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要約

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。

要約

多細胞生物の中では、成熟した組織や器官は、その構成細胞の空間的配置において高い秩序を示す。顕著な例は、同一または異なる同一の同一のアイデンティティの細胞が非常に組織化された平面パターンを示す細胞細胞接着を介して一緒に持ち込まれる感覚上皮によって与えられる。セルは互いに同じ方向に整列し、大きな距離で同等の極性を表示します。成熟した上皮のこの組織は、形態形成の過程で確立される。成熟した上皮の平面配置がどのように達成されるのかを理解するためには、生体内での発達中に高い時空間的忠実度を持つ細胞の配向と成長ダイナミクスを追跡することが重要である。また、ローカルからグローバルへの移行を特定して特徴付けるためには、堅牢な分析ツールも不可欠です。ショウジョウバエウは、上皮形態形成の根底にある配向細胞形状の変化を評価するのに理想的なシステムである。上皮を発達するプパルは、不移動体の外部表面を構成し、無傷の動物の長期イメージングを可能にする。ここで説明するプロトコルは、成長するに従って、プパル腹部表皮のグローバルレベルと局所レベルの両方で細胞の挙動を画像化し、分析するように設計されています。記載された方法論は、他の発達段階、組織、細胞内構造、またはモデル生物における細胞行動のイメージングに容易に適応することができる。

概要

その役割を達成するために、上皮組織は細胞成分の空間的組織に完全に依存している。ほとんどの上皮では、細胞は正確な石畳層を作り出すために互いに詰め合われているだけでなく、身体の軸に対して自分自身を向いています。

正確な組織組織の機能的重要性は、脊椎動物の内耳や陰部などの感覚上皮において明らかである。最初のケースでは、ヘアセルと支持セルは特定の軸方向に整列し、音や動き11、22などの機械的入力を効率的に感知します。同様に、感光体細胞空間組織は、レチナ3による最適な光学特性を達成するために不可欠である。細胞の位置と向きの空間的制御は、したがって、適切な生理機能のための特に関連性のである。

ショウジョウバエは、変態を通じて幼虫の体構造の完全な変換を受け、その成体組織を生み出す正形虫である。ショウジョウバエプは、発達細胞遊走4、細胞分裂および成長ダイナミクス5、筋収縮6、細胞死7、創傷修復8、および細胞配向9を含む様々な動的事象の非侵襲的なライブイメージングのための優れたモデルである。成体ショウジョウバエでは、外的上皮は高度な秩序を示す。これは、毛状突起(すなわち、単一の上皮細胞から生じる細胞突起)およびハエの体表面10の上の感覚毛の配置に容易に観察される。実際、毛状突起は、空気流11を導く平行な行に整列されている。成体上皮の形態形成と個々の細胞の秩序ある配置は、胚発生の間に始まり、プパル段階で最高潮に達する。胚細胞分裂、インターカレーション、および形状変化はすべて組織オーダー12、13を減少させるが、13これは発達の後期段階で、特に子犬の段階では、フライが成熟期9に近づくと戻される。

不移動性ショウジョウバの子犬は、細胞の形状および向きの変化を評価するのに理想的なシステムを提供する。パパル腹部表皮は特別な利点を提示する。成人頭部、胸郭、生殖器、および付属物の前駆体が成長し、幼虫段階からパターン化される一方で、幼虫表皮に統合されたヒストラストは、子犬14時にのみ成長し、分化し始める。この機能は、組織の秩序の確立に関与するすべての時空間的事象を完全に追跡することを可能にする 9.

ヒストブラストは、各推定腹部セグメントの対側位置で胚発生中に指定される。成人の背部腹部表皮は、前部および後部区画15,16,16に存在する背部位置ヒストブラスト巣に由来する。ヒスト芽細胞が拡大するにつれて、幼虫上皮細胞(LED)を置き換えると、反側の巣は、コンフルエントシート17、18、19、20,19,を形成する背側中線で融合する。17,20

この研究は、1)ショウジョウバエの解剖、取り付け、および長期ライブイメージングのための方法論、および2)高い時空間分解能における細胞の向きおよび成長のダイナミクスを研究する分析方法を説明する。ここでは、初期の子犬の準備(すなわち、ステージングおよびイメージング)から方向性および方向の特徴の抽出および定量化に必要なすべてのステップをカバーする詳細なプロトコルが提供されています。また、細胞クローンの解析から局所組織特性を推測する方法についても述べている。記載されているすべてのステップは、最小限の侵襲的であり、長期的なライブ分析を可能にします。ここで説明する方法は、容易に適応し、他の発達段階、組織、またはモデル生物に適用することができる。

プロトコル

注:このプロトコルは、(1)子犬をステージングし、(2)イメージングのための子犬を準備し、(3)成長する腹部上皮のライブイメージング、(4)遺伝的モザイクの生成、(5)データ処理および分析(細胞接合の概要および細胞クローンからの成長ダイナミクスからのダイナミクスと成長ダイナミクスから細胞の配向を分析する方法を説明するセクションを含む)に分けられる。

1. イメージング前のショウジョウバエのステージング

  1. 培養は、産卵後5日間(±12時間)でプラスチックバイアル中のプラスチックバイアル中の標準培地上の適切な遺伝子型のハエ(AEL)の後に5日間(±12時間)を行う。
    注:変態は、パパリウム形成(APF)後0時間まで120時間AELで第3インスター幼虫の閉じ込めの中で始まる。この遷移は、幼虫が摂食や移動を停止し、そして、オーパーキュラー領域が形成されるので、容易に識別可能である(図1A)0-12h APFで。A子犬は最初は柔らかく白いですが、徐々に硬化し、日焼けします。
  2. 湿らせた絵筆を使用して、白いプレプパエ(0 h APF)を新鮮なプラスチックバイアルに移します。動物は、所望の年齢まで設計された実験に応じて異なる温度で保つことができます。
    注:子犬の形成(すなわち、子犬)は、大人のハエの頭部と付属物が完全にエバーチである12時間APFで起こる(図1A)。この時までに、プパルケースは完全に子犬から分離され、完全な除去を可能にする(図1A)。

2. ライブイメージングのための子犬の準備

注: ステージング後、以下に説明するとおりに子犬が解剖され、マウントされます(図1も参照)。

  1. 鉗子の助けを借りてバイアルの壁からステージの子犬を取り除きます。
  2. 両面粘着テープで覆われたガラススライドに、各子犬の腹側を接着します。頭の尖塔(すなわち、大口領域)と、パパルケースのテープへの接着を保証するために鉗子の先端を持つ子犬の後面を静かにタップする(図1A,B)。
    注:後面は、ケースの解剖と子犬の回復を容易にするために直面する必要があります。
  3. 鉗子で、小腹からオペルキュラムを静かに取り除くことによって、実体顕微鏡下で解剖を開始する(図1C)。
  4. 口の開き口を通して、プパルケースと子犬表面の間の浅い角度で鉗子の1つの先端を挿入する。1つ以上のスイングで頭から尾までケースを横に引き裂き、子犬をつままないようにします(図1D)。後端に進み続ける際に、ひび割れたプパルケースを側面に折り返します(図1E)。
    注意:プパルケースは非常に硬く、簡単に割れます。高湿度または特に遺伝子質背景の場合、プパルケースが柔らかくなり、引き裂きがより困難になる。これらの場合、プパルケースの割れ目は、鉗子の両方の先端でその自由なエッジを刺すことによって助けることができます。
  5. 動物の下に鉗子を慎重に挿入し、穏やかに引き上げて、開いたプパルケースから子犬を取り除く(図1F)。子犬は鉗子の先端に付着します(図1G-H)。
  6. 鉗子の助けを借りて、ガラス底皿に子犬を移し、ガス透過性のハロカーボンオイルの小さな滴の上に堆積させる(図1I)。組織の損傷を避けるために、腹側で子犬を優しく保持します。
    注:ハロカーボンオイルの滴は小さく、直径は子犬の約半分の長さ以下でなければなりません。このような量は、毛細血管によってガラスに子犬を付着させ、油浸着目的のために光学を補正するのに十分である。
  7. 湿ったティッシュペーパーを皿の端に転がして湿度を維持します。イメージング中に子犬の脱水を避けるために皿を覆います。
    注:女性と男性の両方の子犬は、イメージングに使用することができます。3番目の腹部セグメント(AIII)は、サイズ、形状、パターニングの点で男女ともほぼ同一であるため、参照腹部メタメアとして使用することをお勧めします。

3. 成長する腹部上皮の生画像化

注:40x/1.3 NA油浸出目的を備えた反転レーザースキャン共焦点顕微鏡を使用して、異なる発達段階での子犬を画像化しました。

  1. ドメインと評価されるプロセスに応じてガラス底皿の油滴の上に子犬を配向させる(例えば、後ろ座の巣の早期拡張の長期的なライブイメージングのためにドーソレータ、または遅い膨張および組織改修をイメージするためにドール)。図 1J,Kおよび図 4を参照してください。
  2. 取り付けられた子犬を含むガラス底皿を顕微鏡ステージに移し、透過光を使用して腹部の表面に焦点を合わせます。
    注: このプロトコルが反転顕微鏡でのイメージングに最適化されている場合でも、アップライト顕微鏡でイメージングを実行することもできます。その場合、サンプルは、ガラス底面を上に向けて顕微鏡ステージに置かれます。ハロカーボンオイルは、半月板に各子犬を保持します。
  3. 取得パラメータを設定する:1)Zスライスの数は、通常、腹部表皮の適切な2次元(2D)再構成を可能にするために20-40の間である。2)各スライス間のステップサイズ(例えば、1ミクロン)。3)記録の時間間隔(5分間隔は、細胞配向ダイナミクスの高忠実度分析に適しています)。4)フレーム解像度(例えば、1024 x 1024)。
  4. 適切なレーザー(すなわち、488 nmと561 nmでそれぞれGFPとRFPフルオロフォアを可視化する)をオンにし、レーザーパワーとゲイン/オフセット設定を調整してマークされた細胞を視覚化します。可能な限り低いレーザーパワー(5%-20%)の範囲を使用してください。光の漂白と光毒性を最小限に抑えます。
  5. 取り付けられた電動ステージと顕微鏡のマルチポジション取得ソフトウェアを使用して、複数の子犬の位置と適切なZスタック制限を手動で設定します。

4. 細胞クローンの挙動に従う遺伝的モザイクの生成

注:部位特異的な組換え(FLP/FRTシステム21,22)を介して腹部上皮に遺伝的モザイクを誘導するために有21,糸組換えを採用しています(図2)。22

  1. 熱ショック誘導型フリッピンゼトランスジーン(hs-FLP)を持つクロスバージンメス、特定のゲノム位置にあるFLP認識ターゲット(FRT)部位(例えば、 染色体2のLアームにおけるFRT部位は、FRT部位に遠位する認識可能な細胞マーカー(例えば、Ubi-RFP.nlsまたはUbi-GFP.nls)と、FRT部位を同等のゲノム位置に運ぶ変異性雄に対する(図2A−C)。
    注:機能の任意の遺伝子喪失のためのクローン内または外部クローン内の自律的および非自律的な効果は、FRT部位に遠位特異的な劣性対立遺伝子を使用して研究することができる。
  2. 十字架の子孫の第3インスター幼虫段階で熱ショック処理によってヒストブラストでFLP/FRT体性クローンを生成する。これは、37°Cの水浴中に動物を含むプラスチックバイアルを、放浪幼虫(LIII)段階で45分〜1時間水浴に浸すことによって行われる。
    注: 有糸組換えの感度は、細胞周期のG2フェーズです。ヒストラストは幼虫の発達中にG2で逮捕される。
  3. 欠失のためのツインクローン(すなわち、変異細胞)または増強された(すなわち、野生型双点細胞)16h APF以降の蛍光タンパク質マーカーのレベルをスコアする(図2D)。
    注: 37 °C で平均 45 分から 1 h の場合、対象領域 (例: 腹部のヘミ セグメント) につき約 2~3 個のツイン クローンしかレンダリングされません。高いクローン密度を示すpupae(例えば、ヘミセグメント当たり4つ以上の双子クローン)は、さらなる定量的分析から廃棄されるべきである。
  4. クローン同定の際、画像生きている子犬は、所望の段階で、そして前のセクションで説明したように所望の時間の長さである。

5. データ処理と分析

メモ: データは ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) を使用して処理されます。

  1. セルの方向のダイナミクスとセルの接合点のアウトラインを区別します。
    1. ImageJ の最大強度投影(MIP) 関数を使用して、共焦点顕微鏡で取得した Z スタック スライスを 2D に投影します。
      注: 表皮の下をパトロールするマクロファージによって発生する焦点外のノイズを避けるために、スタックあたりのスライスの数を最小限に抑える必要があります。
    2. 各データセットの分析のために、信頼できる組織ランドマーク(例えば、A/Pコンパートメント境界)を特定する平面座標系を設定します(図3A)。
      注: 各データセットに同じ平面参照を使用すると、複数の測定値を比較できます。
    3. 定性的および定量的な方向の値を取得するには、ImageJ23のOrientationJプラグイン (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/)を使用して、ローカルセルの端に24を指定します。このプラグインは、ローカルの向きに基づいて入力イメージに色分けされたオーバーレイをレンダリングし、定量モードで使用すると数値を提供します(図3B-B'と図C-C''')。
      注意:OrientationJプラグインは構造テンソル、2 x 2の固有値の行列に基づいています(詳細な説明については、参照23、24,24を参照してください)。
    4. OrientationJ 分布オプションを使用して、設定された平面座標系(つまり、セルエッジ方向マップ)に対するセルエッジの向きを色分けします(図3B)。配布オプションは、ImageJ のプラグインメニューの下にあります。使用する設定は次のとおりです: ガウスウィンドウシグマ = 1 ピクセル;立方体スプライン = グラデーション;最小コヘレンシー = 20%最小エネルギー = 1%セルエッジの向きは、プラグインのカラーサーベイオプション(Hue = 方向)を使用して色分けされた画像として表示されます。彩度 = コヘレンシー;明るさ = 入力画像)。
      注: バックグラウンド蛍光を含む領域は、方向情報を提供せず、手動で分析から除外する必要があります。しきい値が高い設定では、処理された画像で考慮されるピクセルを減らします。
    5. [OrientationJ Measure]オプションを使用して、細胞の向きと方向セルの位置合わせ (コヒーレンシー) を定量化します (図 3C)。[計測]オプションは ImageJ のプラグインメニューにあります。ヒストブラストが占める領域内に、均一な重み(64 x 64ピクセル、約20μm×20μm)の、隣接する対象外の小さな領域(ROI)を生成する(図3C)。
    6. 主要なローカル方向(すなわち、隣接するセル間の平均方向-平均されたセルエッジ方向マップ)とROIからの一貫性を計算します。ソフトウェアは、各ROI内の主な方向と局所一貫性を計算します(図3C)。
      メモ: OrientationJによって推定される構造テンソルの最大および最小の固有値は、その差とその合計の比率として一貫性を計算するために使用されます。一貫性は 0 -1 の値の間に境界されます。値 1 は完全な整列均一性を示し、0 の場合は、線形のない等方性領域を示します。
    7. PAST25などのフリーソフトウェア パッケージを使用して、複数の画像から計算された方向と一貫性の値を統計的に分析します。方向の値(度)などの軸方向データは、方向統計によって適切に記述されます。
    8. ソフトウェアを使用して、方向分布の各セットの平均方向と円形分散を計算します。異なる遺伝子型または条件間の向きの分布の間の差の統計的有意性は、等分布のためのノンパラメトリックマルディア・ワトソン・ウィーラー検定(W検定)を使用して決定される。
    9. 非パラメトリック・コルモゴロフ・スミルノフ検定(K-S検定)を適用した一貫性の差の統計的有意性を計算します。必要に応じてデータをグラフィカルに表示します(極座標プロット、棒グラフ、箱ひげ図など)。
  2. 細胞クローンからの成長ダイナミクス
    注: 次の手順では、対象のクローンを含む 2D MIP イメージからセルのジオメトリパラメータと形状パラメータを取得できます。複数のクローン間の比較を行うには、同じ設定で画像を取得する必要があります。
    1. ImageJフリーハンド選択ツールを使用して、コンターを描画してクローン領域をセグメント化します。
    2. [解析] メニューの ImageJ の[計測値の設定] ツールを使用して、幾何学および形状のパラメータを計算します。[領域]、[周長]、[楕円にフィット]、および[シェイプ記述子]の各オプションをアクティブにします。
      注: 領域(クローン内のピクセルの合計)、周囲(クローン境界のピクセルの合計)、アスペクト比(AR、クローン境界に刻まれた最もフィットするLegendre楕円の長軸と短軸の比率)、および方向の角度(すなわち、前世に対するクローンの主軸の角度)を含む多様な幾何学的パラメータを検索することができます。
    3. これらの測定値から非次元比を計算すると、形状パラメータが取得されます。これには、丸み(4 x [面積]/π x [長軸]2)、粗さ(固さ - 面積/凸面積)、円形度(4π x [面積]/[周長]2)が含まれます。
      注: 各シェイプ パラメータは、円や境界凸状ハルなどの理想的な形状からのクローンの偏差を表し、すべて 0 と 1 の間に境界されます。1 の値は、最大対称性(つまり、最小の複雑さ)を示します。
    4. Microsoft Excel や PAST を使用して、異なる遺伝子型または条件間の幾何学的および形状のパラメータを統計的に分析します。差の統計的有意性は、等平均の対ペア化二尾の学生のt検定または条件間の等分布のための非パラメトリックなコルモゴロフ・スミルノフK-S検定を使用して決定される。データは、必要に応じてグラフィカルに表示できます(棒グラフ、箱ひげ図など)。図 5を参照してください。

結果

上述のプロトコルは、長期のライブイメージングのためのショウジョウバエの調製と、腹部表皮の細胞オリエンテーションおよび成長ダイナミクスの分析手順をカバーする。この方法論を適用することにより、著しい光漂白や光毒性を伴わない最大48時間の開発中の子犬の高解像度ムービーを生成することが可能です。異なる時点での腹部表皮(例えば、ヒスト?...

ディスカッション

長距離オーダーは、ほとんどの機能生理学的単位の必須特性である。形態形成の間、秩序は高い時間的および空間的精密と実施される複雑な命令の統合によって達成される。複数および多レベルの制約は、ステレオタイプ組織の配置に統合されています。

開発時の秩序空間配置には極性と方向性が重要です。極性は、発達中の対称性の破断を意味します。非対称性の達?...

開示事項

著者は利害の対立を持っていません。

謝辞

マルティン・ブランコ研究所のメンバーに感謝申し上げられる。また、ニック・タポン(英国ロンドン・クリック研究所)、ブルーミントン・ストック・センター(米国インディアナ大学)、FlyBase(ショウジョウバエ遺伝子注釈用)にも感謝します。フェデリカ・マンジョーネはJAE-CSICの博士研究員によって支えられました。マルティン・ブランコ研究所は、プログラム・エスタタル・デ・フォメント・デ・ラ・インベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクニカ・デ・エクセレンシア(BFU2014-57019-PおよびBFU2017-82876-P)とフンダシオン・ラモン・アレススから資金提供を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Analysis Software-ImageJAnalyzing data
DrosophilaAtpa::GFP-Strains employed for data collection
Drosophilahsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls-Strains employed for data collection
Dumont 5 ForcepsFST11251-201.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom PlatesMat TekP35G-0.170-14-CMounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27Sigma-Aldrich9002-83-9mounting pupae
Inverted Confocal microscopeZeissLSM700Data collection
StereomicroscopeLeicaDFC365FXVisualization of the pupae during dissection

参考文献

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