푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

요약

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

초록

다세포 유기체 내에서, 성숙한 조직 및 기관은 그들의 구성 세포의 공간 배열에 순서의 높은 학위를 표시합니다. 놀라운 예는 동일하거나 명백한 정체성의 세포가 고도로 조직된 평면 패턴을 보여주는 세포 세포 접착을 통해 함께 모이는 감각 에피텔리아에 의해 주어집니다. 셀은 동일한 방향으로 서로 정렬하고 큰 거리에서 동등한 극성을 표시합니다. 성숙한 상피의이 조직은 형태 형성의 과정을 통해 확립됩니다. 성숙한 상피의 평면 배열이 달성되는 방법을 이해하기 위하여는, 생체 내에서 발달 도중 높은 주시부 충실도를 가진 세포 배향 그리고 성장 역학을 추적하는 것이 중요합니다. 또한 로컬-글로벌 전환을 식별하고 특성화하는 데 강력한 분석 도구도 필수적입니다. Drosophila pupa는 상피 형태 형성의 근본적인 지향성 세포 모양 변경을 평가하는 이상적인 시스템입니다. pupal 개발 상피는 움직이지 않는 바디의 외부 표면을 구성합니다, 손상되지 않은 동물의 장기 적인 화상 진찰을 허용하. 여기에서 기술된 프로토콜은 퍼팔 복부 표피에 있는 글로벌 그리고 현지 수준 둘 다에 있는 세포 행동을 심상하고 분석하기 위하여 디자인됩니다. 기술된 방법론은 그밖 발달 단계, 조직, 세포이하 구조물, 또는 모형 유기체에 세포 행동의 화상 진찰에 쉽게 적응될 수 있습니다.

서문

그들의 역할을 달성하기 위해 상피 조직은 세포 구성 요소의 공간 조직에 완전히 의존합니다. 대부분의 에피텔리아에서 세포는 정확한 조약돌 층을 만들기 위해 서로 에피테일뿐만 아니라 신체 축을 기준으로 방향을 조정합니다.

정확한 조직 조직의 기능적 중요성은 척추 동물 내이및 망막과 같은 감각 상피에서 명백합니다. 첫 번째 경우, 머리카락과 지지 셀은 특정 축 방향으로 정렬되어 소리 및 동작^1,,2와같은 기계적 입력을 효율적으로 감지합니다. 유사하게, 광수용체 세포 공간 조직은 망막^3에의해 최적의 광학 적 특성을 달성하기 위해 필수적이다. 세포 위치 및 방향의 공간 제어는 따라서 적절한 생리 기능에 대한 특정 관련성이다.

Drosophila는 변형을 통해 애벌레 신체 구조의 완전한 변형을 겪는 홀로 메타 볼곤충으로 성인 조직을 초래합니다. Drosophila pupa는 발달 세포 이동^4,세포 분열 및 성장 역학^5,근육 수축^6,세포 사멸^7,상처 수리^8,세포 방향⁹등 다양한 동적 사건의 비침습적 라이브 이미징을 위한 우수한 모델이다. 성인 초파리에서외부 상피는 높은 수준의 질서를 보여줍니다. 이것은 쉽게 상피 (즉, 단일 상피 세포에서 유래 세포 돌출)와 비행의 신체 표면^(10)에걸쳐 감각 강모의 배열에 관찰된다. 실제로, 허집은 공기 흐름을 안내 병렬 행에^{정렬된다 11.} 성인 에피탈리아의 형태 형성과 개별 세포의 정렬 된 배열은 배아 발생 중에 시작되고 pupal 단계 동안 절정을 이룬다. 배아 세포 분열에서, intercalations 및 모양은 모두 감소 조직 순서^12,,13,이것은 개발의 나중 단계에서, 특히 푸팔 단계에서, 비행이 성숙에 접근할 때^9.

움직이지 않는 초파리 퍼프는 세포 모양과 배향 변화를 평가하는 이상적인 시스템을 제공합니다. pupal 복부 표피는 특별한 이점을 제시합니다. 성인 머리, 흉부, 생식기 및 부속기의 전구체가 자라고 애벌레 단계에서 패턴화되는 동안, 애벌레 표피에 통합된 히스토블라스트는^14번에서만 성장하고 분화하기 시작한다. 이 기능은 전체^9에서조직 질서의 확립에 관련된 모든 시공간적 사건을 추적 할 수 있습니다.

조직 폭발은 각 추정 복부 세그먼트에 있는 반대 측 위치에 배아 발달 도중 지정됩니다. 성인의 등쪽 복부 표피는 전방 및 후방 구획에 존재하는 등측에 위치한 히스토블라스트^{둥지로부터 유래15,,16.} 히스토블라스트가 팽창함에 따라, 애벌레 상피 세포(LECs)를 대체하며, 상반된 둥지는 등쪽 중간선에서 융합되어^{17,,18,,19,,20을}형성한다.

이 작품은 1) Drosophila pupae의 해부, 장착 및 장기 라이브 이미징을위한 방법론, 2) 높은 주분체 해상도에서 세포 배향 및 성장의 역학을 연구하는 분석 방법을 설명합니다. 상세한 프로토콜은 초기 pupae 준비 (즉, 준비 및 이미징)에서 방향성 및 방향 기능의 추출 및 정량화에 필요한 모든 단계를 포함하는 여기에 제공됩니다. 우리는 또한 세포 클론의 분석에서 국소 조직 특성을 추론하는 방법을 설명합니다. 설명된 모든 단계는 최소 침습적이며 장기 적인 라이브 분석을 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 다른 발달 단계, 조직 또는 모델 유기체에 쉽게 적응하고 적용할 수 있습니다.

프로토콜

참고 : 이 프로토콜은 다섯 단계로 나뉩니다 : (1) 번데기, (2) 이미징을위한 번데기를 준비하고, (3) 성장하는 복부 상피의 라이브 이미징, (4) 유전 모자이크의 생성, (5) 데이터 처리 및 분석 (세포 접합 윤곽선및 세포 클론에서 성장 역학에서 세포 배향 역학을 분석하는 방법을 설명하는 섹션 포함).

1. 화상 진찰의 앞에 초파리 pupae의 발판

1. 배양은 계란 누워 후 5 일 동안 25 °C (±12 h)에서 플라스틱 바이알에서 표준 배지에 적절한 유전자형을 날아다닙니다 (AEL).
   참고 : 변태는 puparium 형성 후 0 시간까지 120 h AEL에서 pupal 케이스로 세 번째 instar 애벌레의 감금 내에서 시작됩니다 (APF). 이러한 전이는 유충이 먹이와 이동을 멈추고 0-12 h APF에서 안방영역이A형성되어 있기 때문에 쉽게 식별할 수 있다. 퍼파륨은 처음에는 부드럽고 흰색이지만 점진적으로 굳어지고 황갈색이 됩니다.
2. 촉촉한 페인트 브러시를 사용하여 신선한 플라스틱 바이알에 흰색 prepupae (0 h APF)를 옮김. 동물은 원하는 나이까지 설계된 실험에 따라 다른 온도로 유지될 수 있다.
   참고 : pupa 형성 (즉, pupation)은 12 시간 APF에서 발생하며, 성인 비행의 머리와 부속제가 완전히 매혹될 때(그림 1A). 이때까지 푸팔 케이스는 강아지로부터 완전히 분리되어 완전한 제거가 허용됩니다(그림 1A).

2. 라이브 이미징을 위한 푸페 준비

참고: 스테이징 후, 번데기는 해부되고 아래에 설명된 대로 장착된다(도 1참조).

1. 집게의 도움으로 유리병의 벽에서 준비 된 강아지를 제거합니다.
2. 양면 끈적끈적한 테이프로 덮인 유리 슬라이드에 각 번데카의 복부 면을 붙입니다. 푸팔 케이스의 부착을 테이프에 부착하기 위해 집게 의 끝과 함께 머리 첨추 (즉, 방과 영역)와 등도 표면을 부드럽게 두드려 테이프에 퍼팔 케이스의 부착을 보장합니다(그림 1A,B).
   참고 : 등쪽 표면은 케이스의 해부와 강아지의 회복을 용이하게하기 위해 위를 향해야합니다.
3. 집게(그림 1C)와함께 puparium에서 피퍼럼을 부드럽게 제거하여 입체 현미경으로 해부를 시작합니다.
4. 포셉의 한 팁을 퍼팔 케이스와 퍼피 표면 사이의 얕은 각도로 코피소 개구부를 통해 삽입합니다. 한 번 이상의 스윙으로 머리에서 꼬리까지 케이스를 찢어 서, 강아지를 꼬집는 것을 피하십시오(그림 1D). 후부 끝까지 계속 진행하면서 금이 간 푸팔 케이스를 측면으로접습니다(그림 1E).
   참고 : pupal 케이스는 매우 단단하고 쉽게 균열됩니다. 습도가 높거나 특히 지질형 배경이 있는 경우 푸팔 케이스가 부드러워지고 찢어지기가 더 어려워집니다. 이러한 경우, 포셉의 두 팁으로 자유 가장자리를 찌르는 것으로 푸팔 케이스의 균열을 도움이 될 수 있습니다.
5. 열린 푸팔 케이스에서 퍼파를 조심스럽게 동물 밑에 끼우고 부드럽게 당기십시오(그림 1F). 퍼프는 집게의 끝에 달라 붙을 것이다(그림 1G−H).
6. 집게의 도움으로 푸파를 유리 바닥 접시에 옮기고 가스 투과성 할로카본 오일의 작은 방울 위에 적증합니다(그림 1I). 가능한 조직 손상을 피하기 위해 복부 측에서 번데기를 부드럽게 잡으십시오.
   참고 : 할로 카본 오일의 방울은 pupa의 길이의 절반 이하의 직경으로 작아야합니다. 이러한 양은 모세 혈관에 의해 유리에 번데기를 부착하고 오일 침지 목적을 위해 광학을 수정하기에 충분하다.
7. 습도를 유지하기 위해 접시 가장자리에 젖은 티슈 페이퍼 조각을 굴려주세요. 이미징 중에 번데의 탈수를 방지하기 위해 접시를 덮습니다.
   참고: 여성과 남성 모두 화상 진찰을 위해 사용될 수 있습니다. 크기, 모양 및 패터닝 측면에서 남녀 모두에서 거의 동일하기 때문에 세 번째 복부 세그먼트 (AIII)를 참조 복부 메타미어로 사용하는 것이 좋습니다.

3. 성장하는 복부 에피탈리아의 살아있는 화상 진찰

참고 : 40x / 1.3 NA 오일 침지 목표를 갖춘 거꾸로 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 다양한 발달 단계에서 번개를 이미지하는 데 사용되었습니다.

1. 도메인 및 공정에 따라 유리 바닥 접시상에 투파를 배향(예를 들어 등쪽 둥지의 조기 팽창의 장기 라이브 이미징을 위해 등쪽, 또는 그들의 후기 팽창 및 조직 리모델링을 이미지화하기 위해 등쪽). 그림 1J, K 및 그림 4를참조하십시오.
2. 장착된 번데오를 함유한 유리 바닥 접시를 현미경 단계로 옮기고 투과된 빛을 사용하여 복부 의 표면에 초점을 맞춥니다.
   참고 : 이 프로토콜이 반전 된 현미경의 이미징에 최적화되어 있더라도 직립 현미경으로 이미징을 수행 할 수도 있습니다. 이 경우, 샘플은 유리 바닥 표면이 위를 향하고 있는 현미경 스테이지에 놓입니다. 할로카본 오일은 반월 상 연골에 각 번들을 보유합니다.
3. 획득 매개 변수 설정: 1) Z-슬라이스의 수는 일반적으로 복부 표피의 적절한 2차원(2D) 재건을 허용하기 위해 20-40 사이; 2) 각 슬라이스(예를 들어, 1 미크론) 사이의 단계 크기; 3) 기록 시간 간격 (5 분 간격은 세포 배향 역학의 높은 충실도 분석에 적합); 및 4) 프레임 해상도(예: 1024 x 1024).
4. 적절한 레이저(예: 488nm 및 561 nm)를 켜서 GFP 및 RFP 형광단을 각각 시각화하고 레이저 전력 및 게인/오프셋 설정을 조정하여 표시된 셀을 시각화합니다. 가능한 최저 레이저 전력 사용(범위 5%-20%) 광표백 및 광독성을 최소화합니다.
5. 부착된 전동 스테이지 및 현미경 다중 위치 수집 소프트웨어를 사용하여 다중 pupae에 대한 위치 및 적절한 Z-stack 한계를 수동으로 설정합니다.

4. 세포 클론의 행동을 따르는 유전 모자이크의 생성

참고 : 우리는 사이트 별 재조합을 통해 복부 상피의 유전 모자이크를 유도하기 위해 유사 분열 재조합을 사용합니다 (FLP / FRT 시스템^21,22)(그림 2).

1. 특정 게놈 위치에서 열 충격 유도성 플립파제 이식유전자(hs-FLP), FLP 인식 표적(FRT) 부위를 운반하는 크로스 버진 암컷(예를 들어, FRT 부위는 염색체 2의 L 암에서 위치 40A에 있고, 인식 가능한 세포 마커(예를 들어, Ubi-RFP.nls 또는 Ubi-GFP.nls)가 FRT 부위에 말단, 동등한 게놈 위치에서 FRT 부위를 운반하는 돌연변이 남성에게(그림2A−C).
   참고: 기능의 유전자 손실에 대한 클론 내 또는 외부 클론 내의 자율적 및 비자율적 효과는 FRT 부위에 특정 열성 대말론을 사용하여 연구 될 수있다.
2. 십자가의 자손의 세 번째 instar 애벌레 단계에서 열 충격 처리에 의해 히스토 블라스트에서 FLP / FRT 체세포 클론을 생성합니다. 이것은 방황하는 유충(LIII) 단계에서 45분 내지 1시간 동안 37°C에서 수조에 동물을 포함하는 플라스틱 바이알을 침수시킴으로써 수행된다.
   참고: 유사분열 재조합에 대한 민감한 기간은 세포 주기의 G2 단계입니다. 히스토블라스트는 전체 애벌레 개발 중에 G2에서 체포된다.
3. 16h APF 이후의 형광 단백질 마커의 부재(즉, 돌연변이 세포) 또는 강화된(즉, 야생형 트윈 스팟 세포) 수준에 대한 트윈 클론점수(도2D).
   참고: 평균적으로 37°C에서 45분에서 1시간까지는 관심 영역당 약 2-3개의 트윈 클론(예: 복부 헤미세그먼트)만 렌더링됩니다. 너무 높은 클론 밀도를 보여주는 Pupae (예를 들어, 헤미 세그먼트 당 4 개 이상의 트윈 클론)는 추가 정량 적 분석에서 폐기해야합니다.
4. 복제 식별 시, 이미지 살아있는 pupae는 이전 섹션에서 설명한 바와 같이 원하는 단계와 원하는 시간 길이에 대해.

5. 데이터 처리 및 분석

참고: 데이터는 ImageJ(imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 처리됩니다.

1. 셀 방향 역학을 셀 접합 윤곽선과 구별합니다.
   1. ImageJ의 최대 강도 프로젝션(MIP) 기능을 사용하여 공초점 현미경으로 획득한 Z 스택 조각을 2D로 투영합니다.
      참고: 표피 아래를 순찰하는 대식세포에 의해 생성된 초점 부족 소음을 피하기 위해 스택당 슬라이스 수를 최소한으로 유지해야 합니다.
   2. 각 데이터 세트의 분석을 위해 신뢰할 수 있는 조직 랜드마크(예: A/P 구획 경계)를 식별하는 평면 좌표 계를 설정합니다(그림3A).
      참고: 각 데이터 집합에 대해 동일한 평면 참조를 사용하면 여러 측정값을 비교할 수 있습니다.
   3. 정성적 및 정량적 방향 값을 얻으려면 로컬 셀 가장자리에 ImageJ^23,24의 OrientationJ 플러그인(bigwww.epfl.ch/demo/orientation/)을 사용합니다. 이 플러그인은 로컬 방향을 기반으로 입력 이미지에 색으로 구분된 오버레이를 렌더링하고 정량 적 모드에서 사용할 때 숫자 값을제공합니다(그림 3B-B'및 그림 C−').
      참고 : OrientationJ 플러그인은 구조 텐서, 그라데이션 및 방향 파생 에서 파생 된 고유 값의 2 x 2 매트릭스를 기반으로합니다 (자세한 설명참조^23,24 참조^참조).
   4. 방향J 분포 옵션을 사용하여 설정된 평면 좌표계(예: 셀 에지 방향 맵)(그림3B)를기준으로 셀 가장자리 방향을 색상 코드로 구분합니다. 배포 옵션은 ImageJ의 플러그인 메뉴에서 찾을 수 있습니다. 사용할 설정은 다음과 같습니다: 가우시안 윈도우 시그마 = 1 픽셀; 입방 스프라인 = 그라데이션; 최소 일관성 = 20%; 최소 에너지 = 1%. 셀 에지 방향은 플러그인의 색상 조사 옵션을 사용하는 색상으로 구분된 이미지로 표시됩니다(색조 = 방향; 포화 = 일관성; 및 밝기 = 입력 이미지).
      참고: 배경 형광이 포함된 영역은 방향 정보를 제공하지 않으며 해석에서 수동으로 제외해야 합니다. 임계값 설정이 높음설정은 처리된 이미지에서 고려되는 픽셀을 줄입니다.
   5. 방향J 측정 옵션을 사용하여 셀룰러 방향 방향 및 방향 셀 정렬(즉, 일관성)(그림3C)을정량화합니다. 측정 옵션은 ImageJ의 플러그인 메뉴에서 찾을 수 있습니다. 히스토블라스트가 차지하는 영역 내에서 균일한 중량(64 x 64 픽셀, 약 20 μm x 20 μm)의 작은 인접한 비중첩 영역(ROI)을 생성합니다(그림3C).
   6. 지배적인 로컬 방향(즉, 인접 셀 평균 셀 가장자리 방향 맵 간의 평균 방향)과 ROI의 일관성을 계산합니다. 이 소프트웨어는 각 ROI 내에서 주요 방향 및 로컬 일관성을 계산합니다(그림3C).
      참고: OrientationJ가 추정한 구조 텐서의 가장 크고 작은 고유값은 그 차이와 합계 사이의 비율로 일관성을 계산하기 위해 사용됩니다. 일관성은 0−1의 값 사이에 경계가 있습니다. 값이 1이면 전체 정렬 균일성을 나타내고 값이 0은 정렬이 없는 등방성 영역을 나타냅니다.
   7. PAST^25와같은 무료 소프트웨어 패키지를 사용하여 여러 이미지에서 계산된 방향 및 일관성 값을 통계적으로 분석합니다. 방향 값(정도)과 같은 축 데이터는 방향 통계에 의해 적절하게 설명됩니다.
   8. 소프트웨어를 통해 각 방향 분포 세트에 대한 평균 방향과 원형 분산을 계산합니다. 상이한 유전자형 또는 조건 사이의 배향분포의 분포의 통계적 유의성은 동등한 분포를 위한 비모문 마르디아-왓슨-휠러 시험(W-test)을 사용하여 결정된다.
   9. 비파라메트릭 콜모고로프-스미르노프 시험(K-S 시험)을 적용한 일관성의 차이에 대한 통계적 유의성을 계산한다. 원하는 대로 데이터를 그래픽으로 표시합니다(극좌표 플롯, 막대형 차트, 상자 플롯 등).
2. 세포 클론에서 성장 역학
   참고: 다음 단계를 통해 관심 있는 클론을 포함하는 2D MIP 이미지에서 셀에 대한 기하학적 및 모양 매개변수를 검색할 수 있습니다. 여러 클론을 비교하려면 동일한 설정으로 이미지를 수집해야 합니다.
   1. ImageJ 프리핸드 선택 도구를 사용하여 윤곽선을 그려 서를 분할합니다.
   2. 분석 메뉴에서 ImageJ의 측정 설정 도구를 사용하여 기하학적 및 모양 매개변수를 계산합니다. 영역, 둘레, 타원 맞추기및 모양 설명자 옵션을 활성화합니다.
      참고: 이렇게 하면 영역(클론 내픽셀의 합), 경계(클론 테두리픽셀의 합), 종횡비(AR, 클론 테두리에 새겨진 가장 적합한 레전드 타원의 주요 축과 마이너 축 간의 비율), 그리고 방향 각도(즉, 클론 경계의 주 축의 각도)를 포함한 다양한 기하학적 매개변수를 검색할 수 있습니다.
   3. 이러한 측정에서 비차원 비율을 계산하여 모양 매개변수를 검색합니다. 여기에는 진원도(4 x [영역]/π x [주요 축]^2),거칠기(견고성 - 면적/볼록 영역) 및 원형(4π x [영역]/[둘레]^2)이포함됩니다.
      주: 각 셰이프 매개변수는 원 또는 경계볼각 선체와 같은 이상적인 모양에서 복제본의 편차 정도를 나타내며 모두 0과 1 값 사이에 경계가 있습니다. 값이 1과 같음은 최대 대칭(즉, 최소 복잡성)을 나타냅니다.
   4. Microsoft Excel 및/또는 PAST를 사용하여 서로 다른 유전자형 또는 조건 간의 기하학적 및 모양 매개변수를 통계적으로 분석합니다. 차이의 통계적 유의는 동등한 평균에 대한 짝이없는 두 꼬리 학생의 t 테스트를 사용하여 결정하거나 조건 사이의 동등한 분포에 대한 비 파라 메트릭 콜모고로프 - 스미르 노프 K-S-시험을. 데이터를 원하는 대로 그래픽으로 표시할 수 있습니다(예: 막대 차트, 상자 플롯 등). 그림 5를참조하십시오.

결과

위에서 설명한 프로토콜은 장기 라이브 이미징을 위한 Drosophila pupae의 준비와 복부 표피의 세포 배향 및 성장 역학의 분석을 위한 절차를 다룹니다. 이 방법론을 적용함으로써 유의한 광표백 또는 광독성 없이 최대 48시간 동안 개발 된 번데의 고해상도 영화를 생성 할 수 있습니다. 상이한 시점과 다른 각도에서 배반되는 번데기에서 복부 표피(예를 들어, 히스토블?...

토론

장거리 주문은 대부분의 기능성 생리학적 단위의 필수 특성입니다. 형태 형성 동안, 순서는 높은 시간 및 공간 정밀도로 구현 된 복잡한 명령의 통합을 통해 달성된다. 다중 및 다단계 구속은 스테레오타입 조직 배열로 통합됩니다.

극성과 지향성은 개발 중에 정렬된 공간 배열에 매우 중요합니다. 극성은 개발 중에 대칭 파괴를 의미합니다. 비대칭의 성취는 배아 전방 후방 (A...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection