Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Resumo

Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.

Resumo

Dentro de organismos multicelulares, tecidos e órgãos maduros apresentam altos graus de ordem nos arranjos espaciais de suas células constituintes. Um exemplo notável é dado pela epitélio sensorial, onde células das mesmas ou distintas identidades são reunidas através da adesão celular mostrando padrões planares altamente organizados. As células se alinham umas com as outras na mesma direção e exibem polaridade equivalente em grandes distâncias. Esta organização da epithelia madura é estabelecida ao longo da morfogênese. Para entender como o arranjo planar da epitélia madura é alcançado, é fundamental acompanhar a orientação celular e a dinâmica de crescimento com alta fidelidade espostetal durante o desenvolvimento in vivo. Ferramentas analíticas robustas também são essenciais para identificar e caracterizar transições locais para globais. A drosophila pupa é um sistema ideal para avaliar mudanças de forma celular orientadas subjacentes à morfogênese epitelial. O epitélio em desenvolvimento pupal constitui a superfície externa do corpo imóvel, permitindo imagens de longo prazo de animais intactos. O protocolo descrito aqui é projetado para imagem e análise de comportamentos celulares em níveis globais e locais na epiderme abdominal pupal à medida que cresce. A metodologia descrita pode ser facilmente adaptada à imagem de comportamentos celulares em outros estágios de desenvolvimento, tecidos, estruturas subcelulares ou organismos modelo.

Introdução

Para alcançar seus papéis, os tecidos epiteliais dependem totalmente da organização espacial de seus componentes celulares. Na maioria das epitélios, as células não são apenas embaladas umas contra as outras para criar uma camada precisa de paralelepípedos, mas elas se orientam em relação aos eixos do corpo.

A importância funcional da organização precisa do tecido é óbvia na epitélio sensorial, como o ouvido interno vertebrado e a retina. No primeiro caso, as células de cabelo e suporte se alinham em uma direção axial específica para sentir eficientemente entradas mecânicas como som e movimento^1,,2. Da mesma forma, a organização espacial celular fotorreceptora é essencial para alcançar propriedades ópticas ideais pela retina³. O controle espacial da posição e orientação celular é, portanto, de particular relevância para a função fisiológica adequada.

Drosophila é um inseto holometaboloso que sofre uma transformação completa de suas estruturas corporais larvais através da metamorfose, dando origem aos seus tecidos adultos. A pupa Drosophila é um excelente modelo para a imagem ao vivo não invasiva de uma variedade de eventos dinâmicos, incluindo migração celular de desenvolvimento⁴, divisão celular e dinâmica de crescimento^5,contração muscular^6,morte celular^7,reparação de feridas⁸e orientação celular⁹. Na Drosophilaadulta, o epitélio externo mostra um alto grau de ordem. Isso é facilmente observado nos arranjos de trichomes (ou seja, saliências celulares originárias de células epiteliais únicas) e cerdas sensoriais por toda a superfície corporal da mosca¹⁰. De fato, as trichomes estão alinhadas em linhas paralelas que guiam o fluxo de ar¹¹. A morfogênese da epitélio adulta e o arranjo ordenado das células individuais começa durante a embriogênese e culmina durante os estágios pupais. Enquanto em divisões celulares de embriões, intercalações e alterações de forma todas as alterações diminuem a ordem tecidual^12,13, isso é revertido em estágios posteriores de desenvolvimento, especialmente em estágios pupais, quando a mosca se aproxima da maturidade⁹.

A pupa drosophila imóvel fornece um sistema ideal para avaliar as mudanças de forma e orientação celular. A epiderme abdominal pupal apresenta vantagens especiais. Enquanto os precursores da cabeça adulta, tórax, genitália e apêndices crescem e se padronizam a partir de estágios larvais, os histoblastos, que são integrados à epiderme larval, começam a crescer e^{diferenciar-se apenas}na pupariação 14 . Este recurso permite o acompanhamento de todos os eventos espesso envolvidos no estabelecimento da ordem tecidual em sua totalidade⁹.

Os histoblastos são especificados durante o desenvolvimento embrionário em posições gerlaterais em cada segmento abdominal presuntivo. A epiderme abdominal dorsal do adulto deriva dos ninhos de histoblasto situados dorsolateramente presentes nos compartimentos anterior e posterior^15,16. À medida que os histoblastos se expandem, substituindo as células epiteliais larvais (LECs), os ninhos contralaterais se fundem na linha média dorsal formando uma folha confluente^{17,,18,19,,20}.

Este trabalho descreve 1) uma metodologia de dissecção, montagem e imagem ao vivo de longo prazo dos métodos analíticos Drosophila pupae e 2) para estudar a dinâmica da orientação celular e do crescimento em alta resolução espostetorial. Aqui é fornecido um protocolo detalhado, abrangendo todas as etapas necessárias desde a preparação inicial do pupae (ou seja, encenação e imagem) até a extração e quantificação das características de direcionalidade e orientação. Também descrevemos como inferir propriedades de tecidos locais a partir da análise de clones celulares. Todas as etapas descritas são minimamente invasivas e permitem análises ao vivo de longo prazo. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados e aplicados a outros estágios de desenvolvimento, tecidos ou organismos modelo.

Protocolo

NOTA: Este protocolo é dividido em cinco etapas: (1) encenar a pupae, (2) preparar a pupae para imagem, (3) imagens vivas da epitélio abdominal crescente, (4) geração de mosaicos genéticos, (5) processamento e análise de dados (incluindo seções descrevendo como analisar a dinâmica de orientação celular a partir de contornos de junção celular e dinâmica de crescimento de clones celulares).

1. Encenação de Drosophila pupae antes da imagem

1. A cultura voa do genótipo adequado no meio padrão em frascos plásticos a 25 °C durante 5 dias (±12 h) após a colocação do ovo (AEL).
   NOTA: A metamorfose começa dentro do confinamento das larvas de terceira instar no caso pupal às 120 h AEL até 0h após a formação do puparium (APF). Esta transição é facilmente identificável, pois as larvas param de se alimentar e se movem e a região opercular é formada(Figura 1A) a 0-12 h APF. O puparium é inicialmente macio e branco, mas progressivamente endurece e bronzeia.
2. Transfira prepupae branco (0 h APF) para um frasco de plástico fresco usando um pincel umedecido. Os animais podem ser mantidos em temperaturas diferentes, dependendo do experimento projetado até a idade desejada.
   NOTA: A formação de pupa (ou seja, pupação) ocorre às 12h APF, quando a cabeça e os apêndices da mosca adulta são totalmente sempreados(Figura 1A). A essa altura, o caso pupal está totalmente separado da pupa, permitindo sua remoção completa(Figura 1A).

2. Preparando pupas para imagens ao vivo

NOTA: Após a encenação, as pupas são dissecadas e montadas conforme descrito abaixo (ver também Figura 1).

1. Remova pupas encenadas da parede do frasco com a ajuda dos fórceps.
2. Cole o lado ventral de cada pupa em um slide de vidro coberto com fita adesiva de dois lados. Bata suavemente nos espigões da cabeça (ou seja, região opercular) e na superfície dorsal da pupa com as pontas dos fórceps para garantir a adesão da caixa pupal à fita (Figura 1A,B).
   NOTA: A superfície dorsal deve enfrentar-se para facilitar a dissecação do caso e a recuperação da pupa.
3. Inicie a dissecção sob um estereómico removendo suavemente o operculum do pupário com as fórceps(Figura 1C).
4. Insira uma ponta das fórceps em um ângulo raso entre a caixa pupal e a superfície da pupa através da abertura opercular. Rasgue a caixa da cabeça à cauda lateralmente em um ou mais balanços, evitando beliscar a pupa (Figura 1D). Dobre a caixa de pupal rachada para os lados laterais enquanto você continua procedendo para a extremidade posterior(Figura 1E).
   NOTA: O caso pupal é bastante rígido e racha facilmente. Em caso de alta umidade ou, em particular, fundos genotipos, o caso pupal fica mais macio e rasgar é mais difícil. Nestes casos, a rachadura do caso pupal pode ser ajudada picando suas bordas livres com ambas as pontas dos fórceps.
5. Remova a pupa da caixa pupal aberta inserindo cuidadosamente os fórceps sob o animal e puxando suavemente para cima(Figura 1F). A pupa grudará na ponta dos fórceps (Figura 1G−H).
6. Transfira a pupa com a ajuda dos fórceps para um prato de fundo de vidro e deposite-a em cima de uma pequena gota de óleo de halocarboneto permeável a gás(Figura 1I). Segure a pupa suavemente pelo lado ventral para evitar possíveis danos teciduais.
   NOTA: A gota de óleo de halocarbono deve ser pequena, com diâmetro aproximadamente inferior à metade do comprimento da pupa. Tal quantidade é suficiente para aderir a pupa ao vidro pela capilaridade e corrigir a óptica para objetivos de imersão de óleo.
7. Enrole um pedaço de papel de tecido molhado nas bordas do prato para manter a umidade. Cubra o prato para evitar a desidratação da pupae durante a imagem.
   NOTA: Tanto a pupa feminina quanto a fêmea podem ser empregadas para a imagem. Recomendamos a contratação do terceiro segmento abdominal (AIII) como metameração abdominal de referência, uma vez que é quase idêntica em ambos os sexos em termos de tamanho, forma e padronização.

3. Imagem ao vivo da epitélio abdominal crescente

NOTA: Um microscópio confocal de escaneamento a laser invertido equipado com um objetivo de imersão de óleo 40x/1.3 NA foi usado para a imagem de pupas em diferentes estágios de desenvolvimento.

1. Oriente a pupa sobre a gota de óleo na placa de fundo de vidro de acordo com o domínio e o processo a ser avaliado (por exemplo, dorsolateralmente para imagens ao vivo de longo prazo da expansão precoce dos ninhos dorsais, ou dorsalmente para imagem de sua expansão tardia e remodelação tecidual). Ver Figura 1J,K e Figura 4.
2. Transfira o prato de fundo de vidro contendo a pupae montada para o estágio do microscópio e concentre-se na superfície da área abdominal usando a luz transmitida.
   NOTA: Mesmo que este protocolo seja otimizado para imagens em microscópios invertidos, também é possível realizar imagens em um microscópio vertical. Nesse caso, a amostra é colocada no estágio do microscópio com a superfície de fundo de vidro voltada para cima. O óleo de halocarboneto mantém cada pupa em um menisco.
3. Definir os parâmetros de aquisição: 1) o número de fatias Z geralmente estão entre 20-40 para permitir a reconstrução bidimensional apropriada (2D) da epiderme abdominal; 2) tamanho do passo entre cada fatia (por exemplo, 1 míclico); 3) intervalo de tempo para gravação (um intervalo de 5 minutos é adequado para análises de alta fidelidade da dinâmica de orientação celular); e 4) resolução de quadros (por exemplo, 1024 x 1024).
4. Ligue os lasers apropriados (ou seja, 488 nm e 561 nm para visualizar fluoroforos GFP e RFP, respectivamente) e ajuste a potência do laser e as configurações de ganho/deslocamento para visualizar as células marcadas. Use a menor potência laser possível (na faixa 5%-20%) para minimizar fotobleaching e fototoxicidade.
5. Defina manualmente a posição e os limites apropriados de pilha Z para várias pupas usando o estágio motorizado anexado e o software de aquisição de multiposições de microscópio.

4. Geração de mosaicos genéticos para seguir comportamentos de clones celulares

NOTA: Utilizamos recombinação mitótica para induzir mosaicos genéticos no epitélio abdominal via recombinação específica do local (sistema FLP/FRT^21,22)(Figura 2).

1. Fêmeas virgens cruzadas carregando um transgene Flippase indutível de choque térmico (hs-FLP), um local de alvo de reconhecimento FLP (FRT) em um local genômico específico (por exemplo, Local FRT na posição 40A no braço L do cromossomo 2), e um marcador celular reconhecível (por exemplo, Ubi-RFP.nls ou Ubi-GFP.nls) distal para o local FRT, para machos mutantes carregando um local FRT no local genômico equivalente(Figura 2A−C).
   NOTA: Efeitos autônomos e não autônomos dentro ou fora de clones para qualquer perda genética de função poderiam ser estudados empregando alelos recessivos específicos distal para o local FRT.
2. Gerar clones somáticos FLP/FRT nos histoblastos por tratamento de choque térmico no terceiro estágio larval instar da prole da cruz. Isso é realizado submergindo os frascos de plástico contendo os animais em um banho de água a 37 °C por 45 min a 1 h no estágio das larvas errantes (LIII).
   NOTA: O período sensível para recombinação mitótica é a fase G2 do ciclo celular. Histoblasts são presos no G2 durante todo o desenvolvimento larval.
3. Escore clones gêmeos para ausência (ou seja, células mutantes) ou níveis aprimorados (ou seja, células de ponto duplo do tipo selvagem) do marcador de proteína fluorescente a partir de 16 h APF em diante(Figura 2D).
   NOTA: Em média, 45 min a 1 h a 37 °C renderiza aproximadamente 2-3 clones gêmeos por região de interesse (por exemplo, o hemisegment abdominal). Pupas mostrando também uma alta densidade de clones (por exemplo, mais de quatro clones gêmeos por hemisegment) devem ser descartados de outras análises quantitativas.
4. Após a identificação do clone, a imagem viva pupae na fase desejada e pelo tempo desejado, conforme descrito na seção anterior.

5. Processamento e análises de dados

NOTA: Os dados são processados usando ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

1. Diferencie a dinâmica de orientação celular dos contornos de junção celular.
   1. Projete as fatias de pilha Z adquiridas pela microscopia confocal em 2D usando a função De projeção de intensidade máxima (MIP) do ImageJ.
      NOTA: O número de fatias por pilha deve ser mantido ao mínimo para evitar o ruído fora de foco gerado por macrófagos patrulhando sob a epiderme.
   2. Defina um sistema de coordenadas planar identificando marcos de tecido confiáveis (por exemplo, limites de compartimento A/P) para análise de cada conjunto de dados(Figura 3A).
      NOTA: A contratação das mesmas referências de planar para cada conjunto de dados permitirá a comparação de várias medições.
   3. Utilize o plugin OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) da ImageJ^23,24 nas bordas celulares locais para obter valores qualitativos e quantitativos de orientação. O plugin torna sobreposições codificadas por cores em imagens de entrada com base em orientações locais e fornece valores numéricos quando usados no modo quantitativo(Figura 3B−B'' e Figura C−C''').
      NOTA: O plugin OrientationJ é baseado em tensores de estrutura, matriz 2 x 2 de eigenvalues derivados de derivativos gradientes e direcionais (Ver referências^23,24 para uma descrição detalhada).
   4. Use a opção OrientationJ Distribution para color-code cell edge orientações relativas ao sistema de coordenadas planar definido (ou seja, mapas de orientação de borda de celular)(Figura 3B). A opção Distribuição é encontrada no menu plugin no ImageJ. As configurações a serem utilizadas são: Sigma de janela gaussiana = 1 pixel; Spline cúbico = Gradiente; Coerência Mínima = 20%; Energia Mínima = 1%. As orientações de borda celular são exibidas como uma imagem codificada por cores que emprega a opção De Pesquisa de Cores do plugin (Hue = orientação; Saturação = coerência; e Brilho = imagem de entrada).
      NOTA: As áreas que contenham fluorescência de fundo não fornecem nenhuma informação direcional e devem ser excluídas manualmente da análise. As configurações de alto limiar reduzem os pixels considerados nas imagens processadas.
   5. Use a opção OrientaçãoJ Medida para quantificar orientações celulares e alinhamento direcional célula-célula (ou seja, coerência) (Figura 3C). A opção Medir é encontrada no menu plugin no ImageJ. Gerar pequenas regiões de interesse adjacentes não sobrepostas (ROIs) de peso uniforme (64 x 64 pixels, cerca de 20 μm x 20 μm) dentro da área ocupada pelos histoblastos(Figura 3C).
   6. Calcule a orientação local dominante (ou seja, a orientação média entre o mapa de orientação de borda celular mediana das células vizinhas) e a coerência dos ROIs. O software calcula a orientação predominante e coerência local dentro de cada ROI (Figura 3C).
      NOTA: Os maiores e menores valores de eigen da estrutura tensor estimados pelo OrientationJ são empregados para calcular a coerência como a razão entre sua diferença e sua soma. A coerência é limitada entre valores de 0-1. Um valor de 1 indica uniformidade de alinhamento total, enquanto um valor de 0 indica áreas isotrópicas sem alinhamento.
   7. Analise estatisticamente os valores calculados de orientação e coerência a partir de múltiplas imagens usando pacotes de software livre, como PAST²⁵. Dados axiais, como valores de orientação (em graus) são devidamente descritos por estatísticas direcionais.
   8. Através do software, calcule a direção média e a variância circular para cada conjunto de distribuições de orientação. A significância estatística da diferença entre a distribuição das orientações entre diferentes genótipos ou condições é determinada utilizando-se o teste não paramétrico Mardia-Watson-Wheeler (W-test) para distribuições iguais.
   9. Calcule a significância estatística da diferença na coerência aplicando o teste kolmogorov-smirnov não paramétrico (teste K-S). Exibir dados graficamente conforme desejado (gráficos polares, gráficos de barras, gráficos de caixa, etc.).
2. Dinâmica de crescimento de clones celulares
   NOTA: As etapas a seguir permitem a recuperação de parâmetros geométricos e de forma para células a partir de imagens 2D MIP contendo o (s) clone(s) de interesse. Para comparações entre vários clones, as imagens devem ser adquiridas com as mesmas configurações.
   1. Segmentar áreas de clones desenhando seus contornos com a ferramenta Seleção de Mão Livre ImageJ.
   2. Calcule parâmetros geométricos e de forma usando a ferramenta Definir medidas do ImageJ no menu Analisar. Ative as opções Area, Perimeter, Fit Ellipsee Shape Descriptor.
      NOTA: Isso permitirá a recuperação de diversos parâmetros geométricos, incluindo a área (soma dos pixels dentro do clone), o perímetro (soma do pixel da borda do clone), a proporção (AR, a razão entre os eixos maior e menor da elipo legendre mais bem encaixada na borda do clone) e o ângulo de orientação (ou seja, o ângulo do eixo principal do clone em relação ao limite anteroposterior).
   3. O cálculo das razões não dimensionais dessas medidas recupera parâmetros de forma. Estes incluem arredondamento (4 x [área]/π x [eixo principal]^2),rugosidade (solidez - área/área convexa) e circularidade (4π x [área]/[perímetro]²).
      NOTA: Cada um dos parâmetros de forma representa o grau de desvio dos clones de formas ideais, como um círculo ou um casco convexo delimitado, e todos eles são limitados entre os valores de 0 e 1. Valores iguais a 1 indicam simetria máxima (ou seja, complexidade mínima).
   4. Analisar estatisticamente parâmetros geométricos e de forma entre diferentes genótipos ou condições usando o Microsoft Excel e/ou PAST. A significância estatística da diferença é determinada usando o teste t de um aluno de duas caudas não verificado para igual média ou o teste K-S não paramétrico kolmogorov-smirnov para distribuições iguais entre as condições. Os dados podem ser exibidos graficamente conforme desejado (por exemplo, gráficos de barras, gráficos de caixa, etc.). Ver Figura 5.

Resultados

O protocolo descrito acima abrange a preparação da pupae Drosophila para imagens vivas de longo prazo e os procedimentos para análise da orientação celular e dinâmica de crescimento da epiderme abdominal. Aplicando essa metodologia é possível gerar filmes de alta resolução da pupae em desenvolvimento por períodos de até 48h sem fotobleaching significativo ou fototoxicidade. Instantâneos que retratam a epiderme abdominal (por exemplo, histoblasts e LECs) em diferentes...

Discussão

A ordem de longo alcance é uma característica essencial da maioria das unidades fisiológicas funcionais. Durante a morfogênese, a ordem é alcançada através da integração de instruções complexas implementadas com alta precisão temporal e espacial. Restrições múltiplas e multinível são integradas em arranjos teciduais estereotipados.

Polaridade e direcionalidade são fundamentais para o arranjo espacial ordenado durante o desenvolvimento. Polaridade implica quebra de simetria du...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection