使用激光多普勒流测量测量大鼠脑血流自动调节的评估

摘要

本文演示了使用激光多普勒流量测量来评估大脑循环在动脉血压降低期间自动调节其血流的能力。

摘要

在研究大脑血流调节机理时，可以使用激光多普勒流量测定仪（LDF）获得对微循环血流的相对测量。本文演示了一种封闭的颅骨制备，允许在不穿透头骨或安装腔室或脑窗的情况下评估脑血流。为了评估自动调节机制，可以同时使用LDF，同时利用通过分级出血控制血压降低的模型。这使得实时跟踪血流的相对变化，以响应循环血量的戒断所产生的动脉血压降低。这种范例是研究脑血流在动脉血压降低期间自动调节的宝贵方法，并且，在协议稍作修改后，作为出血性休克的实验模型也很有价值。除了评估自动调节反应外，LDF 还可用于监测皮质血流，用于调查调节脑血流和各种实验的影响的代谢、造血、内皮、体液或神经机制脑血流的介入和病理状况。

引言

大脑循环中的自动调节机制在维持大脑平衡和正常功能方面起着至关重要的作用。脑血流的自动调节受心率、血速、灌注压力、脑阻力动脉直径、微循环阻力等多种因素的影响，这些因素对维持大脑总脑血流在全身血压生理范围内的作用。当动脉压力增加时，这些机制收缩动脉和阻力动脉，以防止颅内压力的危险增加。当动脉血压降低时，局部控制机制使动脉稀释，以保持组织灌注和_O2分娩。各种病理状况，如高帽病、创伤性或全球缺氧性脑损伤，以及糖尿病微血管病^{1、2、3、4、5、6，}可能会破坏大脑自动调节其血流的能力。例如，慢性高血压将有效的自动调节范围向高压力^7、8、9转移，高盐（HS）饮食不仅干扰脑微循环¹⁰的正常内皮依赖性扩张，而且会削弱脑循环中自动调节机制在动脉^{压力降低时}扩张和维持组织灌注的能力。大脑自动调节也损害在达尔盐敏感大鼠时，他们被喂食HS饮食^12。

在动脉压力降低期间，尽管灌注压力降低，但脑阻力动脉和动脉的扩张最初使脑血流恢复控制值。随着动脉压力的进一步降低，脑血流在较低压力（自动调节反应的高原阶段）保持恒定，直到血管不再扩张以保持血流量在较低压力下。器官能够维持正常血流的最低压力称为自动调节 （LLA） 的下限。在LLA以下的压力下，脑血流量从静息值中显著减少，并且随着动脉灌^注压力的每次降低，脑血流以线性方式^减少。如高血压^7、8、9所观察到的LLA向上移位，在动脉灌注压力降低（例如心肌梗死、缺血性中风或循环休克）的情况下，可能会增加缺血损伤的风险和严重程度。

LDF已被证明是评估微循环中血流的极有价值的方法，在各种情况下，包括大脑循环^11、14、15的血流的自动调节。除了评估自动调节反应，LDF可用于监测皮质血流时，调查代谢，造血，内皮，体液，或神经机制，调节大脑血流和各种实验干预和病理条件对脑血流^的影响10，16，17，18，19，20，21。

LDF测量反射激光的变化，以响应运动粒子的数量和速度，在这种情况下，红血球（RBC）。对于脑血管自动调节的研究，动脉血压通过注射α-肾上腺素激动剂来增加动脉压力而改变（因为大脑循环本身对α-阿德雷涅克血管收缩剂激动剂不敏感^）12、15或通过控制血量戒断来降低动脉压力^11、14。在本研究中，LDF用于演示降压对健康大鼠大脑自动调节的影响。虽然文献中已经描述了开闭头骨方法^，但本文展示了一个封闭的头骨准备，允许在不穿透头骨或安装室或脑窗的情况下评估脑血流。

研究方案

威斯康星医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准了本文中描述的所有协议，所有程序都符合国家卫生研究院 （NIH） 实验室动物福利办公室 （OLAW） 的要求。法规。

1. 实验动物和准备录音

1. 使用重达250~300克的8~12周大雄性斯普拉格-道利大鼠。对于这些实验，喂食大鼠的标准饮食包括0.4%纳氯、200克/千克碱、3克/千克DL-蛋氨酸、497.77克/千克蔗糖、150克/千克玉米淀粉、50克/公斤玉米油、50克/公斤纤维素、2克/公斤胆碱酸酯、35克/千克矿物混合物和10克/千克维生素混合。
2. 使用数据采集软件或任何类似的记录方法记录动脉血压和 LDF 读数。
3. 将动脉压力传感器连接到记录系统的一个通道，将 LDF 探头连接到记录系统上的另一个通道。
4. 在测量之前，校准激光多普勒探头以设定运动标准，并确保激光多普勒流量计提供稳定的输出。
5. 准备准备手术和实验所需的额外设备:解剖显微镜、啮齿动物呼吸机、端潮CO₂监测仪、固定大鼠头部的立体仪器以及用于在皮环上定位LDF探头并保持其稳定位置的微操作器。

2. 外科准备

1. 用3.5%异苯二苯和30%O₂补充剂在诱导室中称量大鼠并麻醉动物。
2. 从感应室中取出动物，用30%O₂补充剂代替麻醉面膜，提供1.5~3%异苯二苯。
3. 将大鼠放在保持在37°C的循环水毯上，用脚趾捏检查反射，以确保有退能反射。在双眼涂上无菌性眼膏，防止角膜干燥。
4. 下颌骨顶部、腹颈区域和股骨三角形。从这些区域去除任何松散的头发，用酒精清洁。
5. 将大鼠置于加热垫上，并用循环温水泵将动物的体温保持在37°C，并用医用胶带将其暂时固定到垫子上。
6. 安装气管管管（PE240聚乙烯管）通过颈部的腹腔切口，如其他地方²⁶所述。
7. 将气管管连接到末端潮汐 CO₂监视器和呼吸机，提供 2.5-3.0% 异氟胶（取决于动物大小）和 30% O₂吸入补充剂。确保设置和监测呼吸速率、吸气时间和分钟通气量，以确保在整个实验中，过期的末端潮汐 CO₂约为 35 mmHg。
   注:这通常以大约48~60次呼吸/分钟、1.70~2.30 mL的潮汐量和250~300克大鼠的灵感时间为0.50~0.60秒实现。
8. 在等向NaCl溶液中填充两个PE50聚乙烯管扣，加入1U/mL肝素，以防止凝固并保持导管的聚碳酸性。填充后，用手术剪刀将每个导管的开端斜角，以方便插入动脉。
9. 如^{其他地方27}所述，将左右股动脉的导管进行分管，以便持续监测一导管中的动脉压力，并从另一导管中抽血。
   1. 在解剖显微镜下小心地将动脉与周围组织分离后，将动脉的远端缝合，并在动脉的中间和近端周围放置两个额外的缝合线，而不会拧紧结。
   2. 使用近端缝合作为提升结扎，以防止在切口后从动脉出血，以插入导管（步骤 2.11）。
10. 将从导流板制成的 V 形导线插入动脉下方，以便遮挡容器，直到套管牢固。
11. 在解剖显微镜下，使用Vannas剪刀在远端结扎附近的股动脉上做一个小切口。将切口的切口插入切口，并将其推进到股动脉中。拧紧中间连结上的结，将管紧固定到位，这样当提起连结或回形针被移除时，不会因动脉压力而脱落。
12. 拧紧中间连字后，松开提升连字上的张力和/或取出回形针，并拧紧近端连字。
13. 用细缝合线（3+0 真丝）或手术钉关闭切口。或者，根据切口的大小，在切口部位上放置潮湿的纱布。

3. 用于 LDF 测量的骷髅变薄

1. 在导管到位后，立即将动物置于一个胸腔位置，并将头部固定在立体装置中，小心不要拔下导管或气管管。
2. 使用手术剪刀在覆盖颅骨的皮肤中做椭圆形切口。使用棉签去除任何结缔组织，确保颅骨清洁干燥。在头皮切口周围放置一小块拉长和滚动的纸巾，以阻止任何出血。
3. 在解剖显微镜下，使用 Dremel 工具或具有 2.15 mm 钻头的牙科钻头，在左体感觉皮质的骨骼区域（大约 0.5-1 厘米，取决于大鼠的大小）中薄一小段骨。
   注意:缓慢小心地薄骨，以避免穿透头骨。执行此步骤时，应自由应用盐水溶液，以防止区域过热。
4. 一旦头骨变薄，区域呈粉红色外观和/或血管可视化，用矿物油覆盖区域，并使用微操作器将激光多普勒探头置于暴露的脑微循环上，使探头的尖端正好接触矿物油池的顶部（图1）。
   注:在没有任何外部振动会干扰激光多普勒读数且探头在整个实验过程中牢固地固定在同一目标区域的区域进行 LDF 测量至关重要。

4. 评估脑血管自动调节

1. LDF 探头固定到位后，在开始实验前留出 30-45 分钟的平衡周期。平衡期后，每 30 秒测量平均动脉压力 （MAP） 和激光脑血流 （LCBF） 2 分钟，并平均值以获得出血前血压和 LCBF 的基线值。
2. 要评估脑血管自动调节对动脉压力降低的反应，测量LCBF和MAP后连续从股动脉¹¹提取1.5 mL的血液。要保留导管专利，请确保每次抽血后注入的肝素溶液（100 U/mL，以等同盐水表示）大约等于导管体积。
   注:当注入肝素溶液以保持导管控制时，重要的是将肝素溶液的体积与导管的体积尽可能匹配，以防止动物收到过多的肝素，这可能导致不必要的出血。
3. 每次取血后，让大鼠平衡2分钟，之后MAP和LCBF每30秒记录2分钟。 重复血量提取，直到动物达到大约20毫米汞柱的MAP。
4. 通过确定从出血前 MAP 到 LLA 的血压范围（步骤 4.5 和 5.3，下文），确定有效的自动调节范围。
5. 通过确定 LCBF 在血量戒断后仍返回到出血前控制值的 20% 以内的最低压力^，确定LLA，或者通过识别在自动调节的高原阶段和 LLA 以下确定的回归线的交点，LCBF 随着每次连续采血而减少（步骤 5.3，下图）。
   注:定义LLA和自动调节高原的标准可能因实验室（例如，Takada等人²⁸与Jones等人^29）以及降低动脉血压的程序（例如，提取特定量的血液与控制出血达到特定的动脉压力水平^）11不同。
6. 在实验结束时，根据IACUC的批准，在麻醉的手术平面下，通过制造双边肺气肿对动物实施安乐死。
7. 动物被安乐死后在组织中获得的LDF值将为实验设置提供零基线流动值。

5. 统计分析

1. 执行线性回归分析，以评估 LDF 值与其相应的动脉压力之间的相关性。使用动物安乐死后获得的基线 LDF 读数，以确保没有影响测量流量的非特定 LDF 信号。
2. 使用自动调节高原上方和下方的回归线之间的交点计算 LLA。要使用此方法计算 LLA，请将两个回归方程组合起来，并求解动脉压力的结果方程。
3. 在比较不同的实验组时，使用线性回归分析计算每个动物的LLA上方和下方的LDF与动脉压力关系的斜率，并将其总结为该实验组中动物的均值= SEM。

结果

图2总结了10只雄性斯普拉格-道利大鼠喂食标准实验室的试验结果。在这些实验中，平均LCBF在前三次血量戒断后保持在出血前值的20%以内，直到平均动脉压力达到LLA。随后在LLA以下压力下抽取血量导致LCBF逐渐减少，表明脑循环不再能够产生足够的血管扩张水平，以维持在较低的灌注压力下脑血流恒定。

图 3总结了高原相中的平均动...

讨论

使用激光多普勒流量测定 （LDF） 评估组织血流反应。如上所述，LDF 信号与微循环中移动粒子的数量和速度成正比，在这种情况下为 RBC。不同器官的LDF读数与电磁流量计和放射性微球³⁰等既定方法评估的全器官血流密切相关，与评价可点化动脉制剂^{10、31、32、33、34}和原位微循环制剂

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 braided black silk suture	Midwest Vet	193.73000.2
Arterial Pressure Transducer	Merit Medical	041516504A
Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system)	DATAQ Instruments
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Circulating warm water pump	Gaymar Industries	T-pump
End-tidal CO2 monitor	Stoelting	Capstar-100
Heparin Sodium	Midwest Vet	191.46720.3
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Laser Doppler Flow Meter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
Laser Doppler Refill Motility Standard	Perimed	PF1001
Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)	VWR	63018-828
Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)	VWR	63019-048
Rodent Ventilator	Cwe/Stoelting	SAR-830/P
Saline	Midwest Vet	193.74504.3
Sprague-Dawley Outbred Rats	Variable	N/A	Rats were ordered from various companies
Standard Rat Chow	Dyets, Inc.	113755
Stereotaxic Instrument	Cwe/Stoelting	Clasic Lab Standard