הערכה של זרימת דם מוחין Autoregulation בעכברוש באמצעות לייזר דופלר Flowmetry

Summary

מאמר זה מדגים את השימוש של הזרימה דופלר לייזר כדי להעריך את היכולת של זרימת המוח כדי לautoregulate את זרימת הדם שלה במהלך הפחתת לחץ דם עורקי.

Abstract

כאשר חוקרים את מנגנוני הגוף לוויסות זרימת דם מוחית, מדידה יחסית של זרימת דם מיקרוסירקולציה ניתן להשיג באמצעות flowmetry לייזר דופלר (LDF). נייר זה מדגים הכנה הגולגולת סגור המאפשר זרימת דם מוחין להיות מוערך מבלי לחדור את הגולגולת או להתקין חדר או חלון מוחין. כדי להעריך מנגנונים אוטומטיים, מודל של הפחתת לחץ דם מבוקרת דרך דימום מדורגת יכול להיות מנוצל בעת שימוש בו זמנית LDF. זה מאפשר את הזמן האמיתי מעקב אחר השינויים היחסיים בזרימת הדם בתגובה להפחתת לחץ הדם העורקי המיוצר על ידי נסיגה של במחזור נפח הדם. פרדיגמה זו היא גישה רבת ערך לחקר זרימת דם מוחין autoregulation במהלך הפחתת לחץ דם עורקי, עם שינויים קלים בפרוטוקול, הוא גם בעל ערך כמודל ניסיוני של הלם מדמם. בנוסף להערכת תגובות התגובה, LDF ניתן להשתמש כדי לפקח על זרימת הדם בקליפת המוח כאשר חקירת מטבולית, מיוגניים, אנדותל, humoral, או מנגנונים עצביים לווסת את זרימת הדם מוחין ואת ההשפעה של ניסיוני שונים התערבויות ומצבים פתולוגיים על זרימת דם מוחית.

Introduction

מנגנונים מגוקקים במחזור המוח משחקים תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס ותפקוד תקין במוח. Autoregulation של זרימת הדם מוחין מושפע גורמים מרובים כולל קצב הלב, מהירות הדם, לחץ זלוף, את קוטר העורקים ההתנגדות המוחית, ואת ההתנגדות מיקרוסירקולציה, כל אשר ממלאים תפקיד בשמירה על מוחין הכולל זרימת הדם קבוע במוח על טווח פיזיולוגי של לחצים מערכתית דם. כאשר הלחץ העורקי גובר, המנגנונים הללו מגבירים את העורקים הראשיים ואת עורקי ההתנגדות כדי למנוע עליות מסוכנות בלחץ תוך גולגולתי. כאשר לחץ הדם העורקי פוחת, מנגנוני הבקרה המקומיים מתרחבים על ידי העורק כדי לשמור על הפרזיה של רקמות ו-O₂ משלוח. מצבים פתולוגיים שונים כגון hypercapnia, טראומה או הכללית ארוי המוח פציעה, מיקרואנגיופתיה סוכרתית^1,2,3,4,5,6 עשוי לשבש את היכולת של המוח לautoregulate את זרימת הדם שלה. לדוגמה, יתר לחץ דם כרוני משמרות את טווח אוטומטי יעיל לכיוון לחצים גבוהים יותר^7,8,9, ו מלח גבוה (HS) דיאטה לא רק מפריעה התרחבות אנדותל רגיל תלוי במיקרו במחזור¹⁰, אבל גם פוגע ביכולת של מנגנונים האוטומטיים במחזור המוח כדי להתרחב ולשמור על העור זלוף כאשר הלחץ העורקים Autoregulation מוחין הוא גם לקוי בחולדות מלוחים רגיש מלח כאשר הם ניזונים דיאטה HS¹².

במהלך הפחתת הלחץ העורקי, התרחבות של עורקי ההתנגדות המוחית והעורק מחזירה בתחילה את זרימת הדם המוחית לשליטה בערכים למרות הלחץ הקטן של ההיתוך. כאשר הלחץ העורקי מצטמצם יותר, זרימת הדם המוחית נותרת קבועה בלחץ התחתון (שלב הרמה של התגובה המנובעת) עד שהvasקולטורה לא יכול עוד להתרחב כדי לשמור על זרימת הדם בלחץ התחתון. הלחץ הנמוך ביותר שבו איבר יכול לשמור על זרימת הדם נורמלי נקרא הגבול התחתון של autoregulation (פילה). בלחצים מתחת לפילה, זרימת דם מוחית יורדת באופן משמעותי מערכי מנוחה ופוחתת בצורה קווית עם כל הפחתה בלחץ ההיתוך העורקי^13,14. משמרת כלפי מעלה בתוך הפילה, כפי שנצפתה ביתר לחץ דם^7,8,9, עשוי להגביר את הסיכון ואת חומרת הפציעה האיסכמי במהלך התנאים בהם לחץ העורק העורקי מופחת (למשל, אוטם שריר הלב, שבץ האיסכמי, או הלם הדם).

Ldf הוכיחה להיות גישה בעלת ערך רב מאוד כדי להעריך את זרימת הדם במיקרו מחזור תחת מגוון של נסיבות, כולל autoregulation של זרימת הדם במחזור המוח^11,14,15. בנוסף להערכת תגובות מיידיות, ניתן להשתמש ב-ldf כדי לנטר את זרימת הדם בקליפת המוח כאשר חוקרים את זרימת הדם הכאולית, מיוגניים, אנדותל, הומורל, או המנגנון העצבי המווסת את זרימה דם מוחית ואת ההשפעה של התערבויות ניסיוני שוניםומצביםפתולוגיים על זרימת^{דם מוחין10,}

LDF מודד את המעבר באור לייזר משתקף בתגובה למספר ומהירות של חלקיקים נעים-במקרה זה, כדוריות הדם האדומות (RBC). למחקרים של autoregulation כלי דם מוחין, לחץ דם עורקי הוא שונה גם על ידי העירוי של אגוניסט אלפא-אדרררגיות כדי להגביר את הלחץ העורקי (כי מחזור המוח עצמו הוא חסר רגישות ל-alpha-אדראררגיות הכלי המכווץ)^12,15 או באמצעות בקרת נפח הדם מבוקרת להפחית לחץ עורקי^11,14. במחקר הנוכחי, LDF מנוצל כדי להדגים את ההשפעות של הפחתות מדורגים לחץ דם על autoregulation מוחין בעכברוש בריא. למרות שיטות הגולגולת הפתוחות והסגורות תוארו בספרות^22,23,24,25, הנייר הנוכחי ממחיש הכנה הגולגולת סגור, המאפשר זרימת דם מוחין להיות מוערך מבלי לחדור את הגולגולת או התקנת חלון חדר או מוחין.

Protocol

המכללה הרפואית של ויסקונסין טיפול בעלי חיים מוסדי ועדת השימוש (IACUC) אישר את כל הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה וכל ההליכים הם בהתאמה עם המכון הלאומי לבריאות (NIH) המשרד של מעבדה בעלי חיים רווחה (OLAW) תקנות.

1. בעלי חיים ניסיוניים והכנה להקלטה

1. השתמש 8 – 12-שבוע בן גברים ג ' ולבי שוקל 250 – 300 g. עבור ניסויים אלה, להאכיל חולדות דיאטה סטנדרטית המורכבת 0.4% הנאל, 200 ג/ק"ג קזאין, 3 גרם/ק"ג DL-מתיונין, 497.77 g/ק"ג סוכות, 150 g/ק"ג קורנפלור, 50 g/ק"ג שמן תירס, 50 g/ק"ג, 2 גרם/ק"ג כולין bitartrate, 35 g/ק"ג תערובת מינרלים, ו 10 ג ' ק ג מיקס ויטמין.
2. הקלטת לחץ דם עורקי וקריאות LDF באמצעות תוכנה לרכישת נתונים או כל שיטת הקלטה דומה.
3. חבר את הלחץ העורקי מתמר לערוץ אחד של מערכת ההקלטה ובדיקה LDF לערוץ השני במערכת ההקלטה.
4. לפני המדידה, לכייל את בדיקת דופלר לייזר להגדיר תקן לתנועתיות ולהבטיח כי flowmeter דופלר לייזר מספק פלט קבוע.
5. הכינו ציוד נוסף הדרוש לניתוח ההכנה ולניסוי: מיקרוסקופ מבתר, מאוורר מכרסם, צג שוקו בקצה₂ , מכשיר סטריאוטקאלי כדי לתקן את ראש החולדה במיקום, ומיקרומניפולציה כדי לאתר את הגשוש של ldf על מיקרו מחזור pial ולשמור אותו במצב קבוע.

2. הכנה כירורגית

1. שוקלים את העכברוש והפילו את החיה בחדר אינדוקציה עם 3.5% isofלבנה ו 30% O₂ תוספת.
2. הסר את בעל החיים מחדר אינדוקציה ותחליף מסכת הרדמה המספקים 1.5 – 3% isofלפני 30% O₂ תוספת.
3. מניחים את העכברוש על שמיכה מים מחזורי הנשמרת ב 37 ° צ' ורפלקסים לבדוק עם קמצוץ הבוהן כדי להבטיח כי יש רפלקס הנסיגה. החלת משחה אופטלמולוגית לשתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית.
4. , גלח את ראש הגולגולת. אזור הצוואר ומשולשים של הירך להסיר שיער רופף מאזורים אלה ונקי עם אלכוהול לשפשף.
5. מניחים את העכברוש בתנוחה פרקדן על משטח חימום עם משאבת מים חמים מחזורי כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה ב 37 ° c ולאבטח אותו באופן זמני את הלוח באמצעות הקלטת הרפואית.
6. התקן צינורית הקנה (PE240 פוליאתילן) דרך חתך מגחוני בצוואר כמתואר במקום אחר²⁶.
7. חברו את צינורית הקנה לצינור המים למסך הקצה_השני של הגאות והמאוורר בתוספת 2.5 – 3.0% (בהתאם לגודל בעל החיים) ו-30% O₂ מוסף אינהלציה. ודא שקצב הנשימה, הזמן הinspiratory, ואמצעי האחסון של הדקות המאווררים מוגדרים ומנוטרים כדי להבטיח את הגאות_{והסיום של שיתוף} הפעולה הסופי של כ-35 mmhg במהלך הניסוי.
   הערה: הדבר מושג בדרך כלל בקצב נשימתי של כ-48 – 60 נשימות/דקות, נפח הגאות של 1.70 – 2.30 mL, וזמן השראה של 0.50 – 0.60 s עבור עכברוש בגודל 250 – 300 גרם.
8. ממלאים שני PE50 פוליאתילן עם הפארין 1 U/mL בתמיסה של איזוטוניק כדי למנוע קרישה ולשמור על הפטלות של הקטטרים. לאחר מילוי, שיקוע הקצה הפתוח של כל צינורית עם מספריים כירורגיים כדי להקל על הכניסה לעורק.
9. הצינורית הימנית והשמאלית של עורק הירך כמתואר במקומות אחרים²⁷ כדי לאפשר ניטור רציף של לחץ עורקי בקטטר אחד ונסיגה הדם מן הקטטר השני.
   1. לאחר הפרדת העורקים מהרקמה שמסביב, מתחת למיקרוסקופ מבתר, הציבו את העורק המרוחק ומניחים שני תפרים נוספים בקצה האמצעי והחלק השני של העורק מבלי להדק את הקשרים.
   2. השתמשו בתפר הראשי כקשירה להרמת משקולות כדי למנוע דימום מעורק העורקים לאחר החיתוך של צינורית הכניסה (שלב 2.11).
10. הכניסו חוט בצורת V מאטב נייר מתחת לעורק, כדי לעצור את הספינה עד שהצינורית תהיה מאובטחת.
11. מתחת למיקרוסקופ מבתר, עושים חתך קטן בעורק הירך ליד הדבר המרוחק באמצעות המספריים של וואנות. הכניסו את הקצה השופע של הצינורית לתוך החתך והתקדמו לתוך עורק הירך. הדקו את הקשר בחיבור האמצעי כדי לאבטח את הצינורית במקום, כך שהלחץ אינו מסולק באמצעות לחץ עורקי כאשר הסרת הקשירה או אטב הנייר מוסרים.
12. לאחר הידוק החיבור האמצעי, שחררו את המתח על ליגיית ההרים ו/או הסירו את אטב הנייר והדקו את החיבור העומד בפני התחת.
13. סגור את החתך עם תפרים עדינים (3-0 משי) או סיכת כירורגית. לחלופין, מניחים גזה לח על האתר חתך, תלוי בגודל של החתך.

3. הגולגולת דליל עבור מדידות LDF

1. מיד לאחר הצינורית נמצאים במקום, מניחים את החיה בתנוחה משנית ומאבטח את הראש במכשיר סטריאוטקאני, ונזהר לא להוציא את הקטטרים או את צינור הקנה.
2. השתמש מספריים כירורגי לעשות חתך אליפטי בעור המכסה את הגולגולת. השתמש בספוגית כותנה כדי להסיר את כל רקמת החיבור, להבטיח כי הגולגולת נקי ויבש. מניחים פיסת מוארך התגלגל קטן של נייר טישו סביב החתך על הקרקפת כדי לעצור דימום כלשהו.
3. תחת מיקרוסקופ מבתר, להשתמש בכלי Dremel או מקדחה שיניים עם מקדחה 2.15 מ"מ סיבית כדי רזה אזור קטן של העצם (כ 0.5 – 1 ס מ בהתאם לגודל של עכברוש) באזור הקודקודית על קליפת המגע השמאלי או הימני.
   התראה: הדק את העצם לאט ובזהירות כדי להימנע מחדירה לגולגולת. בעת ביצוע שלב זה, פתרון מלוחים יש להחיל ליברלית כדי למנוע את האזור מפני התחממות יתר.
4. לאחר הגולגולת היה דיללו והאזור יש מראה ורוד ו/או כלי דם הם דמיינו, לכסות את האזור עם שמן מינרלי ולהשתמש במיקרומניפולציה כדי למקם את הלייזר דופלר לייזר מעל מיקרו מחזור המוח חשוף, כך קצה החללית הוא רק נגיעה העליון של הבריכה של שמן מינרלי (איור 1).
   הערה: חיוני לקחת מדידות LDF באזור שבו אין תנודות חיצוניות כי היה להפריע את הקריאות דופלר לייזר וכי הגשוש הוא קבוע באופן מאובטח על אותו אזור היעד במהלך הניסוי.

4. הערכת autoregulation כלי דם מוחין

1. לאחר הבדיקה LDF הוא קבוע בעמדה, לאפשר לתקופה של 30-45 דקות השפה לפני תחילת הניסוי. לאחר תקופת המדידה, למדוד את הלחץ העורקי מרושע (MAP) ואת זרימת הדם מוחין לייזר (הקרח) כל 30 עבור 2 דקות וממוצע הערכים כדי להשיג את ערכי הבסיס עבור לחץ דם מראש לפני הצורך ו-הקרח.
2. כדי להעריך את autoregulation כלי הדם מוחין בתגובה הפחתת לחץ עורקי, למדוד את הקרח והמפה בעקבות משיכות רצופות של 1.5 mL של דם מעורק הירך¹¹. כדי לשמור על הפטנט הקטטר, ודא כי נפח של פתרון הפארין (100 U/mL ב מלוחים isotonic) שווה בקירוב לנפח הקטטר הוא החדרת לאחר כל דם לצייר.
   הערה: כאשר מקטינים את פתרון ההפרין לשמירה על קטטר, חשוב להתאים את הנפח של פתרון ההפרין לנפח הקטטר ככל האפשר כדי למנוע מהחיה לקבל יותר מדי הפארין, דבר שעלול לגרום לחוסר רצויות דימום.
3. לאחר כל הנסיגה של נפח הדם, לאפשר את העכברוש כדי לשנות 2 דקות, לאחר מכן המפה ו-הקרח מוקלטים כל 30 עבור 2 דקות. חזור על משיכות נפח הדם עד שהחיה מגיעה למפה של כ-20 מ"מ.
4. לקבוע את טווח אוטומטי יעיל על ידי זיהוי הטווח של לחצים דם מהמפה לפני המחזור (שלבים 4.5 ו 5.3, להלן).
5. לקבוע את פילה על ידי זיהוי הלחץ הנמוך ביותר שבו ה-, עדיין חוזר לתוך 20% של ערך בקרת טרום דימום בעקבות נסיגה נפח הדם, כפי שתוארה בעבר^11,28 או על ידי זיהוי נקודת החיתוך של קווי הרגרסיה נקבע בשלב הרמה של autoregulation ומתחת לפילה, שם מקטינה את הקרח עם כל נסיגה דם רצופים (5.3 שלב
   הערה: הקריטריונים להגדרת הרמה ואת המישור האוטומטי עשויים להיות שונים בין מעבדות (למשל, טקדה ואח '²⁸ לעומת ג ' ונס ואח '²⁹), כמו גם הליכים להפחתת לחץ דם עורקי (למשל, נסיגה של נפח מסוים של דם לעומת דימום מבוקר כדי להגיע לרמות ספציפיות לחץ העורקים)¹¹.
6. בסוף הניסוי, המתת החסד של החיה על ידי יצירת חזה אוויר דו צדדי בזמן תחת מישור כירורגי של הרדמה, כפי שאושרה על ידי IACUC.
7. ערכי LDF שהושגו ברקמה לאחר שבעל החיים מורדמים יספק את ערך הזרימה הבסיסי של אפס עבור ההתקנה הניסיונית.

5. אנליזה סטטיסטית

1. בצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי להעריך את הקורלציה בין ערכי LDF לבין לחץ העורקים המקביל שלהם. השתמש בקריאות LDF הבסיסיות שהתקבלו לאחר שבעל החיים מורדמים כדי להבטיח שלא היה אות LDF לא ספציפי המשפיע על קצבי הזרימה הנמדדים.
2. חשב את המנה באמצעות ההצטלבות בין קווי הרגרסיה שמעל ומתחת למישור האוטומטי. כדי לחשב את הפילה באמצעות שיטה זו, שלב את שתי משוואות הרגרסיה ולפתור את המשוואה המתקבלת ללחץ עורקי.
3. בעת השוואת קבוצות נסיוניות שונות, השתמש בניתוח רגרסיה ליניארית כדי לחשב את מדרונות ה-LDF לעומת הלחץ העורקי מעל ומתחת לפילה עבור כל חיה ולסכם אותם כממוצע ± SEM עבור בעלי החיים בקבוצה הניסיונית הזו.

תוצאות

איור 2 מסכם את התוצאות של ניסויים שנערכו ב 10 גברים ג ' ספראג-דאולי מעבדה רגיל אוכל המעבדה. בניסויים אלה, המשמעות של ה-ה-LBF נשמרה בתוך 20% מערך הדימום הראשוני בעקבות משיכות שלוש החזקות של דם, עד שהלחץ העורקי הממוצע הגיע לפילה. משיכות בנפח הדם העוקבות בלחצים שמתחת לפילה גרמה להפחת...

Discussion

הערכה של התגובה זרימת הדם הרקמה עם לייזר דופלר Flowmetry (LDF). כפי שצוין לעיל, האות LDF הוא פרופורציונלי למספר ומהירות של חלקיקים נעים, במקרה זה RBC, במחזור המיקרו. קריאות ldf באיברים שונים הם בקורלציה היטב עם זרימת דם איברים שלמים המשוער על ידי שיטות שנקבעו כגון תזרים מטרים אלקטרומגנטיים ומ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 braided black silk suture	Midwest Vet	193.73000.2
Arterial Pressure Transducer	Merit Medical	041516504A
Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system)	DATAQ Instruments
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Circulating warm water pump	Gaymar Industries	T-pump
End-tidal CO2 monitor	Stoelting	Capstar-100
Heparin Sodium	Midwest Vet	191.46720.3
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Laser Doppler Flow Meter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
Laser Doppler Refill Motility Standard	Perimed	PF1001
Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)	VWR	63018-828
Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)	VWR	63019-048
Rodent Ventilator	Cwe/Stoelting	SAR-830/P
Saline	Midwest Vet	193.74504.3
Sprague-Dawley Outbred Rats	Variable	N/A	Rats were ordered from various companies
Standard Rat Chow	Dyets, Inc.	113755
Stereotaxic Instrument	Cwe/Stoelting	Clasic Lab Standard