Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

Résumé

Ce protocole est conçu pour l’imagerie et l’analyse de la dynamique de l’orientation cellulaire et de la croissance des tissus dans l’épithélie abdominale Drosophila que la mouche des fruits subit une métamorphose. La méthodologie décrite ici peut être appliquée à l’étude de différents stades de développement, tissus et structures subcellulaires dans Drosophila ou d’autres organismes modèles.

Résumé

Dans les organismes multicellulaires, les tissus et les organes matures affichent des degrés élevés d’ordre dans les arrangements spatiaux de leurs cellules constitutives. Un exemple remarquable est donné par l’épithélia sensorielle, où les cellules des mêmes identités ou distinctes sont réunies par l’adhérence cellulaire montrant des modèles planaires très organisés. Les cellules s’alignent les unes sur les autres dans la même direction et affichent une polarité équivalente sur de grandes distances. Cette organisation de l’épithélia mature est établie au cours de la morphogenèse. Pour comprendre comment l’arrangement planaire de l’épithélia mature est atteint, il est crucial de suivre l’orientation cellulaire et la dynamique de croissance avec une fidélité spatiotemporal élevée pendant le développement in vivo. Des outils d’analyse robustes sont également essentiels pour identifier et caractériser les transitions locales à mondiales. La pupe Drosophila est un système idéal pour évaluer les changements orientés de forme cellulaire sous-jacents morphogenèse épithéliale. L’épithélium en développement du pupal constitue la surface externe du corps immobile, permettant l’imagerie à long terme des animaux intacts. Le protocole décrit ici est conçu pour imager et analyser les comportements cellulaires aux niveaux mondial et local dans l’épiderme abdominal pupal à mesure qu’il grandit. La méthodologie décrite peut être facilement adaptée à l’imagerie des comportements cellulaires à d’autres stades de développement, tissus, structures subcellulaires, ou organismes modèles.

Introduction

Pour atteindre leurs rôles, les tissus épithéliaux s’appuient pleinement sur l’organisation spatiale de leurs composants cellulaires. Dans la plupart des épithéliales, les cellules sont non seulement emballées les unes contre les autres pour créer une couche pavée précise, mais elles s’orientent par rapport aux axes du corps.

L’importance fonctionnelle de l’organisation précise des tissus est évidente dans l’épithélia sensorielle, comme l’oreille interne vertébré et la rétine. Dans le premier cas, les cheveux et les cellules de soutien s’alignent dans une direction axial spécifique pour détecter efficacement les entrées mécaniques telles que le son et le mouvement^1,2. De même, l’organisation spatiale des cellules photoréceptrices est essentielle pour atteindre des propriétés optiques optimales par la rétine³. Le contrôle spatial de la position et de l’orientation cellulaires est donc d’une pertinence particulière pour une fonction physiologique appropriée.

Drosophila est un insecte holometabolous qui subit une transformation complète de ses structures corporelles larvaires par métamorphose, donnant naissance à ses tissus adultes. La pupe Drosophila est un excellent modèle pour l’imagerie en direct non invasive d’une variété d’événements dynamiques, y compris la migration des cellules développementales⁴, la division cellulaire et la dynamique de croissance⁵, contraction musculaire⁶, la mort cellulaire⁷, la réparation de la plaie⁸, et l’orientation cellulaire⁹. Dans l’adulte Drosophila, l’épithélium externe montre un haut degré d’ordre. Ceci est facilement observé sur les arrangements des trichomes (c.-à-d. les protubérances cellulaires provenant de cellules épithéliales simples) et les poils sensoriels sur toute la surface du corps de la mouche¹⁰. En effet, les trichomes sont alignés dans des rangées parallèles guidant le flux d’air¹¹. La morphogénèse de l’épithélie adulte et l’arrangement ordonné des cellules individuelles commence pendant l’embryogenèse et culminent pendant les stades pupal. Alors que dans les divisions cellulaires des embryons, les intercalations, et les changements de forme tous diminuer l’ordre des tissus^12,13, cela est retourné à des stades ultérieurs de développement, en particulier à des stades pupal, lorsque la mouche approche de la maturité⁹.

La pupe immobile Drosophila fournit un système idéal pour évaluer la forme cellulaire et les changements d’orientation. L’épiderme abdominal pupal présente des avantages spéciaux. Tandis que les précurseurs de la tête, du thorax, des organes génitaux et des appendices adultes se développent et obtiennent modelés à partir des stades larvaires, les histoblastes, qui sont intégrés dans l’épiderme larvaire, commencent à croître et à se différencier seulement à la pupariation¹⁴. Cette fonctionnalité permet le suivi de tous les événements spatiotemporal impliqués dans l’établissement de l’ordre tissulaire dans son intégralité⁹.

Les histoblastes sont spécifiés pendant le développement embryonnaire aux positions contralatérales dans chaque segment abdominal présumé. L’épiderme abdominal dorsale de l’adulte dérive des nids d’histoblaste situés de façon dorsolaterale présent dans les compartiments antérieurs et postérieurs^15,16. Au fur et à mesure que les histoblastes se développent, remplaçant les cellules épithéliales larvaires (LEC), les nids contralatéraux fusionnent à la ligne médiane dorsale formant une feuille confluente^17,18,19,20.

Ce travail décrit 1) une méthodologie pour la dissection, le montage, et l’imagerie vivante à long terme de la pupe de Drosophila, et 2) méthodes analytiques pour étudier la dynamique de l’orientation et de la croissance cellulaires à la résolution spatiotemporal élevée. Un protocole détaillé est fourni ici, couvrant toutes les étapes requises depuis la préparation initiale des pupes (c.-à-d. la mise en scène et l’imagerie) jusqu’à l’extraction et la quantification des caractéristiques de directionnalité et d’orientation. Nous décrivons également comment déduire les propriétés tissulaires locales de l’analyse des clones cellulaires. Toutes les étapes décrites sont peu invasives et permettent des analyses en direct à long terme. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées et appliquées à d’autres stades de développement, tissus ou organismes modèles.

Protocole

REMARQUE : Ce protocole est divisé en cinq étapes : (1) la mise en scène de la pupe, (2) préparant la pupe pour l’imagerie, (3) l’imagerie en direct de l’épithélia abdominale croissante, (4) génération de mosaïques génétiques, (5) le traitement et l’analyse des données (y compris les sections décrivant comment analyser la dynamique d’orientation cellulaire à partir des contours de jonction cellulaire et la dynamique de croissance des clones cellulaires).

1. Mise en scène de pupes Drosophila avant l’imagerie

1. Mouches de culture du génotype approprié sur le milieu standard dans les flacons en plastique à 25 oC pendant 5 jours (12 h) après la ponte (AEL).
   REMARQUE : La métamorphose commence dans le confinement des larves de troisième-instar dans le cas pupal à 120 h AEL jusqu’à 0 h après la formation de puparium (APF). Cette transition est facilement identifiable, car les larves cessent de se nourrir et de se déplacer et que la région operculaire se forme(figure 1A) à 0-12 h APF. Le puparium est d’abord doux et blanc, mais durcit progressivement et bronze.
2. Transférer les prepupae blanches (0 h APF) dans une fiole en plastique frais à l’aide d’un pinceau humide. Les animaux peuvent être gardés à des températures différentes selon l’expérience conçue jusqu’à l’âge désiré.
   REMARQUE : La formation de pupa (c.-à-d. la pupation) se produit à 12 h APF, lorsque la tête et les appendices de la mouche adulte sont totalement éternels(figure 1A). À ce moment-là, le cas de pupal est entièrement séparé de la pupe, ce qui lui permet d’enlever complètement(figure 1A).

2. Préparation des pupes pour l’imagerie en direct

REMARQUE : Après la mise en scène, les pupes sont disséquées et montées comme décrit ci-dessous (voir aussi la figure 1).

1. Retirer les pupes mises en scène du mur de la fiole à l’aide des forceps.
2. Collez le côté ventral de chaque pupe sur une glissière en verre recouverte de ruban adhésif recto-verso. Appuyez doucement sur les spiracles de tête (c.-à-d. la région opéculaire) et la surface dorsale de la pupe avec les pointes des forceps pour assurer l’adhérence du cas pupal à la bande (figure 1A,B).
   REMARQUE : La surface dorsale doit faire face vers le haut pour faciliter la dissection du boîtier et la récupération de la pupe.
3. Commencez la dissection sous un stéréomicroscope en enlevant doucement l’operculum du puparium avec les forceps(figure 1C).
4. Insérez une pointe des forceps dans un angle peu profond entre le cas de pupal et la surface de pupe à travers l’ouverture opercular. Déchirez le boîtier de la tête à la queue latéralement dans une ou plusieurs balançoires, en évitant de pincer la pupe(figure 1D). Repliez le cas de pupal fissuré aux côtés latéraux pendant que vous continuez à procéder à l’extrémité postérieure(figure 1E).
   REMARQUE : Le cas pupal est assez rigide et se fissure facilement. En cas d’humidité élevée ou en particulier des arrière-plans génotypic, le cas pupal devient plus doux et la déchirure est plus difficile. Dans ces cas, la fissuration du cas pupal peut être aidé en piquant ses bords libres avec les deux extrémités des forceps.
5. Retirez la pupe du pupal ouvert en insérant soigneusement les forceps sous l’animal et en tirant doucement vers le haut(figure 1F). La pupe s’en tiendra à la pointe des forceps(figure 1G-H).
6. Transférer la pupe à l’aide des forceps dans un plat à fond de verre et le déposer sur une petite goutte d’huile de halocarbone perméable au gaz(figure 1I). Tenez la pupe doucement par le côté ventral pour éviter tout dommage possible de tissu.
   REMARQUE : La goutte d’huile de halocarbone doit être petite, avec un diamètre d’environ la moitié de la longueur de la pupe. Une telle quantité est suffisante pour adhérer la pupe au verre par capillarité et pour corriger l’optique pour les objectifs d’immersion d’huile.
7. Rouler un morceau de papier de soie humide sur les bords du plat pour maintenir l’humidité. Couvrir le plat pour éviter la déshydratation des pupes pendant l’imagerie.
   REMARQUE : Les pupes femelles et mâles peuvent être employées pour l’imagerie. Nous recommandons d’employer les troisièmes segments abdominaux (AIII) comme métaamere abdominal de référence puisqu’il est presque identique dans les deux sexes en termes de taille, de forme et de modelage.

3. Imagerie vivante de l’épithélia abdominale croissante

REMARQUE : Un microscope confocal inversé de balayage laser équipé d’un objectif d’immersion d’huile de 40x/1.3 NA a été employé pour imager des pupes à différents stades de développement.

1. Orientez la pupe sur la goutte d’huile sur le plat de fond de verre selon le domaine et le processus à évaluer (par exemple, dorsolaterally pour l’imagerie vivante à long terme de l’expansion précoce des nids dorsales, ou dorsalement pour l’image de leur expansion tardive et de remodelage des tissus). Voir la figure 1J, K et la figure 4.
2. Transférer le plat à fond de verre contenant les pupes montées au stade du microscope et se concentrer sur la surface de la zone abdominale à l’aide de la lumière transmise.
   REMARQUE : Même si ce protocole est optimisé pour l’imagerie sur les microscopes inversés, il est également possible d’effectuer l’imagerie au microscope droit. Dans ce cas, l’échantillon est placé sur la scène du microscope avec la surface de fond de verre orientée vers le haut. L’huile de halocarbone tient chaque pupe sur un ménisque.
3. Définir les paramètres d’acquisition : 1) le nombre de tranches de Z se situe généralement entre 20 et 40 pour permettre une reconstruction bidimensionnelle appropriée (2D) de l’épiderme abdominal; 2) taille d’étape entre chaque tranche (p. ex., 1 micron); 3) intervalle de temps pour l’enregistrement (un intervalle de 5 min convient aux analyses de haute fidélité de la dynamique d’orientation cellulaire); et 4) résolution du cadre (p. ex., 1024 x 1024).
4. Allumez les lasers appropriés (c.-à-d. 488 nm et 561 nm pour visualiser les fluorophores GFP et RFP respectivement) et ajuster la puissance laser et les paramètres de gain/offset pour visualiser les cellules marquées. Utilisez la puissance laser la plus faible possible (dans la fourchette de 5 % à 20 %) pour minimiser le phototachage et la phototoxicité.
5. Définissez manuellement la position et les limites appropriées de pile Z pour les pupes multiples à l’aide de l’étape motorisée attachée et du logiciel d’acquisition de multipositions au microscope.

4. Génération de mosaïques génétiques pour suivre les comportements des clones cellulaires

REMARQUE : Nous utilisons la recombinaison mitotique pour induire des mosaïques génétiques dans l’épithélium abdominal par recombinaison spécifique au site (FLP/FRT system^21,22) ( figure2).

1. Femelles vierges croisées portant un choc thermique inductible Flippase transgene (hs-FLP), un site cible de reconnaissance FLP (FRT) à un endroit génomique spécifique (par exemple, Site de FRT à la position 40A au bras L du chromosome 2), et un marqueur cellulaire reconnaissable (par exemple, Ubi-RFP.nls ou Ubi-GFP.nls) distal au site de FRT, aux mâles mutants portant un site de FRT à l’emplacement génomique équivalent(figure 2A’C).
   REMARQUE : Des effets autonomes et non autonomes à l’intérieur ou à l’extérieur des clones pour toute perte de fonction génique pourraient être étudiés en utilisant des allèles récessifs spécifiques distal au site de FRT.
2. Générer des clones somatiques FLP/FRT dans les histoblastes par traitement de choc thermique au troisième stade larvaire instar de la progéniture de la croix. Ceci est effectué en submergeant les flacons en plastique contenant les animaux dans un bain d’eau à 37 oC pendant 45 min à 1 h au stade errant des larves (LIII).
   REMARQUE : La période sensible pour la recombinaison mitotique est la phase G2 du cycle cellulaire. Les histoblastes sont arrêtés en G2 pendant tout le développement larvaire.
3. Marquez des clones jumeaux pour l’absence (c.-à-d. les cellules mutantes) ou améliorez les niveaux (c.-à-d. les cellules à double tache de type sauvage) du marqueur de protéines fluorescentes à partir de 16 h APF(figure 2D).
   REMARQUE : En moyenne, 45 min à 1 h à 37 oC ne font qu’environ 2 à 3 clones jumeaux par région d’intérêt (p. ex., l’hémisegment abdominal). Les pupes montrant une densité de clone trop élevée (p. ex., plus de quatre clones jumeaux par hemisegment) devraient être écartées des analyses quantitatives ultérieures.
4. Lors de l’identification du clone, image pupe vivante au stade désiré et pour la durée désirée comme décrit dans la section précédente.

5. Traitement et analyses de données

REMARQUE : Les données sont traitées à l’aide d’ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

1. Distinguer la dynamique d’orientation cellulaire des contours de jonction cellulaire.
   1. Projetez les tranches de pile Z acquises par microscopie confocienne en 2D en utilisant la fonction projection d’intensité maximale (MIP) d’ImageJ.
      REMARQUE : Le nombre de tranches par pile doit être réduit au minimum afin d’éviter le bruit hors foyer généré par les macrophages patrouillant sous l’épiderme.
   2. Définir un système de coordonnées planaires identifiant des repères tissulaires fiables (p. ex., limites des compartiments A/P) pour l’analyse de chaque jeu de données(figure 3A).
      REMARQUE : L’utilisation des mêmes références planaires pour chaque ensemble de données permettra de comparer plusieurs mesures.
   3. Utilisez le plugin OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) de l’ImageJ^23,24 sur les bords cellulaires locaux pour obtenir des valeurs d’orientation qualitatives et quantitatives. Le plugin effectue des superpositions codées en couleur sur des images d’entrée basées sur des orientations locales et fournit des valeurs numériques lorsqu’il est utilisé en mode quantitatif(figure 3B-B'' et figure C-C''').
      REMARQUE : Le plugin OrientationJ est basé sur des tensors de structure, 2 x 2 matrice d’eigenvalues dérivées de gradient et de dérivés directionnels (Voir les références^23,24 pour une description détaillée).
   4. Utilisez l’option OrientationJ Distribution pour les orientations de bord de cellules à code couleur par rapport au système de coordonnées planaires définis (c.-à-d. les cartes d’orientation des bords cellulaires)(figure 3B). L’option Distribution se trouve sous le menu plugin dans ImageJ. Les paramètres à employer sont: Gaussian fenêtre sigma 1 pixel; Spline cubique et Gradient; Coherency minimum 20%; Energie minimale 1%. Les orientations de bord de cellules sont affichées comme image de couleur-codée utilisant l’option d’étude de couleur du plugin (Hue ' orientation ; Saturation et cohérence; et Brightness et image d’entrée).
      REMARQUE : Les zones qui contiennent de la fluorescence de fond ne fournissent aucune information directionnelle et doivent être exclues manuellement de l’analyse. Les paramètres de seuil élevés réduisent les pixels pris en compte dans les images traitées.
   5. Utilisez l’option Mesure OrientationJ pour quantifier les orientations cellulaires et l’alignement directionnel des cellules cellulaires (c.-à-d. la cohérence)(figure 3C). L’option Mesure se trouve sous le menu plugin dans ImageJ. Générer de petites régions d’intérêt adjacentes non qui ne se chevauchent pas (ROI) de poids uniforme (64 x 64 pixels, environ 20 m x 20 m) dans la zone occupée par les histoblastes(figure 3C).
   6. Calculer l’orientation locale dominante (c.-à-d. l’orientation moyenne entre la carte d’orientation des limites cellulaires moyennes des cellules voisines) et la cohérence des ROI. Le logiciel calcule l’orientation prédominante et la cohérence locale au sein de chaque retour sur investissement(figure 3C).
      REMARQUE : Les plus grandes et les plus petites évaluations de la structure estimées par OrientationJ sont employées pour calculer la cohérence comme rapport entre leur différence et leur somme. La cohérence est limitée entre les valeurs de 0-1. Une valeur de 1 indique l’uniformité complète de l’alignement, tandis qu’une valeur de 0 indique les zones isotropiques sans alignement.
   7. Analysez statistiquement les valeurs d’orientation et de cohérence calculées à partir de plusieurs images à l’aide de logiciels libres tels que PAST²⁵. Les données axial telles que les valeurs d’orientation (en degrés) sont décrites de façon appropriée par des statistiques directionnelles.
   8. Grâce au logiciel, calculez la direction moyenne et la variance circulaire pour chaque ensemble de distributions d’orientation. L’importance statistique de la différence entre la distribution des orientations entre les différents génotypes ou conditions est déterminée à l’aide du test non paramétrique Mardia-Watson-Wheeler (test W) pour des distributions égales.
   9. Calculez l’importance statistique de la différence de cohérence en appliquant le test kolmogorov-Smirnov non paramétrique (test K-S). Afficher les données graphiquement comme souhaité (parcelles polaires, graphiques à barres, parcelles de boîte, etc.).
2. Dynamique de croissance des clones cellulaires
   REMARQUE : Les étapes suivantes permettent la récupération des paramètres géométriques et de forme pour les cellules des images MIP 2D contenant le clone(s) d’intérêt. Pour les comparaisons entre plusieurs clones, les images doivent être acquises avec les mêmes paramètres.
   1. Segmentez les zones de clones en dessinant leurs contours avec l’outil De sélection à main levée ImageJ.
   2. Calculez les paramètres géométriques et de forme en utilisant l’outil De mesure de configuration d’ImageJ sous le menu Analyze. Activer la zone, Perimeter, Fit Ellipse, et Shape Descriptor options.
      REMARQUE : Cela permettra de récupérer divers paramètres géométriques, y compris la zone (somme des pixels dans le clone), le périmètre (somme du pixel de la bordure clone), le rapport d’aspect (AR, le rapport entre les axes majeurs et mineurs de l’ellipse Legendre le mieux ajusté inscrit dans la frontière clone), et l’angle d’orientation (c’est-à-dire l’angle de l’axe majeur du clone relatif à la limite immédiate).
   3. Le calcul des ratios non dimensionnels à partir de ces mesures récupère les paramètres de forme. Il s’agit notamment de la rondeur (4 x [zone]/x x [axe majeur]²), de la rugosité (solidité - zone/zone convexe) et de la circularité (4 x [zone]/[périmètre]²).
      REMARQUE : Chacun des paramètres de forme représente le degré de déviation des clones des formes idéales telles qu’un cercle ou une coque convexe délimitée, et ils sont tous délimités entre des valeurs de 0 et 1. Les valeurs égales à 1 indiquent une symétrie maximale (c.-à-d. une complexité minimale).
   4. Analysez statistiquement les paramètres géométriques et de forme entre les différents génotypes ou conditions à l’aide de Microsoft Excel et/ou PAST. L’importance statistique de la différence est déterminée à l’aide d’un t-test d’étudiant à deux queues non appréhentré pour un moyen égal ou du test K-S Kolmogorov-Smirnov non paramétrique pour des distributions égales entre les conditions. Les données peuvent être affichées graphiquement comme désiré (p. ex., graphiques à barres, parcelles de boîte, etc.). Voir la figure 5.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus couvre la préparation des pupes de Drosophila pour l’imagerie vivante à long terme et les procédures pour l’analyse de l’orientation cellulaire et de la dynamique de croissance de l’épiderme abdominal. En appliquant cette méthodologie, il est possible de générer des films haute résolution des pupes en développement pour des périodes allant jusqu’à 48 h sans photoblachage significatif ou phototoxicité. Des instantanés représen...

Discussion

L’ordre à longue portée est une caractéristique essentielle de la plupart des unités physiologiques fonctionnelles. Pendant la morphogenèse, l’ordre est atteint grâce à l’intégration d’instructions complexes mises en œuvre avec une grande précision temporelle et spatiale. Les contraintes multiples et multiniveau sont intégrées dans les arrangements tissulaires stéréotypés.

La polarité et la directionnalité sont essentielles à l’arrangement spatial ordonné pendant l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection