Изображение и анализ ориентации тканей и динамики роста в развивающихся дрозофилы Эпителия во время Pupal Этапы

Резюме

Этот протокол предназначен для визуализации и анализа динамики клеточной ориентации и роста тканей в эпидемии брюшной полости Drosophila, поскольку плодовая муха подвергается метаморфозе. Описанная здесь методология может быть применена к изучению различных стадий развития, тканей и субклеточных структур в дрозофиле или других модельных организмах.

Аннотация

В многоклеточных организмах зрелые ткани и органы демонстрируют высокую степень порядка в пространственных расположениях их составных клеток. Замечательный пример приводится сенсорной эпителии, где клетки же или различных идентичностей собираются вместе через клеточные клетки слипа с указанием высокоорганизованных планарных моделей. Клетки выравниваются друг с другом в том же направлении и отображают эквивалентную полярность на больших расстояниях. Эта организация зрелой эпителии устанавливается в течение морфогенеза. Чтобы понять, как достигается планарное расположение зрелой эпителии, важно отслеживать ориентацию клеток и динамику роста с высокой пространственно-временной точностью во время развития in vivo. Надежные аналитические инструменты также необходимы для выявления и характеристики переходов на местном к глобальному характеру. Дрозофила куколка является идеальной системой для оценки ориентированных изменений формы клеток, лежащих в основе эпителиального морфогенеза. Pupal развивающихся эпителий представляет собой внешнюю поверхность неподвижного тела, что позволяет долгосрочное изображение нетронутых животных. Описанный здесь протокол предназначен для изображения и анализа поведения клеток как на глобальном, так и на местном уровне в эпидермисе брюшной полости pupal по мере его роста. Описанная методология может быть легко адаптирована к визуализации клеточного поведения на других стадиях развития, тканях, субклеточных структурах или модельных организмах.

Введение

Для достижения своей роли эпителиальные ткани полностью полагаются на пространственную организацию своих клеточных компонентов. В большинстве эпителий клетки не только упакованы друг против друга, чтобы создать точный слой булыжника, но они ориентируются относительно осей тела.

Функциональное значение точной организации тканей очевидно в сенсорных эпителиях, таких как позвоночное внутреннее ухо и сетчатка. В первом случае волосы и поддерживающие клетки выравниваются в определенном осевом направлении, чтобы эффективно чувствовать механические входы, такие как звук и движение^1,2. Аналогичным образом, фоторецептор клеточной пространственной организации имеет важное значение для достижения оптимальных оптических свойств сетчатки³. Таким образом, пространственный контроль положения и ориентации клеток имеет особое значение для правильной физиологической функции.

Дрозофила является голометаболическим насекомым, которое претерпевает полное преобразование своих личинок структуры тела через метаморфозы, что приводит к его взрослых тканей. Дрозофила кукапа является отличной моделью для неинвазивных живой визуализации различных динамических событий, в том числе миграции клеток^{развития 4}, деление клеток и динамика роста⁵, сокращение мышц⁶, гибель клеток⁷, ремонт ран^{ы 8}, и ориентация клеток⁹. У взрослой дрозофилы, внешний эпителий показывает высокую степень порядка. Это легко наблюдается на расположения трихом (т.е. выступы клеток, происходящих из отдельных эпителиальных клеток) и сенсорных щетины по всей поверхности тела мухи¹⁰. Действительно, трихом выровнены в параллельных рядах, направляющих воздушный поток^11. Морфогенез эпителии взрослых и упорядоченное расположение отдельных клеток начинается во время эмбриогенеза и завершается во время стадии pupal. В то время как в эмбрионах клеточные деления, интеркалации и формы изменяют все уменьшающееся предельное управление ткани^12,,13, это возвращается на более поздних стадиях развития, особенно на стадиях pupal, когда муха приближается к зрелости^9.

Неподвижный кукачанка Drosophila обеспечивает идеальную систему для оценки формы клеток и изменения ориентации. Особой преимуществаю является эпидермис брюшной полости. В то время как предшественники взрослой головы, грудной клетки, гениталий и придатков растут и получают узоризм из личинок этапов, гистопласты, которые интегрированы в личиночной эпидермис, начинают расти и дифферециации только при pupariation¹⁴. Эта функция позволяет отслеживать все пространственно-временные события, участвующие в создании порядка тканей в полном объеме⁹.

Гистобласты определяются во время эмбрионального развития на контралатеральных позициях в каждом предполагаемом брюшном сегменте. В рознические брюшной эпидермис взрослого происходит от дорсолатерально расположен гистобласт гнезда, присутствующие в передней и задней отсеков^15,16. По мере расширения гистопластов, заменяющих личиночные эпителиальные клетки (ЛЭК), контралатеральные гнезда предохраняют на дозорной средней линии, образуя конфлюентный лист^{17,,18,,19,20}.

Эта работа описывает 1) методологию для вскрытия, монтажа и долгосрочной живой визуализации кукота Drosophila, и 2) аналитические методы для изучения динамики клеточной ориентации и роста при высоком пространственно-временном разрешении. Здесь представлен подробный протокол, охватывающий все шаги, необходимые от первоначальной подготовки куколок (т.е. постановки и визуализации) до извлечения и количественной оценки функций направленности и ориентации. Мы также описываем, как сделать вывод о местных свойствах тканей из анализа клеточных клонов. Все описанные шаги являются минимально инвазивными и позволяют проводить долгосрочный живой анализ. Описанные здесь методы могут быть легко адаптированы и применены к другим стадиям развития, тканям или модельным организмам.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол делится на пять этапов: (1) постановка куколки, (2) подготовка куколки для визуализации, (3) живое изображение растущей брюшной эпителии, (4) генерации генетической мозаики, (5) обработки и анализа данных (включая разделы, описывающие, как анализировать динамику ориентации клеток от клеточных соединений и динамику роста от клеточных клонов).

1. Постановка дрозофилы купыки до изображения

1. Культура летает соответствующего генотипа на стандартной среде в пластиковых флаконах при 25 градусах По цельсии в течение 5 дней (12 ч) после откладки яиц (AEL).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метаморфозы начинается в заключении третьего в звезде личинок в pupal случае на 120 ч AEL до 0 ч после образования пупария (APF). Этот переход легко идентифицировать, потому что личинки перестают подавать и двигаться, а оперкулярная область образуется(рисунок 1А)при 0-12 ч APF. Пупарий изначально мягкий и белый, но постепенно затвердевает и загорает.
2. Перенесите белые препуп (0 ч APF) в свежий пластиковый флакон с помощью увлажненной кисти. До желаемого возраста животных можно содержать при разных температурах в зависимости от разработанного эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Pupa формирования (т.е. щенка) происходит при 12 ч APF, когда голова и придатки взрослой мухи полностью everted(Рисунок 1A). К этому времени pupal случае полностью отделенотота от кукота, что позволяет его полное удаление(рисунок 1А).

2. Подготовка куски для живой визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: После постановки, куски вскрыты и установлены, как описано ниже (см. также Рисунок 1).

1. Удалить постановочные кулаки со стены флакона с помощью щипц.
2. Клей вентральную сторону каждого куколка на стеклянной горке, покрытой двусторонней липкой лентой. Аккуратно нажмите на голову spiracles (т.е. оперкулярной области) и спинной поверхности куколки с кончиками щипцов, чтобы обеспечить прилипание pupal случае ленты(Рисунок 1A, B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность доза должна лицом вверх, чтобы облегчить вскрытие корпуса и восстановление кунпы.
3. Начните вскрытие под стереомикроскопом, аккуратно удалив оперкулум из пупария с помощью щипстки(рисунок 1C).
4. Вставьте один кончик щипцов в небольшой угол между pupal случае и поверхности куколки через оперкулярное отверстие. Разорвать случае с головы до хвоста боковой в одном или нескольких качели, избегая щипать кукула(Рисунок 1D). Сложите назад трещины pupal случае боковой стороны, как вы держите приступить к задней конца (Рисунок 1E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Pupal случае довольно жесткой и трещины легко. В случае высокой влажности или, в частности, генотипического фона, pupal случае становится мягче и разрыв сложнее. В этих случаях, растрескивание pupal случае может быть оказана помощь, колоть его свободные края с обеих кончиков щипцы.
5. Удалите кукула из открытого pupal случае, тщательно вставив щипцов под животное и осторожно подтягивая(Рисунок 1F). Куколка будет придерживаться кончика щипцы(Рисунок 1ГЗЗ).
6. Перенесите куколку с помощью щипушек в стеклянное дно и отбросьте ее на небольшую каплю газопроницаемого галоуглеродного масла(рисунок 1I). Держите кукула мягко на брюшной стороне, чтобы избежать возможных повреждений тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Капля галоуглеродного масла должна быть небольшой, с диаметром примерно менее половины длины кукапов. Такого количества достаточно, чтобы приклеить куколку к стеклу капиллярностью и исправить оптику для целей погружения в масляное масло.
7. Roll кусок влажной бумаги ткани по краям блюда для поддержания влажности. Обложка блюдо, чтобы избежать обезвоживания кускатолей во время визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как женщины, так и мужчины кухонь могут быть использованы для визуализации. Мы рекомендуем использовать третий брюшной сегменты (AIII) в качестве эталонного метамира брюшной пол, так как он почти идентичен у обоих полов с точки зрения размера, формы и узорства.

3. Live изображения растущей эпителии брюшной полости

ПРИМЕЧАНИЕ: Перевернутый лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный целью погружения масла 40x/1.3 NA, использовался для изображения куколок на различных стадиях развития.

1. Ориентируйте куколку над падением масла на стеклянно-дно тарелку согласно домену и процессу, подстерегаютому (например. dorsolaterally для долгосрочного изображения в реальном времени предыдущего расширения преоткуда гнезд, или dorsally к изображению их последнего расширения и ремоделирования ткани). Смотрите Рисунок 1J,K и Рисунок 4.
2. Перенесите стеклянное дно блюдо, содержащее установленных куколки, на сцену микроскопа и сосредоточьтесь на поверхности брюшной полости с помощью передаваемого света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если этот протокол оптимизирован для визуализации на перевернутых микроскопах, можно также выполнять визуализацию на вертикальном микроскопе. В этом случае образец помещается на сцену микроскопа с поверхностью стеклянного дна вверх. Галоуглеродное масло держит каждую кукучу на мениска.
3. Установите параметры приобретения: 1) количество срезов, как правило, между 20-40, чтобы позволить соответствующую двухмерную (2D) реконструкцию брюшной эпидермис; 2) размер шага между каждым ломтиком (например, 1 микрон); 3) временной интервал для записи (интервал 5 мин подходит для анализа высокой точности динамики ориентации клеток); и 4) разрешение кадра (например, 1024 x 1024).
4. Включите соответствующие лазеры (т.е. 488 нм и 561 нм для визуализации фторофоров GFP и RFP соответственно) и отрегулируйте лазерную мощность и настройки усиления/смещения для визуализации отмеченных клеток. Используйте самую низкую возможную мощность лазера (в диапазоне 5%-20%) для минимизации фотоотбелевания и фототоксичности.
5. Вручную установите положение и соответствующие лимиты для нескольких кусков с использованием присоединенной моторизованной стадии и программного обеспечения для мультипозиционного приобретения микроскопа.

4. Поколение генетических мозаик для следовывать поведения клонов клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем митотическую рекомбинацию, чтобы вызвать генетическую мозаику в брюшной эпителии через специфичную рекомбинацию (система FLP/FRT^21,,22)(Рисунок 2).

1. Крест девственных самок, перевозящих тепловой шок-индуцированных Flippase transgene (hs-FLP), цель распознавания FLP (FRT) сайт в определенном геномном месте (например, МЕСТО FRT в положении 40A на рукоятке L хромосомы 2), и recognizable клеточный маркер (например, Ubi-RFP.nls или Ubi-GFP.nls) distal к месту FRT, к мужчинам мутанта нося место FRT на эквивалентном геномном положении (рисунок 2A'C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Автономные и неавтономные эффекты внутри или снаружи клонов для любой потери гена функции могут быть изучены с использованием конкретных рецессивных аллелей дистальных на сайте FRT.
2. Создание соматических клонов FLP/FRT в гистобластах путем обработки теплового шока на третьей стадии личинок в звезде потомства креста. Это выполняется путем погружения пластиковых флаконов, содержащих животных в водяной бане на 37 градусов по Цельсию в течение 45 мин до 1 ч на блуждающих личинок (LIII) этапе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чувствительный период для митотической рекомбинации является фазой G2 клеточного цикла. Histoblasts арестованы в G2 во время всего развития личинок.
3. Оценка близнецов для отсутствия (т.е. мутантных клеток) или повышение (т.е., дикий тип двухпятчечных клеток) уровни флуоресцентного маркера белка от 16 ч APF вперед (Рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, 45 мин до 1 ч при 37 градусах Цельсия делает примерно 2-3 двойных клонов на область интереса (например, гемиссегмент брюшной полости). Pupae показаны слишком высокой плотности клона (например, более четырех близнецов клонов на гемисегмент) должны быть удалены из дальнейшего количественного анализа.
4. При идентификации клонов, изображение живущих кусков на нужной стадии и в течение желаемого периода времени, как описано в предыдущем разделе.

5. Обработка и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные обрабатываются с помощью ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

1. Различать динамику ориентации клеток от контуров клеточного соединения.
   1. Проект срезов, приобретенных конфокальной микроскопией в 2D, с использованием функции максимальной интенсивности проекции (MIP) ImageJ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество срезов на стек следует свести к минимуму, чтобы избежать вне фокуса шума, создаваемого макрофаги патрулируют под эпидермис.
   2. Установите систему планарных координат, определяющую надежные ориентиры тканей (например, границы отсека A/P) для анализа каждого набора данных(рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование одних и тех же планарных ссылок для каждого набора данных позволит сравнить несколько измерений.
   3. Используйте плагин OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) ImageJ^23,24 на локальных краях ячейки для получения качественных и количественных значений ориентации. Плагин отображает цветные накладки на входных изображениях на основе локальных ориентаций и обеспечивает числовые значения при использовании в количественном режиме(рисунок 3B'B' и Рисунок C'C'''').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин OrientationJ основан на структуре тензоров, 2 х 2 матрицы eigenvalues, полученных из градиентных и направленных производных (см. ссылки^23,24 для подробного описания).
   4. Используйте опцию «Дистрибуция Ориентации J» для цветовых ориентиров к опереки ячеек по отношению к установленной системе планарных координат (т.е. карты ориентации опереков ячеек)(рисунок 3B). Вариант распределения находится под меню плагина в ImageJ. Настройки для использования: Гауссиан окно сигма 1 пиксель; Кубический Сплайн - Градиент; Минимальная согласованность - 20%; Минимальная энергия - 1%. Ориентации на оперенные ячейки отображаются в виде цветного изображения с использованием опции Color Survey плагина (Hue s ориентация; Насыщенность и согласованность; и Яркость и входном изображении).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Области, которые содержат фонфлуоресценции не обеспечивают какой-либо направленной информации и должны быть вручную исключены из анализа. Настройки высокого порога уменьшают пиксели, рассматриваемые в обработанных изображениях.
   5. Используйте опцию OrientationJ Measure для количественной оценки клеточных ориентаций и выравнивания клеток (т.е. согласованности)(рисунок 3C). Опция Measure находится под меню плагина в ImageJ. Создание небольших смежных неперекрывающихся областей, представляющих интерес (ROIs) равномерного веса (64 х 64 пикселей, около 20 мкм х 20 мкм) в пределах области, занимаемой гистобластами (Рисунок 3C).
   6. Рассчитайте доминирующую локальную ориентацию (т.е. усредненнюю ориентацию между соседними ячейками в среднем на карту ориентации опереки ячейки) и согласованность от ROIs. Программное обеспечение вычисляет преобладающую ориентацию и локальную согласованность в рамках каждой рентабельности инвестиций(рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самые большие и маленькие eigenvalues структуры тензор оценивается OrientationJ используются для расчета согласованности как соотношение между их разница и их сумма. Согласованность ограничена между значениями 0'1. Значение 1 указывает на полное единообразие выравнивания, в то время как значение 0 указывает на изотропные области без выравнивания.
   7. Статистический анализ рассчитанных значений ориентации и согласованности с нескольких изображений с помощью свободных пакетов программного обеспечения, таких как PAST²⁵. Осевые данные, такие как значения ориентации (в градусах), надлежащим образом описаны направленной статистикой.
   8. С помощью программного обеспечения вычислите среднее направление и круговую дисперсию для каждого набора распределений ориентации. Статистическая значимость разницы между распределением ориентаций между различными генотипами или условиями определяется с помощью непараметрического теста Mardia-Watson-Wheeler (W-test) для равного распределения.
   9. Рассчитайте статистическую значимость разницы в согласованности приприменении непараметрического теста Колмогорова-Смирнова (тест К-С). Отображение данных графически по желанию (полярные участки, диаграммы баров, участки коробок и т.д.).
2. Динамика роста от клеточных клонов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги позволяют получить геометрические и параметры формы для ячеек из 2D MIP изображений, содержащих клон (ы) интерес. Для сравнения между несколькими клонами изображения должны быть приобретены с одинаковыми настройками.
   1. Сегментклон области, рисуя их контуры с помощью инструмента выбора Freehand ImageJ.
   2. Рассчитать геометрические и параметры формы с помощью инструмента Set Measurements ImageJ в меню Analyse. Активировать область, периметр, Fit Ellipse, и формы дескриптор вариантов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит получить различные геометрические параметры, включая область (сумма пикселей внутри клона), периметр (сумма пикселя клонной границы), соотношение сторон (AR, соотношение между основными и незначительными осями наиболее подходящего Эллипса Легендра, вписанного в клонную границу), и угол ориентации (т.е. угол основной оси относительно границы).
   3. Вычисление немерных соотношений из этих измерений восстанавливает параметры формы. К ним относятся округлость (4 х «область»/х «основная ось»^2),шероховатость (твердость - область/выпуклостная область) и круговая (4 х «область»/«периметр»²).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из параметров формы представляет степень отклонения клонов от идеальных форм, таких как круг или ограниченный выпуклой корпус, и все они ограничены между значениями 0 и 1. Значения, равные 1, указывают на максимальную симметрию (т.е. минимальную сложность).
   4. Статистический анализ геометрических и формовых параметров между различными генотипами или условиями с помощью Microsoft Excel и/или PAST. Статистическая значимость разницы определяется с помощью непарного двуххвостого студенческого t-теста на равную среднее или непараметрического Колмогорова-Смирнова K-S-теста на равное распределение между условиями. Данные могут отображаться графически по желанию (например, диаграммы баров, участки коробок и т.д.). Смотрите рисунок 5.

Результаты

Описанный выше протокол охватывает подготовку крозофилы кунпек для длительной живой визуализации и процедуры анализа ориентации клеток и динамики роста брюшной эпидермиса. Применяя эту методологию, можно создавать фильмы высокого разрешения развивающихся кук...

Обсуждение

Дальнобойный порядок является важной характеристикой большинства функциональных физиологических единиц. Во время морфогенеза порядок достигается за счет интеграции сложных инструкций, реализованных с высокой временной и пространственной точностью. Многоуровневые ограничения инт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection