레이저 도플러 흐름 측정을 사용하여 쥐에 대뇌 혈액 흐름 자동 조절의 평가

요약

이 문서는 동맥 혈압감소 시 혈류를 자동으로 조절하는 대뇌 순환의 능력을 평가하기 위해 레이저 도플러 유동측정의 사용을 보여줍니다.

초록

대뇌 혈류를 조절하기위한 신체의 메커니즘을 조사 할 때, 미세 순환 혈류의 상대측정은 레이저 도플러 유량 측정법을 사용하여 얻을 수있다 (LDF). 이 논문은 두개골을 관통하거나 챔버 또는 대뇌 창을 설치하지 않고 대뇌 혈류를 평가 할 수있는 폐쇄 두개골 준비를 보여줍니다. 자동 조절 메커니즘을 평가하기 위해 등급이 매겨진 출혈을 통한 혈압 감소 조절 모델을 동시에 LDF를 사용하는 동시에 활용할 수 있습니다. 이것은 순환 혈액 볼륨의 철수에 의해 생성된 동맥 혈압의 감소에 응하여 혈류량에 있는 상대적인 변경의 실시간 추적을 가능하게 합니다. 이 패러다임은 동맥 혈압의 감소 동안 대뇌 혈류 자동 조절을 연구하는 귀중한 접근법이며, 프로토콜의 사소한 변형과 함께 출혈성 쇼크의 실험 모델로도 가치가 있습니다. 자동 조절 반응을 평가하는 것 외에도, LDF는 대사, 근생, 내피, 체액, 또는 대뇌 혈류와 다양한 실험의 영향을 조절하는 신경 메커니즘을 조사 할 때 피질 혈류를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 대뇌 혈류에 대한 개입 및 병리학 적 상태.

서문

대뇌 순환에 있는 자동 조절 기계장치는 두뇌에 있는 항상성과 일반적인 기능을 유지하는 중요한 역할을 합니다. 대뇌 혈류의 자동 조절은 심박수, 혈액 속도, 관류 압력, 뇌 저항성 동맥의 직경 및 미세 순환 저항을 포함한 여러 요인에 의해 영향을 되며, 이 모두는 전신 혈압의 생리적 범위에 걸쳐 뇌에서 총 대뇌 혈류를 일정하게 유지하는 역할을 합니다. 동맥 압력이 증가하면 이러한 메커니즘은 동맥 과 저항 동맥을 수축하여 두개내 압력의 위험한 증가를 방지합니다. 동맥 혈압이 감소 하는 경우, 로컬 제어 메커니즘 조직 관류 및 O₂ 전달을 유지 하기 위해 동맥을 팽창. hypercapnia, 외상성 또는 글로벌 저산소 성 뇌 손상, 당뇨병 미세 혈관 병증^과같은 다양한 병리학 적 조건^{1,2,3,4,5,6은} 혈류를 자가 조절하는 뇌의 능력을 방해 할 수 있습니다. 예를 들어, 만성 고혈압은 뇌미세순환10에서 정상내피의존적 팽창을 방해할 뿐만 아니라,^10의동맥압력이^감소될때 조직 관류를 수축시키고 유지하기 위해 뇌순환에서 자동조절기전의 능력을 저하시킬 뿐만 아니라^7,8,9,및 고염(HS) 식이를 더 높은 압력으로 변화시게 된다. 대뇌 자동 조절은 또한 HS 규정식^12를공급할 때 달 소금에 민감한 쥐에서 손상됩니다.

동맥 압력의 감소 동안, 대뇌 저항 동맥과 동맥의 팽창은 처음에 감소 된 관류 압력에도 불구하고 값을 제어하기 위해 대뇌 혈류를 반환합니다. 동맥 압력이 더 감소함에 따라, 대뇌 혈류는 혈관구조가 더 낮은 압력에서 혈류를 유지하기 위해 더 이상 팽창할 수 없을 때까지 낮은 압력(자동 조절 반응의 고원 단계)에서 일정하게 유지됩니다. 기관이 정상적인 혈류를 유지할 수있는 가장 낮은 압력은 자동 조절 (LLA)의 하한이라고합니다. LLA 이하의 압력에서, 대뇌 혈류량은 휴식 값에서 현저하게 감소하고 동맥 관류 압력의 각 감소와 함께 선형 방식으로 감소^13,14. 고혈압^7,8,9에서관찰된 바와 같이 LLA의 상향 변화는 동맥 관류 압력이 감소되는 조건(예: 심근 경색, 허혈성 뇌졸중 또는 순환쇼크)에서 허혈성 손상의 위험과 중증도를 증가시킬 수 있다.

LDF는 대뇌 순환에서의 혈류의 자동 조절을 포함하여 다양한 상황에서 미세순환에서의 혈류를 평가하는 매우 귀중한^{접근법으로 입증되었으며, 11,14,15.} 자동 조절 반응을 평가하는 것 외에도, LDF는 대사, 근생, 내피, 체액, 또는 뇌혈류를 조절하는 신경 기전을 조사할 때 피질 혈류를 모니터링하는데 사용될 수 있으며, 대뇌 혈류에 대한 다양한 실험적 개입 및 병리학적 조건의 영향을 조절하는^{10,16,17,18, 19,20.}

LDF는 움직이는 입자의 수와 속도에 반응하여 반사된 레이저 광의 변화를 측정합니다.이 경우 적혈구 (RBC). 뇌 혈관 자동 조절에 대한 연구의 경우, 동맥 혈압은 동맥 혈압을 높이기 위해 알파 아드레날린 작용제의 주입에 의해 변경됩니다 (대뇌 순환 자체가 알파 아드레날린 혈관 수축 작용제 작용제에 민감하지 않기 때문에)^12,15 또는 동맥 혈압을 줄이기 위해 대조 혈액 볼륨 을 감소시키기 위해 ^14. 본 연구에서, LDF는 건강한 쥐의 대뇌 자동 조절에 대한 혈압의 등급 이감소의 효과를 입증하기 위해 활용된다. 문헌^{22,23,24,25에}설명되어 있지만, 본 논문은 두개골을 관통하거나 챔버 또는 대뇌 창을 설치하지 않고도 뇌혈류를 평가할 수 있도록 폐쇄된 두개골 준비를 보여줍니다.

프로토콜

위스콘신 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 이 논문에 설명 된 모든 프로토콜을 승인하고 모든 절차는 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물 복지 (OLAW)를 준수합니다 규정.

1. 실험 동물 및 기록 준비

1. 무게가 250-300 g의 8-12주 된 수컷 스프라그-다울리 쥐를 사용하십시오. 이러한 실험을 위해, 사료 쥐에 0.4% NaCl, 200 g/kg 카제인, 3 g/kg DL-메티오닌, 497.77 g/kg 수크로오스, 150 g/kg 옥수수 전분, 50 g/kg 옥수수 오일, 50 g/kg 셀룰로오스, 2 g/kg 콜린 비트 아트, 35 kg/ g.
2. 데이터 수집 소프트웨어 또는 유사한 기록 방법을 사용하여 동맥 혈압과 LDF 판독값을 기록합니다.
3. 동맥 압력 트랜스듀서를 레코딩 시스템의 한 채널에 연결하고 LDF 프로브를 레코딩 시스템의 다른 채널에 연결합니다.
4. 측정에 앞서 레이저 도플러 프로브를 보정하여 운동성 표준을 설정하고 레이저 도플러 유량계가 안정적인 출력을 제공하는지 확인합니다.
5. 해부 현미경, 설치류 인공호흡기, 끝 조석 CO₂ 모니터, 쥐의 머리를 제자리에 고정하는 입체 적 소기, Pial 미세 순환을 통해 LDF 프로브를 찾아 꾸준한 위치에 유지하는 마이크로 조작기 : 준비 수술 및 실험에 필요한 추가 장비를 준비하십시오.

2. 외과 준비

1. 쥐를 무게와 유도 챔버에서 동물을 마취 3.5% 이소플루란 과 30% O₂ 보충.
2. 유도 챔버에서 동물을 제거하고 30 % O₂ 보충제로 1.5-3 %의 이소플루란을 전달하는 마취 마스크를 대체하십시오.
3. 37 °C에서 유지 순환 물 담요에 쥐를 배치하고 철수 반사가 있는지 확인하기 위해 발가락 핀치와 반사를 확인합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 두 눈에 멸균 안과 연고를 적용하십시오.
4. 두개골, 복부 목 부위 및 대퇴 삼각형의 상단을 면도하십시오. 그 지역에서 느슨한 머리카락을 제거하고 마찰 알코올로 청소하십시오.
5. 37 °C에서 동물의 체온을 유지하기 위해 순환 온수 펌프와 가열 패드에 supine 위치에 쥐를 배치하고 일시적으로 의료 테이프를 사용하여 패드에 고정.
6. ^다른곳에서 설명한 바와 같이 목내 복부 절개를 통해 기관 캐뉼러(PE240 폴리에틸렌 튜브)를 설치한다.
7. 기관 캐뉼라를 말조 CO₂ 모니터와 2.5-3.0% 이소플루란(동물의 크기에 따라 다름)과 30%_O2 흡입 보충제를 전달하는 인공호흡기에 부착합니다. 실험 전반에 걸쳐 약 35 mmHg의 만료된 단면_CO2를 보장하기 위해 호흡속도, 흡기 시간 및 미세 한 환기 볼륨이 설정되고 모니터링되는지 확인하십시오.
   참고 : 이것은 일반적으로 약 48-60 호흡 / 분의 호흡 속도, 1.70-2.30 mL의 조수 볼륨, 그리고 250-300 g 쥐에 대한 0.50-0.60s의 영감 시간으로 달성된다.
8. 응고를 방지하고 카테터의 개통을 유지하기 위해 원소 NaCl 용액에 1 U/mL 헤파린으로 PE50 폴리에틸렌 캐뉼라 2개를 채웁니다. 충전 후, 동맥에 삽입을 용이하게하기 위해 수술 가위로 각 캐뉼러의 열린 끝을 경사.
9. 다른 곳에서 설명된 대로 좌우 대퇴 동맥을^{캔브레이트(27)는} 다른 카테터에서 동맥 압의 지속적인 모니터링과 다른 카테터로부터의 혈액 철수를 허용한다.
   1. 해부 현미경으로 주변 조직에서 동맥을 조심스럽게 분리 한 후 동맥의 말단을 분리하고 매듭을 조이지 않고 동맥의 중간 및 근위 끝 주위에 두 개의 추가 봉합사를 배치하십시오.
   2. 캐뉼라 삽입을 위해 절개 후 동맥에서 출혈을 방지하기 위해 근위 봉합사를 리프팅 합자로 사용하십시오 (단계 2.11).
10. 캐뉼라가 고정될 때까지 혈관을 가리기 위해 동맥 아래에 있는 종이 클립으로 만들어진 V자 형 와이어를 삽입합니다.
11. 해부 현미경으로 Vannas 가위를 사용하여 말단 결찰 근처의 대퇴 동맥에서 작은 절개를합니다. 절개에 캐뉼라의 절마된 끝을 삽입하고 대퇴 동맥으로 진행합니다. 리프팅 합자 또는 종이 클립을 제거 할 때 동맥 압력에 의해 빠지지 않도록 캐뉼러를 제자리에 고정하기 위해 중간 합자에 매듭을 조입니다.
12. 중간 합자를 조인 후 리프팅 합자에 장력을 해제하거나 종이 클립을 제거하고 근위 합자를 조입니다.
13. 미세 봉합사 (3-0 실크) 또는 수술 스테이플로 절개를 닫습니다. 또는 절개 부위 위에 축축한 거즈를 놓습니다.

3. LDF 측정을위한 두개골 숱이

1. 캐뉼라가 제자리에 놓인 직후, 동물을 흉골 위치에 놓고 카테터 나 기관관을 빼내지 않도록주의하면서 스테레오 택시 장치에 머리를 고정하십시오.
2. 두개골을 덮는 피부에 타원형 절개를 만들기 위해 수술 가위를 사용합니다. 면봉을 사용하여 결합 조직을 제거하여 두개골이 깨끗하고 건조해지도록 하십시오. 두피에 절개 주위에 작은 길쭉하고 압연 된 티슈 페이퍼를 놓아 출혈을 막습니다.
3. 해부 현미경에서, 왼쪽 또는 오른쪽 체민 관능 피질 위에 정수리 영역에서 뼈의 작은 영역 (쥐의 크기에 따라 약 0.5-1 cm)를 얇게 2.15mm 드릴 비트와 드레멜 도구 또는 치과 드릴을 사용합니다.
   주의: 두개골이 침투하지 않도록 뼈를 천천히 조심스럽게 얇게 합니다. 이 단계를 수행하는 동안 식염수는 영역이 과열되지 않도록 자유롭게 적용해야 합니다.
4. 두개골이 얇아지고 영역이 분홍색 모양 및 / 또는 혈관이 시각화되면, 미네랄 오일로 영역을 커버하고 프로브의 끝이 미네랄 오일 풀의 상단에 닿을 수 있도록 노출 된 대뇌 미세 순환 위에 레이저 도플러 프로브를 배치하는 마이크로 조작기를 사용합니다(그림 1).
   참고: 레이저 도플러 판독값을 방해하는 외부 진동이 없고 실험 기간 동안 동일한 목표 영역에 프로브가 안전하게 고정되는 영역에서 LDF 측정을 수행하는 것이 필수적입니다.

4. 뇌혈관 자동조절평가

1. LDF 프로브가 제자리에 고정되면 실험을 시작하기 전에 30-45분 의 평형 기간을 허용합니다. 평형 기간 후, 평균 동맥압(MAP) 및 레이저 뇌혈류(LCBF)를 2분 동안 30초마다 측정하고 평균값을 평균하여 출혈성 혈압 및 LCBF에 대한 기준값을 얻었다.
2. 동맥 압력 감소에 반응하여 대뇌 혈관 자동 조절을 평가하기 위해, 대퇴 동맥에서 1.5 mL의 연속적인 인금후 LCBF 및 MAP를 측정한다^11. 카테터 특허를 유지하려면, 각 혈액 추첨 후 카테터 부피와 거의 동일한 헤파린 용액 (100 U / mL)이 주입되었는지 확인하십시오.
   참고 : 카테터 의 개통을 유지하기 위해 헤파린 용액을 주입 할 때 동물이 너무 많은 헤파린을 받지 못하게하여 가능한 한 카테터의 부피에 헤파린 용액의 부피를 일치시키는 것이 중요합니다. 출혈.
3. 각 혈액 부피 철수 후, 쥐가 2 분 동안 평형을 허용하고, 그 후 MAP와 LCBF는 2 분 동안 30 초마다 기록됩니다. 동물이 약 20 mmHg의 MAP에 도달 할 때까지 혈액 볼륨 인출을 반복하십시오.
4. 출혈 전 MAP에서 LLA까지의 혈압 범위를 식별하여 효과적인 자동 조절 범위를 결정합니다(단계 4.5 및 5.3, 아래).
5. LCBF가 여전히 혈액 부피 철수 다음 출혈 전 제어 값의 20 % 이내로 반환되는 가장 낮은 압력을 식별하여 LLA를 결정, 앞서 설명한 바와 같이^11,28 또는 자동 조절의 고원 단계 동안 결정 회귀 라인의 교차점을 식별하여 LLA, LCBF는 각 연속혈액 철수와 함께 감소 (단계 5.3, 아래).
   참고: LLA 및 자동 조절 고원을 정의하기 위한 기준은 실험실(예: Takada et al.²⁸ vs. Jones et al.^29)과동맥 혈압 을 감소시키는 절차(예: 특정 동맥 혈압 수준에 도달하기 위해 특정 혈액 대 대조 출혈의 특정 볼륨의 철수)와 다를 수 있습니다^11.
6. 실험의 끝에서, IACUC에 의해 승인 된 마취의 수술 평면에서 양측 기흉을 생성하여 동물을 안락사.
7. 동물이 안락사된 후 조직에서 수득된 LDF 값은 실험 설정에 대한 제로 기준선 유동 값을 제공할 것이다.

5. 통계분석

1. 선형 회귀 해석을 수행하여 LDF 값과 해당 동맥 압 사이의 상관관계를 평가합니다. 동물이 안락사된 후 얻은 기준선 LDF 수치를 사용하여 측정된 유량에 영향을 미치는 비특이적 LDF 신호가 없는지 확인합니다.
2. 자동 규제 고원 위와 아래의 회귀 선 사이의 교차를 사용하여 LLA를 계산합니다. 이 방법을 사용하여 LLA를 계산하려면 두 회귀 방정식을 결합하고 동맥 압력에 대한 결과 방정식을 해석합니다.
3. 다른 실험 군을 비교할 때 선형 회귀 분석을 사용하여 각 동물에 대한 LLA 위와 아래의 LDF 대 동맥 압력 관계의 기울기를 계산하고 해당 실험 군의 동물에 대한 평균 ± SEM으로 요약합니다.

결과

도 2는 표준 실험실 차우를 먹인 10마리의 수컷 스프라그-다울리 쥐를 대상으로 실시한 실험 결과를 요약한 것이다. 이러한 실험에서, 평균 동맥 압력이 LLA에 도달할 때까지, 평균 LCBF는 처음 3개의 혈액 부피 인출 다음 출혈 전값의 20% 이내로 유지되었다. LLA 아래의 압력에서 후속 혈액 볼륨 인출은 LCBF의 점진적 감소를 일으켰으며, 대뇌 순환이 더 낮은 관류 압력에서 대뇌 혈...

토론

레이저 도플러 흐름 측정을 가진 조직 혈류 반응의 평가 (LDF). 위에서 언급한 바와 같이, LDF 신호는 마이크로 순환에서 이동 입자의 수와 속도에 비례한다. 상이한 기관의 LDF 수치는 전자기 유량계 및 방사성^{미소구(30)와} 같은 확립된 방법으로 평가된 전장기 혈류와 잘 상관되며 일반적으로 굴절식 동맥 제제^10,31,32,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 braided black silk suture	Midwest Vet	193.73000.2
Arterial Pressure Transducer	Merit Medical	041516504A
Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system)	DATAQ Instruments
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Circulating warm water pump	Gaymar Industries	T-pump
End-tidal CO2 monitor	Stoelting	Capstar-100
Heparin Sodium	Midwest Vet	191.46720.3
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Laser Doppler Flow Meter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
Laser Doppler Refill Motility Standard	Perimed	PF1001
Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)	VWR	63018-828
Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)	VWR	63019-048
Rodent Ventilator	Cwe/Stoelting	SAR-830/P
Saline	Midwest Vet	193.74504.3
Sprague-Dawley Outbred Rats	Variable	N/A	Rats were ordered from various companies
Standard Rat Chow	Dyets, Inc.	113755
Stereotaxic Instrument	Cwe/Stoelting	Clasic Lab Standard