Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Özet

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Özet

Çok hücreli organizmalar içinde, olgun doku lar ve organlar kurucu hücrelerinin mekansal düzenlemelerinde yüksek derecede düzen gösterirler. Dikkat çekici bir örnek duyusal epitel tarafından verilir, aynı veya farklı kimlikleri nhücreleri son derece organize düzlemsel desenler gösteren hücre-hücre adezyonu ile bir araya getirilir. Hücreler birbirlerine aynı yönde hizalanır ve büyük mesafelerde eşdeğer polarite görüntüler. Olgun epitelin bu organizasyonu morfogenez boyunca kurulmuştur. Olgun epitelin düzlemsel düzenlemesinin nasıl sağlandığını anlamak için, in vivo gelişimi sırasında hücre oryantasyonve büyüme dinamiklerini yüksek spatiotemporal sadakatle izlemek çok önemlidir. Yerelden küresele geçişleri tanımlamak ve tanımlamak için sağlam analitik araçlar da gereklidir. Drosophila pupa epitel morfogenez altında yatan yönelimli hücre şekli değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistemdir. Pupal gelişen epitel hareketsiz vücudun dış yüzeyini oluşturur, bozulmamış hayvanların uzun süreli görüntülenmesi sağlar. Burada açıklanan protokol, büyüdükçe pupal abdominal epidermiste hem küresel hem de lokal düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Açıklanan metodoloji, diğer gelişim evrelerinde, dokularda, hücre altı yapılarda veya model organizmalarda hücre davranışlarının görüntülenmesine kolayca adapte edilebilir.

Giriş

Rollerini başarmak için, epitel dokular tamamen hücresel bileşenlerinin mekansal organizasyon güveniyor. Epitelin çoğunda hücreler sadece kesin bir parke taşı tabakası oluşturmak için birbirlerine karşı paketlenmezler, aynı zamanda vücut eksenlerine göre kendilerini yönlendirirler.

Omurgalı iç kulak ve retina gibi duyusal epitelde hassas doku organizasyonunun fonksiyonel önemi açıktır. İlk durumda, saç ve destekleyici hücreler ses ve hareket¹gibi mekanik girdileri verimli bir şekilde algılamak için belirli bir eksenel yönde hizalamak^{1 ,2}. Benzer şekilde, fotoreseptör hücre mekansal organizasyon^retina3 tarafından optimum optik özellikleri elde etmek için gereklidir. Hücre pozisyonu ve oryantasyonuz mekansal kontrolü böylece uygun fizyolojik fonksiyon için özel bir alaka olduğunu.

Drosophila, larva vücut yapılarının metamorfoz yoluyla tamamen dönüşümüne neden olan ve erişkin dokularına yol açan holometabolöz bir böcektir. Drosophila pupa dinamik olayların çeşitli noninvaziv canlı görüntüleme için mükemmel bir modeldir, gelişimsel hücre göçü dahil⁴, hücre bölünmesi ve büyüme dinamikleri⁵, kas kasılması⁶, hücre ölümü⁷, yara onarım^{ı 8}, ve hücre oryantasyonu⁹. Yetişkin Drosophilaolarak , dış epitel sipariş yüksek derecede gösterir. Bu kolayca trichomes düzenlemeleri gözlenir (yani, tek epitel hücrelerinden kaynaklanan hücre çıkıntıları) ve duyusal kıllar sinek vücut yüzeyinde¹⁰. Nitekim, trichomes paralel satırlar hava akımı¹¹rehberlik hizalanır. Erişkin epitelinin morfogenezi ve tek tek hücrelerin düzenli düzenlenmesi embriyogenez sırasında başlar ve pupal evrelerinde doruğa ulaşır. Embriyolarda hücre bölünmeleri, intercalations, ve şekil değişiklikleri tüm doku düzeni azaltmak^{iken 12,13}, Bu gelişmenin daha sonraki aşamalarında geri, özellikle pupal aşamalarında, sinek olgunluğa yaklaştığında⁹.

Hareketsiz Drosophila pupa hücre şekli ve oryantasyon değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistem sağlar. Pupal abdominal epidermis özel avantajlar sunar. Yetişkin baş öncüleri, toraks, genital, ve uzantıları büyümek ve larva aşamalarından desenli olsun iken, larva epidermis entegre histoblastlar, büyüyen başlar ve sadece pupariation farklılaşma¹⁴. Bu özellik, doku düzeninin kurulmasında rol oynayan tüm spatiotemporal olayların tümünün izlenmesine olanak sağlar^9.

Histoblastlar her varsayımsal abdominal segmentte kontralateral pozisyonlarda embriyonik gelişim sırasında belirtilir. Erişkin dorsal abdominal epidermis dorsolaterally anterior ve posterior bölmeleri mevcut histoblast yuvaları bulunan türetilmiştir^15,16. Histoblastlar genişledikçe, larva epitel hücreleri (LECs) yerine, konfluent levha oluşturan dorsal orta hat kontralateral yuvaları sigorta^17,18,19,20.

Bu çalışma 1) Drosophila pupa diseksiyon, montaj ve uzun vadeli canlı görüntüleme için bir metodoloji açıklar, ve 2) yüksek spatiotemporal çözünürlükte hücresel oryantasyon ve büyüme dinamiklerini incelemek için analitik yöntemler. Burada, ilk pupa hazırlığından (evreleme ve görüntüleme) yönlülük ve oryantasyon özelliklerinin çıkarılması ve ölçülmesi için gerekli tüm adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Ayrıca hücre klonları analizinden yerel doku özelliklerini nasıl çıkarabileceğimizi de açıklıyoruz. Açıklanan tüm adımlar minimal invazivdir ve uzun süreli canlı analizlere olanak sağlar. Burada açıklanan yöntemler kolayca adapte edilebilir ve diğer gelişim evrelerine, dokulara veya model organizmalara uygulanabilir.

Protokol

NOT: Bu protokol beş adıma ayrılır: (1) pupanın evreleme, (2) pupanın görüntüleme için hazırlanması, (3) büyüyen abdominal epitelin canlı görüntülemesi, (4) genetik mozaik lerin üretimi, (5) veri işleme ve analizi (hücre kavşağı anahatlarından hücre oryantasyon dinamiklerinin nasıl analiz edilebildiğini açıklayan bölümler ve hücre klonlarından büyüme dinamikleri dahil).

1. Görüntüleme öncesi Drosophila pupa evreleme

1. Kültür, 25 °C'de 25 °C'de standart ortamda uygun genotipten 5 gün (±12 saat) sonra yumurta yumurtladıktan (AEL) uçar.
   NOT: Metamorfoz, puparium oluşumundan sonra 0 saate kadar 120 h AEL'de pupal kasaya üçüncü instar larvalarının hapsedilmesi nde başlar. Larvalar beslenmeyi ve hareket etmeyi bıraktığından ve operküler bölge 0-12 h APF'de(Şekil 1A)oluştuğu ndan, bu geçiş kolayca tanımlanabilir. Puparium başlangıçta yumuşak ve beyaz, ama giderek sertleşir ve tans.
2. Beyaz prepupae 'yi (0 saat APF) nemli bir fırça kullanarak taze plastik şişeye aktarın. Hayvanlar istenilen yaşa kadar tasarlanan deneye bağlı olarak farklı sıcaklıklarda tutulabilir.
   NOT: Pupa oluşumu (yani, yavrulama) 12 saat APF oluşur, ne zaman baş ve yetişkin sinek uzantıları tamamen everted(Şekil 1A). Bu zamana kadar pupal durumda tamamen pupa ayrılır, tam kaldırılmasına izin (Şekil 1A).

2. Canlı görüntüleme için pupa hazırlanması

NOT: Evrelemeden sonra, pupa lar aşağıda açıklandığı gibi kesilir ve monte edilir (ayrıca bkz. Şekil 1).

1. Forceps yardımı ile şişe duvarından sahnelenmiş pupa çıkarın.
2. Çift taraflı yapışkan bant ile kaplı bir cam slayt üzerinde her pupa ventral tarafı tutkal. Pupanın uçları yla birlikte pupanın baş spiracles'lerine (yani operküler bölge) ve sırt yüzeyine hafifçe dokunun ve pupal kasanın banda yapışmasını sağlar(Şekil 1A,B).
   NOT: Sırt yüzeyi, kılıfın diseksiyonunu ve pupanın iyileşmesini kolaylaştırmak için yukarı yaslanmalıdır.
3. Operkülonu puparium'dan forceplerle hafifçe çıkararak stereomikroskop altında diseksiyonun başlamasına başlanır(Şekil 1C).
4. Operküler açıklık yoluyla pupal durumda ve pupa yüzeyi arasında sığ bir açıda forceps bir ucu yerleştirin. Bir veya daha fazla salıncakta kılıfı baş lardan kuyrağa yırtarak pupanın kıstırılmasından kaçının (Şekil 1D). Arka uça doğru ilerlerken çatlak pupal kılıfı lateral kenarlara katlayın (Şekil 1E).
   NOT: Pupal kasa oldukça serttir ve kolayca çatlar. Yüksek nem veya özellikle genotypik arka planlar durumunda, pupal durumda daha yumuşak olur ve yırtılma daha zordur. Bu gibi durumlarda, pupal durumda çatlama forseps her iki ucu ile serbest kenarları dikme ile yardımcı olabilir.
5. Pupayı hayvanın altına dikkatlice sokarak ve yavaşça yukarı çekerek açılan pupal kılıftan çıkarın (Şekil 1F). Pupa, çerterlerin ucuna yapışır (Şekil 1G−H).
6. Pupayı bir cam alt çanağa geçirin ve küçük bir damla gaz geçirilmez halokarbon yağının üzerine yatırın(Şekil 1I). Olası doku hasarını önlemek için pupayı ventral tarafta hafifçe tutun.
   NOT: Halokarbon yağının düşmesi, çapı pupanın yaklaşık yarısından daha az olan küçük olmalıdır. Bu miktar kılcal lık ile cama pupa yapıştırmak ve yağ daldırma hedefleri için optik düzeltmek için yeterlidir.
7. Nemi korumak için yemeğin kenarlarına ıslak mendil kağıdı bir parça rulo. Görüntüleme sırasında pupa dehidratasyon önlemek için çanak kapağı.
   NOT: Görüntüleme için hem kadın hem de erkek pupa kullanılabilir. Boyut, şekil ve desenleme açısından her iki cinste de hemen hemen aynı olduğundan, üçüncü karın segmentlerinin (AIII) referans olarak abdominal metamere olarak çalıştırManızı öneririz.

3. Büyüyen abdominal epitelin canlı görüntülemesi

NOT: Farklı gelişim evrelerinde pupaların görüntülenebilmek için 40x/1.3 NA yağ daldırma hedefi ile donatılmış ters lazer tarama konfokal mikroskobu kullanıldı.

1. Diyatal ve değerlendirilecek sürece göre cam alt çanak üzerinde yağ damla üzerinde pupa Orient (örneğin dorsal dorsal dorsal dorsal dorsal yuvalarıerken genişleme uzun vadeli canlı görüntüleme için, ya da dorsally onların geç genişleme ve doku remodeling görüntü). Bkz. Şekil 1J,K ve Şekil 4.
2. Monte edilmiş pupa içeren cam dipli kabı mikroskop aşamasına aktarın ve iletilen ışığı kullanarak karın bölgesinin yüzeyine odaklanın.
   NOT: Bu protokol ters mikroskoplarda görüntüleme için optimize edilmiş olsa bile, dik bir mikroskop üzerinde görüntüleme yapmak da mümkündür. Bu durumda, örnek cam alt yüzeyi yukarı bakacak şekilde mikroskop aşamasına yerleştirilir. Halokarbon yağı her pupayı bir menisküs üzerinde tutar.
3. Kazanım parametrelerini ayarlayın: 1) Z-dilimlerinin sayısı genellikle 20−40 arasında dır ve abdominal epidermisin uygun iki boyutlu (2D) rekonstrüksiyonuna izin verir; 2) her dilim (örneğin, 1 mikron) arasında adım boyutu; 3) kayıt için zaman aralığı (5 dk aralık hücre oryantasyon dinamikleri yüksek sadakat analizleri için uygundur); ve 4) kare çözünürlüğü (örn. 1024 x 1024).
4. Uygun lazerleri açın (sırasıyla GFP ve RFP florofororları görselleştirmek için 488 nm ve 561 nm) ve işaretli hücreleri görselleştirmek için lazer gücünü ve kazanç/ofset ayarlarını ayarlayın. Mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın (%5−%20 aralığında) fotobeyaztlama ve fototoksisiteyi en aza indirmek için.
5. Bağlı motorlu sahne ve mikroskop çok pozisyonlu satın alma yazılımı kullanarak birden fazla pupa için pozisyonu ve uygun Z-stack limitlerini manuel olarak ayarlayın.

4. Hücre klonların davranışlarını takip etmek için genetik mozaiklerin üretimi

NOT: Abdominal epitelde genetik mozaikleri bölgeye özgü rekombinasyon yoluyla indüklemek için mitotik rekombinasyon kullanırız (FLP/FRT sistemi^21,22) (Şekil 2).

1. Belirli bir genomik konumda bir FLP tanıma hedefi (FRT) bölgesi olan ısı şokuna neden olan Flippase transgeni (hs-FLP) taşıyan çapraz bakire dişiler (örn. Kromozom 2'nin L kolunda ki 40A pozisyonundaki FRT bölgesi ve FRT bölgesine eşdeğer genomik konumda FRT alanı taşıyan mutant erkeklere(Şekil 2A−C)tanınabilir bir hücresel belirteç (örneğin, Ubi-RFP.nls veya Ubi-GFP.nls) distal.
   NOT: Herhangi bir gen fonksiyon kaybı için klonların içinde veya dışında otonom olmayan etkiler FRT bölgesine özgü resesif aleller intihal olarak incelenebilir.
2. Haç ın soyundan üçüncü instar larva aşamasında ısı şoku tedavisi ile histoblastlarda FLP/FRT somatik klonlar oluşturun. Bu, 37 °C'de bir su banyosunda hayvanları içeren plastik şişelerin 45 dakika ile 1 saat arasında gezici larva (LIII) evresinde batırılarak yapılır.
   NOT: Mitotik rekombinasyon için hassas dönem hücre döngüsünün G2 fazıdır. Histoblastlar g2'de tüm larva gelişimi sırasında tutuklanır.
3. 16 saat APF'den itibaren floresan protein belirteci seviyelerinin yokluk (yani mutant hücreler) veya geliştirilmiş (yani, yabani tip çift noktalı hücreler) seviyelerini 16 saat APF'den itibaren puanlamak(Şekil 2D).
   NOT: Ortalama olarak, 37 °C'de 45 dk ile 1 saat arasında, ilgi çeken bölgelere göre yaklaşık olarak sadece 2−3 ikiz klon (örn. abdominal hemisegment) meydana getirir. Çok yüksek klon yoğunluğu gösteren pupalar (örneğin, hemisegment başına dörtten fazla ikiz klon) daha fazla kantitatif analizden atılmalıdır.
4. Klon tanımlaması üzerine, bir önceki bölümde açıklandığı gibi istenilen aşamada ve istenilen süre boyunca pupa görüntü canlı.

5. Veri işleme ve analizleri

NOT: Veriler ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) kullanılarak işlenir.

1. Hücre yön dinamiği nin hücre birleşme anahatlarından ayırt edin.
   1. ImageJ'in Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu (MIP) işlevini kullanarak konfokal mikroskopi ile elde edilen Z-yığın dilimlerini 2B olarak yansıtın.
      NOT: Epidermisin altında devriye gezen makrofajların ürettiği odak gürültüsünden kaçınmak için yığın başına dilim sayısı minimumda tutulmalıdır.
   2. Her veri kümesinin analizi için güvenilir doku simgelerini (örn. A/P bölme sınırları) tanımlayan düzlemsel bir koordinat sistemi ayarlayın(Şekil 3A).
      NOT: Her veri kümesi için aynı düzlemsel başvuruların çalıştırılması, birden çok ölçümün karşılaştırılmasına olanak sağlar.
   3. Nitel ve nicel yönlendirme değerlerini elde etmek için yerel hücre kenarlarında ImageJ^23,24'ün OrientationJ eklentisini (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) kullanın. Eklenti, giriş görüntülerinde yerel yönlendirmelere dayalı renk kodlu bindirmeler işler ve nicel modda kullanıldığında sayısal değerler sağlar(Şekil 3B−B'' ve Şekil C−C''').
      NOT: OrientationJ eklentisi yapı tensörleri, degrade ve yön türevlerinden türetilen 2 x 2 matris iigenvalues dayanmaktadır (Ayrıntılı bir açıklama için^{referanslar 23,24} bakınız).
   4. Belirlenen düzlemsel koordinat sistemine göre hücre kenar yönlendirmelerini renk kodulandırmak için OrientationJ Dağıtım seçeneğini kullanın (örn. hücre kenarı yönlendirme haritaları)(Şekil 3B). Dağıtım seçeneği ImageJ'deki eklenti menüsünün altında bulunur. Kullanmak için ayarlar şunlardır: Gaussian pencere sigma = 1 piksel; Kübik Spline = Gradyan; Minimum Tutarlılık = %20; Minimum Enerji = %1. Hücre kenar yönlendirmeleri, eklentinin Renk Anketi seçeneğini kullanan renk kodlu bir görüntü olarak görüntülenir (Hue = yönlendirme; Doygunluk = tutarlılık; ve Parlaklık = giriş görüntüsü).
      NOT: Arka plan floresaniçeren alanlar herhangi bir yön bilgisi sağlamaz ve analizin el ile dışlanmalıdır. Yüksek eşik ayarları, işlenen görüntülerde düşünülen pikselleri azaltır.
   5. Hücresel oryantasyonları ve yönlü hücre-hücre hizasını (yani tutarlılık) ölçmek için OrientationJ Ölçümü seçeneğini kullanın (Şekil 3C). Ölçüle seçeneği ImageJ'deki eklenti menüsünün altında bulunur. Histoblastların işgal ettiği alanda tek tip ağırlıkta (64 x 64 piksel, yaklaşık 20 μm x 20 m) küçük bitişik çakışmayan, örtüşen olmayan bölgeler (ROI) oluşturun (Şekil 3C).
   6. Baskın yerel yönünü (örneğin, komşu hücrelerin ortalama hücre kenarı yönlendirme haritası arasındaki ortalama yönelimi) ve ROI'ların tutarlılığını hesaplayın. Yazılım, her yG içinde baskın yönlendirme ve yerel tutarlılık(Şekil 3C)bilgisayardır.
      NOT: OrientationJ tarafından tahmin edilen yapı tensorunun en büyük ve en küçük özdeğerleri, aralarındaki fark ile toplamı arasındaki oran olarak tutarlılığı hesaplamak için kullanılır. Tutarlılık 0−1 değerleri arasında sınırlanır. 1 değeri tam hizalama tekdüzeliğini gösterirken, 0 değeri hizalama olmayan isotropik alanları gösterir.
   7. GEÇMI޲⁵gibi özgür yazılım paketlerini kullanarak birden fazla görüntüden hesaplanan yönlendirme ve tutarlılık değerlerini istatistiksel olarak analiz edin. Yönlendirme değerleri (derece olarak) gibi eksenel veriler yön istatistikleri ile uygun şekilde tanımlanır.
   8. Yazılım aracılığıyla, her bir yönlendirme dağılımı kümesi için ortalama yönü ve dairesel varyansı hesaplayın. Farklı genotipler veya koşullar arasındaki oryantasyonların dağılımı arasındaki farkın istatistiksel önemi, eşit dağılımlar için parametrik olmayan Mardia-Watson-Wheeler testi (W-testi) kullanılarak belirlenir.
   9. Parametrik olmayan Kolmogorov-Smirnov testini (K-S testi) uygulayarak tutarlılık farkının istatistiksel önemini hesaplayın. Verileri istenilen şekilde grafikolarak görüntüleyin (kutup çizimleri, çubuk grafikler, kutu çizimleri, vb.).
2. Hücre klonlarından büyüme dinamikleri
   NOT: Aşağıdaki adımlar, ilgi çeken klonu içeren 2B MIP görüntülerinden hücreler için geometrik ve şekil parametrelerinin alınmasına olanak sağlar. Birden çok klon arasındaki karşılaştırmalar için, görüntüler aynı ayarlarla elde edilmelidir.
   1. ImageJ Freehand Selection aracıyla konturlarını çizerek klon alanlarını segmentleyin.
   2. Analiz menüsü altındaki ImageJ'in Ölçümleri Ayarla aracını kullanarak geometrik ve şekil parametrelerini hesaplayın. Alanı, Çevreyi, Elipse Sığdır'ıve Şekil Tanımlayıcı seçeneklerini etkinleştirin.
      NOT: Bu alan (klon içindeki piksellerin toplamı), çevre (klon kenarlığı piksel toplamı), en boy oranı (AR, klon sınırına kazınmış en uygun Legendre elipsin in major ve minör eksenleri arasındaki oran) ve sınır açısı (yani, anteroposterigöre klona göre klonun ana ekseninin açısı) dahil olmak üzere çeşitli geometrik parametrelerin alınmasını sağlayacaktır.
   3. Bu ölçümlerden boyutsal olmayan oranların hesaplanması şekil parametrelerini alır. Bunlar arasında yuvarlaklık (4 x [alan]/π x [ana eksen]^2),pürüzlülük (sağlamlık - alan/konveks alanı) ve dairesellik (4π x [alan]/[çevre]²⁾sayılabilir.
      NOT: Şekil parametrelerinin her biri, klonların bir daire veya sınırlı konveks gövdesi gibi ideal şekillerden sapma derecesini temsil eder ve bunların hepsi 0 ve 1 değerleri arasında sınırlanır. 1'e eşit değerler maksimum simetriyi (yani minimal karmaşıklığı) gösterir.
   4. Microsoft Excel ve/veya PAST kullanarak farklı genotipler veya koşullar arasındaki geometrik ve şekil parametrelerini istatistiksel olarak analiz edin. Farkın istatistiksel önemi, eşit ortalama için eşleşmemiş iki kuyruklu öğrencinin t-testi veya koşullar arasında eşit dağılımlar için parametrik olmayan Kolmogorov-Smirnov K-S-testi kullanılarak belirlenir. Veriler istenilen şekilde grafiksel olarak görüntülenebilir (örn. çubuk grafikler, kutu çizimleri, vb.). Bkz. Şekil 5.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokol, Drosophila pupasının uzun süreli canlı görüntüleme için hazırlanmasını ve karın epidermisinin hücre oryantasyon ve büyüme dinamiklerinin analizini kapsamaktadır. Bu metodolojiyi uygulayarak, gelişmekte olan pupanın yüksek çözünürlüklü filmlerini, önemli bir fotobeyazrlama veya fototoksisite olmaksızın 48 saate kadar çıkarmak mümkündür. Karın epidermisini (örneğin histoblastlar ve LED'ler) farklı zaman noktaları...

Tartışmalar

Uzun menzilli düzen en fonksiyonel fizyolojik birimlerin temel bir özelliğidir. Morfogenez sırasında, yüksek zamansal ve mekansal hassasiyetle uygulanan karmaşık talimatların entegrasyonu ile düzen elde edilir. Çoklu ve çok düzeyli konsuşlar stereotipli doku düzenlemelerine entegre edilmiştir.

Polarite ve yönlülük gelişim sırasında düzenli mekansal düzenleme için çok önemlidir. Polarite gelişme sırasında simetri kırılması anlamına gelir. Embriyonik anteroposte...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection