de compartimento A/P) para el análisis de cada conjunto de datos (Figura 3A).
      NOTA: El uso de las mismas referencias planas para cada conjunto de datos permitirá comparar varias mediciones.
   3. Utilice el plugin OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) de ImageJ^23,24 en los bordes de celda local para obtener valores de orientación cualitativos y cuantitativos. El plugin representa superposiciones codificadas por colores en imágenes de entrada basadas en orientaciones locales y proporciona valores numéricos cuando se utiliza en modo cuantitativo(Figura 3B-B'' y Figura C-C'''').
      NOTA: El plugin OrientationJ se basa en tensores de estructura, 2 x 2 matrices de valores propios derivados de gradientes y derivados direccionales (Ver referencias^23,24 para una descripción detallada).
   4. Utilice la opción Distribución OrientationJ para codificar el color de las orientaciones de arista de celda en relación con el sistema de coordenadas planas establecido (es decir, mapas de orientación de borde de celda) (Figura 3B). La opción Distribución se encuentra en el menú del plugin en ImageJ. Los ajustes a emplear son: ventana gaussiana sigma 1 píxel; Spline cúbica: Degradado; Coherencia mínima: 20%; Energía mínima: 1%. Las orientaciones de los bordes de celda se muestran como una imagen codificada por colores que emplea la opción De Survey del plugin (Hue - orientación; Saturación - coherencia; y Brillo - imagen de entrada).
      NOTA: Las áreas que contienen fluorescencia de fondo no proporcionan ninguna información direccional y deben excluirse manualmente del análisis. La configuración de umbral alto reduce los píxeles considerados en las imágenes procesadas.
   5. Utilice la opción OrientationJ Measure para cuantificar las orientaciones celulares y la alineación direccional de celdas de celda (es decir, coherencia) (Figura 3C). La opción Medir se encuentra en el menú del plugin en ImageJ. Generar pequeñas regiones adyacentes no superpuestas de interés (ROI) de peso uniforme (64 x 64 píxeles, alrededor de 20 m x 20 m) dentro del área ocupada por los histoblastos (Figura 3C).
   6. Calcule la orientación local dominante (es decir, la orientación promediada entre el mapa de orientación de borde de celda promediado de celdas vecinas) y la coherencia de los ROI. El software calcula la orientación predominante y la coherencia local dentro de cada ROI (Figura 3C).
      NOTA: Los valores propios más grandes y más pequeños del tensor de estructura estimados por OrientationJ se emplean para calcular la coherencia como la relación entre su diferencia y su suma. La coherencia está limitada entre los valores de 0 a 1. Un valor de 1 indica uniformidad de alineación completa, mientras que un valor de 0 indica áreas isotrópicas sin alineación.
   7. Analice estadísticamente los valores calculados de orientación y coherencia a partir de varias imágenes utilizando paquetes de software libre como PAST²⁵. Los datos axiales, como los valores de orientación (en grados), se describen adecuadamente mediante estadísticas direccionales.
   8. A través del software, calcule la dirección media y la varianza circular para cada conjunto de distribuciones de orientación. La significancia estadística de la diferencia entre la distribución de las orientaciones entre diferentes genotipos o condiciones se determina utilizando la prueba no paramétrica Mardia-Watson-Wheeler (prueba W) para distribuciones iguales.
   9. Calcular la significancia estadística de la diferencia de coherencia aplicando la prueba No paramétrica Kolmogorov-Smirnov (prueba K-S). Mostrar los datos gráficamente como desee (gráficos polares, gráficos de barras, diagramas de caja, etc.).
2. Dinámica de crecimiento a partir de clones celulares
   NOTA: Los pasos siguientes permiten la recuperación de parámetros geométricos y de forma para celdas a partir de imágenes MIP 2D que contienen los clones de interés. Para las comparaciones entre varios clones, las imágenes deben adquirirse con la misma configuración.
   1. Segmente las áreas de clonación dibujando sus contornos con la herramienta Selección a mano alzada ImageJ.
   2. Calcule los parámetros geométricos y de forma utilizando la herramienta Definir medidas de ImageJ en el menú Analizar. Active las opciones Area, Perimeter, Fit Ellipsey Shape Descriptor.
      NOTA: Esto permitirá la recuperación de diversos parámetros geométricos, incluyendo el área (suma de los píxeles dentro del clon), el perímetro (suma del píxel del borde del clon), la relación de aspecto (AR, la relación entre los ejes mayor y menor de la elipse Legendre mejor ajustada inscrita en el borde del clon), y el ángulo de orientación (es decir, el ángulo del eje principal del clon en relación con el límite de unterposteri).
   3. El cálculo de las proporciones no dimensionales a partir de estas mediciones recupera los parámetros de la forma. Estos incluyen la redondez (4 x [área]/x [eje principal]²), la rugosidad (solidez - área/área convexa) y la circularidad (4 x [área]/[perímetro]²).
      NOTA: Cada uno de los parámetros de forma representa el grado de desviación de los clones de las formas ideales, como un círculo o un casco convexo delimitado, y todos están delimitados entre los valores de 0 y 1. Los valores iguales a 1 indican la simetría máxima (es decir, la complejidad mínima).
   4. Analice estadísticamente los parámetros geométricos y de forma entre diferentes genotipos o condiciones mediante Microsoft Excel y/o PAST. La significación estadística de la diferencia se determina utilizando una prueba t del estudiante de dos colas no parificada para la media igual o la prueba K-S Kolmogorov-Smirnov no para la igualdad de distribucións entre condiciones. Los datos se pueden mostrar gráficamente como se desee (por ejemplo, gráficos de barras, diagramas de cuadros, etc.). Vea la figura 5.

Resultados

El protocolo descrito anteriormente abarca la preparación de Drosophila pupae para imágenes en vivo a largo plazo y los procedimientos para el análisis de la orientación celular y la dinámica de crecimiento de la epidermis abdominal. Mediante la aplicación de esta metodología es posible generar películas de alta resolución de las pupas en desarrollo para períodos de hasta 48 h sin fotoblanquido significativo o fototoxicidad. En la Figura 4s...

Discusión

El orden de largo alcance es una característica esencial de la mayoría de las unidades fisiológicas funcionales. Durante la morfogénesis, el orden se logra mediante la integración de instrucciones complejas implementadas con alta precisión temporal y espacial. Las restricciones múltiples y multinivel se integran en los arreglos de tejidos estereotipados.

La polaridad y la direccionalidad son fundamentales para ordenar la disposición espacial durante el desarrollo. La polaridad implica ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection