Evaluación de la autoregulación del flujo sanguíneo cerebral en la rata mediante la fluidmetría Doppler láser

Resumen

Este artículo demuestra el uso de láser Doppler flowmetry para evaluar la capacidad de la circulación cerebral para autoregular su flujo sanguíneo durante las reducciones en la presión arterial.

Resumen

Al investigar los mecanismos del cuerpo para regular el flujo sanguíneo cerebral, se puede obtener una medición relativa del flujo sanguíneo microcirculatorio utilizando lametría de flujo Doppler láser (LDF). Este artículo muestra una preparación de cráneo cerrado que permite evaluar el flujo sanguíneo cerebral sin penetrar el cráneo ni instalar una cámara o ventana cerebral. Para evaluar los mecanismos de autoregulatory, se puede utilizar un modelo de reducción controlada de la presión arterial a través de hemorragia calificada mientras se emplea simultáneamente LDF. Esto permite el seguimiento en tiempo real de los cambios relativos en el flujo sanguíneo en respuesta a las reducciones en la presión arterial producidapor por la abstinencia del volumen sanguíneo circulante. Este paradigma es un enfoque valioso para estudiar la autorregulación del flujo sanguíneo cerebral durante las reducciones de la presión arterial y, con pequeñas modificaciones en el protocolo, también es valioso como modelo experimental de shock hemorrágico. Además de evaluar las respuestas autorreguladoras, el LDF se puede utilizar para monitorear el flujo sanguíneo cortical al investigar mecanismos metabólicos, miogénicos, endoteliales, humorales o neuronales que regulan el flujo sanguíneo cerebral y el impacto de varios mecanismos experimentales intervenciones y condiciones patológicas en el flujo sanguíneo cerebral.

Introducción

Los mecanismos de autorregulación en la circulación cerebral juegan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis y la función normal en el cerebro. La autorregulación del flujo sanguíneo cerebral se ve afectada por múltiples factores, incluyendo la frecuencia cardíaca, la velocidad de la sangre, la presión de perfusión, el diámetro de las arterias de resistencia cerebral y la resistencia microcirculatoria, todos los cuales juegan un papel en el mantenimiento constante del flujo sanguíneo cerebral total en el cerebro sobre el rango fisiológico de las presiones arteriales sistémicas. Cuando aumenta la presión arterial, estos mecanismos constriñen las arterias y las arterias de resistencia para prevenir aumentos peligrosos en la presión intracraneal. Cuando la presión arterial disminuye, los mecanismos de control locales dilatan las arterias para mantener la perfusión tisular y la administración de O_2. Diversas condiciones patológicas tales como hipercapnia, lesión cerebral hipoxica traumática o global, y microangiopatía diabética^1,2,3,4,5,6 puede alterar la capacidad del cerebro para regular automáticamente su flujo sanguíneo. Por ejemplo, la hipertensión crónica desplaza el rango autoregulador efectivo hacia presiones más altas^7,8,9, y una dieta alta en sal (HS) no sólo interfiere con la dilatación normal dependiente del endotelio en la microcirculación cerebral¹⁰, sino que también afecta la capacidad de los mecanismos de autorregulación en la circulación cerebral para dilatar y mantener la perfusión arterial cuando se reduce la presión arterial^11. La autorregulación cerebral también se ve afectada en ratas sensibles a la sal de Dahl cuando se les alimenta una dieta del^{SA 12.}

Durante las reducciones de la presión arterial, la dilatación de las arterias de resistencia cerebral y arteriolas inicialmente devuelve el flujo sanguíneo cerebral para controlar los valores a pesar de la presión de perfusión reducida. A medida que la presión arterial se reduce aún más, el flujo sanguíneo cerebral permanece constante en la presión más baja (fase de meseta de la respuesta autorreguladora) hasta que la vasculatura ya no puede dilatarse para mantener el flujo sanguíneo a la presión más baja. La presión más baja a la que un órgano puede mantener el flujo sanguíneo normal se denomina límite inferior de autorregulación (LLA). A presiones por debajo de la LLA, el flujo sanguíneo cerebral disminuye significativamente de los valores en reposo y disminuye de manera lineal con cada reducción de la presión arterial de perfusión^13,14. Un cambio ascendente en el LLA, como se observa en la hipertensión^7,8,9, puede aumentar el riesgo y la gravedad de la lesión isquémica durante las condiciones donde se reduce la presión de perfusión arterial (por ejemplo, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico, o choque circulatorio).

LDF ha demostrado ser un enfoque extremadamente valioso para evaluar el flujo sanguíneo en la microcirculación en una variedad de circunstancias, incluyendo la autorregulación del flujo sanguíneo en la circulación cerebral^11,14,15. Además de evaluar las respuestas autorreguladoras, LDF se puede utilizar para monitorear el flujo sanguíneo cortical al investigar mecanismos metabólicos, miogénicos, endoteliales, humorales o neuronales que regulan el flujo sanguíneo cerebral y el impacto de diversas intervenciones experimentales y condiciones patológicas en el flujo sanguíneo cerebral^{10,16,17,18,19,20,21}.

LDF mide el cambio en la luz láser reflejada en respuesta al número y la velocidad de las partículas en movimiento, en este caso, los glóbulos rojos (RBC). Para estudios de autoregulación vascular cerebral, la presión arterial se cambia ya sea por la infusión de un agonista alfa-adrenérgico para aumentar la presión arterial (porque la propia circulación cerebral es insensible a los agonistas vasoconstrictores alfa-adrenérgicos)^12,15 o a través de la retirada controlada del volumen sanguíneo para reducir la presión arterial^11,14. En el presente estudio, LDF se utiliza para demostrar los efectos de reducciones calificadas en la presión arterial en la autorregulación cerebral en una rata sana. Aunque los métodos de cráneo abierto y cerrado se han descrito en la literatura^22,23,24,25, el presente documento demuestra una preparación de cráneo cerrado, permitiendo que el flujo sanguíneo cerebral se evalúe sin penetrar el cráneo o instalar una cámara o ventana cerebral.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Wisconsin (IACUC) aprobó todos los protocolos descritos en este documento y todos los procedimientos están en conformidad con la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (OLAW) Reglamentos.

1. Animales experimentales y preparación para el registro

1. Utilice ratas Sprague-Dawley machos de 8 a 12 semanas que pesen 250–300 g. Para estos experimentos, alimentar ratas una dieta estándar que consiste en 0.4% NaCl, 200 g/kg de caseína, 3 g/kg DL-metionina, 497.77 g/kg de sacarosa, 150 g/kg de almidón de maíz, 50 g/kg de aceite de maíz, 50 g/kg de celulosa, 2 g/kg de bitarrate de colina, 35 g/kg de mezcla de mineral.
2. Registre la presión arterial y las lecturas de LDF utilizando software de adquisición de datos o cualquier método de grabación comparable.
3. Conecte el transductor de presión arterial a un canal del sistema de grabación y la sonda LDF al otro canal del sistema de grabación.
4. Antes de la medición, calibrar la sonda Doppler láser para establecer un estándar de motilidad y asegurarse de que el caudalímetro Doppler láser proporciona una salida constante.
5. Preparar el equipo adicional necesario para la cirugía preparatoria y para el experimento: un microscopio de disección, un ventilador de roedores, un monitor CO₂ de marea final, un instrumento estereotaxico para fijar la cabeza de la rata en posición, y un micromanipulador para localizar la sonda LDF sobre la microcirculación pial y mantenerla en una posición estable.

2. Preparación quirúrgica

1. Pesar la rata y anestesiar al animal en una cámara de inducción con 3.5% de isoflurano y 30% O₂ suplemento.
2. Retire el animal de la cámara de inducción y sustituya una máscara anestésica que entregue 1.5–3% de isoflurano con un suplemento de 30% O_2.
3. Coloque la rata sobre una manta de agua circulante mantenida a 37 oC y compruebe los reflejos con un pellizco del dedo del dedo del dedo del tiempo para asegurarse de que hay un reflejo de abstinencia. Aplique pomada oftálmica estéril en ambos ojos para prevenir la desecación corneal.
4. Afeitar la parte superior del cráneo, el área del cuello ventral y los triángulos femorales. Retire el cabello suelto de esas áreas y límpielo con alcohol para frotar.
5. Coloque la rata en posición supina en una almohadilla de calentamiento con una bomba de agua caliente circulante para mantener la temperatura corporal del animal a 37 oC y fijarla temporalmente a la almohadilla con cinta médica.
6. Instale una cánula traqueal (tubo de polietileno PE240) a través de una incisión ventral en el cuello como se describe en otros^{lugares 26.}
7. Fije la cánula traqueal a un monitor de CO₂ de marea final y el respirador que entrega 2.5–3.0% de isoflurano (dependiendo del tamaño del animal) y un suplemento de inhalación del 30% O_2. Asegúrese de que la frecuencia respiratoria, el tiempo inspiratorio y el volumen ventilatorio de minutos estén ajustados y monitoreados para garantizar un_CO2 de marea final caducada de aproximadamente 35 mmHg durante todo el experimento.
   NOTA: Esto se logra generalmente con una frecuencia respiratoria de aproximadamente 48–60 respiraciones/min, un volumen de marea de 1.70–2.30 mL, y un tiempo de inspiración de 0.50–0.60 s para una rata de 250-300 g.
8. Llene dos cánulas de polietileno PE50 con 1 U/ml de heparina en solución isotónica de NaCl para evitar la coagulación y mantener la patencia de los catéteres. Después de rellenar, biselar el extremo abierto de cada cánula con tijeras quirúrgicas para facilitar la inserción en la arteria.
9. Cannute las arterias femorales derecha e izquierda como se describe en otros lugares²⁷ para permitir un monitoreo continuo de la presión arterial en un catéter y la extracción de sangre del otro catéter.
   1. Después de separar cuidadosamente las arterias del tejido circundante bajo un microscopio de disección, ligar el extremo distal de la arteria y colocar dos suturas adicionales alrededor de los extremos medio y proximal de la arteria sin apretar los nudos.
   2. Utilice la sutura proximal como ligadura de elevación para evitar el sangrado de la arteria después de la incisión para la inserción de cánulas (paso 2.11).
10. Inserte un alambre en forma de V diseñado a partir de un clip de papel debajo de la arteria para ocluir el recipiente hasta que la cánula esté asegurada.
11. Bajo un microscopio de disección haz una pequeña incisión en la arteria femoral cerca de la ligadura distal usando tijeras Vannas. Inserte el extremo biselado de la cánula en la incisión y adelántelo a la arteria femoral. Apriete el nudo en la ligadura media para fijar la cánula en su lugar para que no se desaloje por la presión arterial cuando se retire la ligadura de elevación o el clip de papel.
12. Después de apretar la ligadura media, suelte la tensión en la ligadura de elevación y/o retire el clip de papel, y apriete la ligadura proximal.
13. Cierre la incisión con suturas finas (3-0 de seda) o una grapa quirúrgica. Alternativamente, coloque una gasa húmeda sobre el sitio de la incisión, dependiendo del tamaño de la incisión.

3. Adelgazamiento del cráneo para mediciones de LDF

1. Inmediatamente después de que las cánulas estén en su lugar, coloque el animal en una posición esternal y fije la cabeza en un dispositivo esterenoquícico, teniendo cuidado de no desalojar los catéteres o tubo traqueal.
2. Use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión elíptica en la piel que cubre el cráneo. Use un hisopo de algodón para eliminar cualquier tejido conectivo, asegurándose de que el cráneo esté limpio y seco. Coloque un pequeño trozo de papel tisú alargado y enrollado alrededor de la incisión en el cuero cabelludo para detener cualquier sangrado.
3. Bajo el microscopio de disección, utilice una herramienta Dremel o un taladro dental con una broca de 2,15 mm para adelgazar un área pequeña del hueso (aproximadamente 0,5-1 cm dependiendo del tamaño de la rata) en el área parietal sobre la corteza somatosensorial izquierda o derecha.
   ADVERTENCIA: Adelgace el hueso lentamente y con cuidado para evitar penetrar el cráneo. Durante este paso, la solución salina debe aplicarse liberalmente para evitar que la zona se sobrecaliente.
4. Una vez que el cráneo ha sido adelgazado y el área tiene un aspecto rosado y / o se visualizan los vasos sanguíneos, cubrir el área con aceite mineral y utilizar un micromanipulador para colocar la sonda Doppler láser sobre la microcirculación cerebral expuesta de modo que la punta de la sonda está tocando la parte superior de la piscina de aceite mineral(Figura 1).
   NOTA: Es esencial tomar mediciones de LDF en un área donde no haya vibraciones externas que interfieran con las lecturas Doppler del láser y que la sonda se fije de forma segura sobre el mismo área objetivo a lo largo del experimento.

4. Evaluación de la autorregulación vascular cerebral

1. Una vez que la sonda LDF esté fija en su posición, permita un período de equilibrio de 30-45 minutos antes de comenzar el experimento. Después del período de equilibrio, mida la presión arterial media (MAP) y el flujo sanguíneo cerebral láser (LCBF) cada 30 s durante 2 min y promediar los valores para obtener los valores basales para la presión arterial de prehemorragia y LCBF.
2. Para evaluar la autorregulación vascular cerebral en respuesta a la reducción de la presión arterial, medir la LCBF y el MAP tras sucesivos retiros de 1,5 ml de sangre de la arteria femoral¹¹. Para mantener la patente del catéter, asegúrese de que se infunde un volumen de solución de heparina (100 U/ml en solución salina isotónica) aproximadamente igual al volumen del catéter después de cada extracción de sangre.
   NOTA: Al infundir la solución de heparina para mantener la patencia del catéter, es importante que coincida el volumen de la solución de heparina con el volumen del catéter lo más cerca posible para evitar que el animal reciba demasiada heparina, lo que podría causar Sangrado.
3. Después de cada retirada del volumen sanguíneo, permita que la rata se equilibre durante 2 min, después de lo cual el MAP y la LCBF se registran cada 30 s durante 2 min. Repita las retiradas del volumen sanguíneo hasta que el animal alcance un MAPA de aproximadamente 20 mmHg.
4. Determinar el rango de autoregulatory efectivo identificando el rango de presiones arteriales desde el MAPA de prehemorrágicos hasta el LLA (pasos 4.5 y 5.3, abajo).
5. Determinar el LLA identificando la presión más baja a la que LCBF todavía vuelve dentro del 20% del valor de control de prehemrontodespués después de la retirada del volumen sanguíneo, como se describió anteriormente^11,28 o identificando el punto de intersección de las líneas de regresión determinadas durante la fase de la meseta de la autoregulación y por debajo de la LLA, donde LCBF disminuye con cada retirada de sangre sucesiva (paso 5.3, abajo).
   NOTA: Los criterios para definir el LLA y la meseta autoreguladora pueden diferir entre los laboratorios (por ejemplo, Takada et al.²⁸ vs Jones et al.²⁹), así como los procedimientos para reducir la presión arterial arterial (por ejemplo, la retirada de un volumen específico de sangre frente a la hemorragia controlada para alcanzar niveles específicos de presión arterial)¹¹.
6. Al final del experimento, eutanasia al animal mediante la creación de un neumotórax bilateral mientras está bajo un plano quirúrgico de anestesia, aprobado por la IACUC.
7. Los valores de LDF obtenidos en el tejido después de que el animal es eutanasiado proporcionarán el valor de flujo basal cero para la configuración experimental.

5. Análisis estadístico

1. Realice un análisis de regresión lineal para evaluar la correlación entre los valores de LDF y su presión arterial correspondiente. Utilice las lecturas basales del LDF obtenidas después de que el animal sea eutanasiado para asegurarse de que no hubo ninguna señal LDF inespecífica que afectara a los caudales medidos.
2. Calcule el LLA utilizando la intersección entre las líneas de regresión por encima y por debajo de la meseta de autorregulación. Para calcular el LLA utilizando este método, combine las dos ecuaciones de regresión y resuelva la ecuación resultante para la presión arterial.
3. Al comparar diferentes grupos experimentales, utilice el análisis de regresión lineal para calcular las pendientes de la relación de presión arterial de LDF por encima y por debajo de la LLA para cada animal y resumínelas como medias de SEM para los animales de ese grupo experimental.

Resultados

La Figura 2 resume los resultados de los experimentos realizados en 10 ratas macho Sprague-Dawley alimentados con comida de laboratorio estándar. En esos experimentos, la LCBF media se mantuvo dentro del 20% del valor de la prehemorragia después de las tres primeras extracciones del volumen sanguíneo, hasta que la presión arterial media alcanzó la LLA. Las posteriores retiradas del volumen sanguíneo a presiones por debajo de la LLA causaron una reducción progresiva de lcbf, lo que dem...

Discusión

Evaluación de las respuestas de flujo sanguíneo de tejido con flowmetría doppler láser (LDF). Como se señaló anteriormente, la señal LDF es proporcional al número y la velocidad de las partículas en movimiento, en este caso RBC, en la microcirculación. Las lecturas de LDF en diferentes órganos están bien correlacionadas con el flujo sanguíneo de órganos enteros evaluados mediante métodos establecidos como medidores de flujo electromagnético sormotores y microesferas radiactivas

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 braided black silk suture	Midwest Vet	193.73000.2
Arterial Pressure Transducer	Merit Medical	041516504A
Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system)	DATAQ Instruments
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Circulating warm water pump	Gaymar Industries	T-pump
End-tidal CO2 monitor	Stoelting	Capstar-100
Heparin Sodium	Midwest Vet	191.46720.3
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Laser Doppler Flow Meter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
Laser Doppler Refill Motility Standard	Perimed	PF1001
Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)	VWR	63018-828
Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)	VWR	63019-048
Rodent Ventilator	Cwe/Stoelting	SAR-830/P
Saline	Midwest Vet	193.74504.3
Sprague-Dawley Outbred Rats	Variable	N/A	Rats were ordered from various companies
Standard Rat Chow	Dyets, Inc.	113755
Stereotaxic Instrument	Cwe/Stoelting	Clasic Lab Standard