Avaliação da autoregulação do fluxo sanguíneo cerebral no rato usando fluimetria de laser

Resumo

Este artigo demonstra o uso de fluimetria laser Doppler para avaliar a capacidade da circulação cerebral para autoregular seu fluxo sanguíneo durante reduções na pressão arterial.

Resumo

Ao investigar os mecanismos do corpo para regular o fluxo sanguíneo cerebral, uma medida relativa do fluxo sanguíneo microcirculatório pode ser obtida usando fluimetria laser Doppler (LDF). Este papel demonstra uma preparação fechada do crânio que permita que a circulação sanguínea cerebral seja avaliada sem penetrar o crânio ou instalar uma câmara ou uma janela cerebral. Para avaliar os mecanismos de autoregulação, um modelo de redução controlada da pressão arterial por meio de hemorragia graduada pode ser utilizado ao mesmo tempo em que emprega o LDF. Isso permite o rastreamento em tempo real das alterações relativas no fluxo sanguíneo em resposta às reduções na pressão arterial produzida pela retirada do volume sanguíneo circulante. Esse paradigma é uma abordagem valiosa para estudar a autoregulação do fluxo sanguíneo cerebral durante reduções na pressão arterial e, com pequenas modificações no protocolo, também é valiosa como modelo experimental de choque hemorrágico. Além de avaliar as respostas autoregulatórias, ldf pode ser usado para monitorar o fluxo sanguíneo cortical ao investigar metabólico, miogênico, endotélico, humoral, ou mecanismos neurais que regulam o fluxo sanguíneo cerebral e o impacto de vários intervenções e condições patológicas no fluxo sanguíneo cerebral.

Introdução

Os mecanismos de autoregulação na circulação cerebral desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase e da função normal no cérebro. A autoregulação do fluxo sanguíneo cerebral é afetada por múltiplos fatores, incluindo frequência cardíaca, velocidade arterial, pressão de perfusão, diâmetro das artérias de resistência cerebral e resistência microcirculatória, que desempenham um papel na manutenção da constante do fluxo sanguíneo cerebral total no cérebro sobre a faixa fisiológica das pressões sanguíneas sistêmicas. Quando a pressão arterial aumenta, esses mecanismos restringem as artérias e artérias de resistência para evitar aumentos perigosos na pressão intracraniana. Quando a pressão arterial diminui, os mecanismos de controle local dilatam as artérias para manter a perfusão do tecido e o parto O_2. Várias condições patológicas, como hipercapnia, lesão cerebral hipóxica traumática ou global, e microangiopatia diabética^{1,2,3,4,5, 6}podem perturbar a capacidade do cérebro de autoregular seu fluxo sanguíneo. Por exemplo, a hipertensão crônica desloca a faixa autoreguladora efetiva em direção a pressões mais altas^7,8,9,e uma dieta de alto teor de sal (HS) não só interfere com a dilatação normal dependente do endotelio na microcirculação cerebral^10,mas também prejudica a capacidade dos mecanismos autoreguladores na circulação cerebral de dilatar e manter a perfusão de tecidoquando a pressão arterial é reduzida¹¹. A autoregulação cerebral também é prejudicada em ratos sensíveis ao sal de Dahl quando são alimentados com uma dieta HS^12.

Durante as reduções na pressão arterial, a dilatação das artérias e arterioles da resistência cerebral retorna inicialmente o fluxo sanguíneo cerebral para controlar valores apesar da pressão reduzida da perfusão. Como a pressão arterial é reduzida ainda mais, o fluxo sanguíneo cerebral permanece constante na pressão mais baixa (fase de platô da resposta autoreguladora) até que a vasculatura não possa mais dilatar para manter o fluxo sanguíneo com pressão mais baixa. A menor pressão em que um órgão pode manter o fluxo sanguíneo normal é denominada o limite inferior da autoregulação (LLA). Em pressões abaixo do LLA, o fluxo sanguíneo cerebral diminui significativamente a partir de valores de repouso e diminui de forma linear com cada redução na pressão de perfusão arterial^13,14. Uma mudança ascendente no LLA, como observado na hipertensão^7,8,9,pode aumentar o risco e a gravidade da lesão isquêmica durante as condições em que a pressão de perfusão arterial é reduzida (por exemplo, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral isquêmico ou choque circulatório).

LDF provou ser uma abordagem extremamente valiosa para avaliar o fluxo sanguíneo na microcirculação uma variedade de circunstâncias, incluindo a autoregulação do fluxo sanguíneo na circulação cerebral^11,14,15. Além de avaliar as respostas autoreguladoras, ldf pode ser usado para monitorar o fluxo sanguíneo cortical ao investigar metabólico, miogênico, endotelial, humoral, ou mecanismos neurais que regulam o fluxo sanguíneo cerebral e o impacto de várias intervenções experimentais e condições patológicas no fluxo sanguíneo cerebral^{10,16,17,18,19,20,21}.

LDF mede a mudança na luz laser refletida em resposta ao número e velocidade de partículas em movimento - neste caso, os glóbulos vermelhos (RBC). Para estudos de autoregulação vascular cerebral, a pressão arterial arterial é alterada pela infusão de um agonista alfa-adrenergic para aumentar a pressão arterial (porque a circulação cerebral em si é insensível aos agonistas vasoconstrictor alfa-adrenergic)^12,15 ou através de retirada de volume sanguíneo controlado para reduzir a pressão arterial^11,14. No presente estudo, ldf é utilizado para demonstrar os efeitos das reduções graduadas na pressão arterial sobre a auto-regulação cerebral em um rato saudável. Embora métodos de crânio aberto e fechado tenham sido descritos na literatura^22,23,24,25,o presente artigo demonstra uma preparação fechada do crânio, permitindo que o fluxo sanguíneo cerebral seja avaliado sem penetrar no crânio ou instalar uma câmara ou janela cerebral.

Protocolo

O Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aprovou todos os protocolos descritos neste artigo e todos os procedimentos estão em conformidade com o National Institutes of Health (NIH) Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) Regulamentos.

1. Animais experimentais e preparação para gravação

1. Use 8-12 semanas de idade, ratos Sprague-Dawley masculinos pesando 250-300 g. Para estes experimentos, alimentar ratos uma dieta padrão composta por 0,4% NaCl, 200 g/kg de casein, 3 g/kg DL-methionine, 497,77 g/kg de sacarose, 150 g/kg de amido de milho, 50 g/kg de óleo de milho, 50 g/kg de celulose, 2 g/kg de bitartrate choline, 35 g/kg de mixagem mineral e 10 vitamina/kg mix.
2. Registre a pressão arterial e as leituras de LDF usando software de aquisição de dados ou qualquer método de gravação comparável.
3. Anexe o transdutor de pressão arterial a um canal do sistema de gravação e a sonda LDF ao outro canal do sistema de gravação.
4. Antes da medição, calibrar a sonda Laser Doppler para definir um padrão de motilidade e garantir que o flowmeter Doppler laser está fornecendo uma saída constante.
5. Prepare equipamentos adicionais necessários para a cirurgia preparatória e para o experimento: um microscópio de dissecação, um ventilador de roedores, um monitor de CO₂ das marés finais, um instrumento estereotipado para corrigir a cabeça do rato em posição e um micromanipulador para localizar a sonda LDF sobre a microcirculação pial e mantê-la em uma posição constante.

2. Preparação cirúrgica

1. Pese o rato e anestesiao o animal em uma câmara de indução com 3,5% isoflurano e 30% O₂ suplemento.
2. Retire o animal da câmara de indução e substitua uma máscara anestésica entregando isoflurane de 1,5-3% com um suplemento de 30% O_2.
3. Coloque o rato em um cobertor de água circulante mantido em 37 °C e verifique os reflexos com uma pitada de dedo do pé para garantir que haja um reflexo de retirada. Aplique a pomada oftalmotalmica estéril a ambos os olhos para impedir a dessecação da córnea.
4. Raspe o topo do crânio, área do pescoço ventral e triângulos femorais. Retire qualquer cabelo solto dessas áreas e limpar com álcool.
5. Coloque o rato em uma posição supina em uma almofada de aquecimento com uma bomba de água quente circulante para manter a temperatura corporal do animal em 37 °C e temporariamente fixá-lo para a almofada usando fita médica.
6. Instale uma cânula traqueal (tubos de polietileno PE240) através de uma incisão ventral no pescoço, conforme descrito em outros lugares²⁶.
7. Anexar a cânula traqueal a um monitor de CO₂ de maré final e o ventilador entregando isoflurane de 2,5-3,0% (dependendo do tamanho do animal) e um suplemento de inalação 30% O_2. Certifique-se de que a taxa respiratória, o tempo inspirativo e o volume ventilatório minucioso sejam definidos e monitorados para garantir um CO₂ de maré final expirado de aproximadamente 35 mmHg ao longo do experimento.
   NOTA: Isso geralmente é alcançado com uma taxa respiratória de aproximadamente 48-60 respirações/min, um volume de maré de 1,70-2,30 mL, e um tempo de inspiração de 0,50-0,60 s para um rato de 250-300 g.
8. Preencha duas cânulas de polietileno PE50 com heparina 1 U/mL na solução isotônica na NaCl para prevenir a coagulação e manter a patência dos cateteres. Após o enchimento, bisvire a extremidade aberta de cada cânula com tesoura cirúrgica para facilitar a inserção na artéria.
9. Cannulate as artérias femorais direita e esquerda, como descrito em outros lugares²⁷ para permitir o monitoramento contínuo da pressão arterial em um cateter e retirada de sangue do outro cateter.
   1. Depois de separar cuidadosamente as artérias do tecido circundante um microscópio dissecando, ligaa a extremidade distal da artéria e coloque duas suturas adicionais ao redor das extremidades média e proximal da artéria sem apertar os nós.
   2. Use a sutura proximal como uma ligadura de elevação para evitar sangramento da artéria após a incisão para inserção de cânula (passo 2.11).
10. Insira um fio em forma de V formado a partir de um clipe de papel a artéria, a fim de ocluir o navio até que a cânula esteja segura.
11. um microscópio dissecando fazer uma pequena incisão na artéria femoral perto da ligadura distal usando tesoura Vannas. Insira a extremidade beveled da cânula na incisão e avance na artéria femoral. Aperte o nó na ligadura média para garantir a cânula no lugar para que ele não seja desalojado pela pressão arterial quando a ligadura de elevação ou clipe de papel é removido.
12. Depois que a ligadura média é apertada, libere a tensão na ligadura de levantamento e/ou remova o grampo de papel, e aperte a ligadura proximal.
13. Feche a incisão com suturas finas (3-0 seda) ou um grampo cirúrgico. Alternativamente, coloque uma gaze úmida sobre o local da incisão, dependendo do tamanho da incisão.

3. Desbaste do crânio para medidas de LDF

1. Imediatamente após as cânulas estão no lugar, coloque o animal em uma posição sternal e proteger a cabeça em um dispositivo estereotaxico, tomando cuidado para não desalojar os cateteres ou tubo traqueal.
2. Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão elíptica na pele que cobre o crânio. Use um cotonete para remover qualquer tecido conjuntivo, garantindo que o crânio esteja limpo e seco. Coloque um pequeno pedaço alongado e enrolado de papel de seda ao redor da incisão no couro cabeludo para parar qualquer sangramento.
3. o microscópio de dissecação, use uma ferramenta Dremel ou uma broca dentária com uma broca de 2,15 mm pouco para diluir uma pequena área de osso (aproximadamente 0,5-1 cm, dependendo do tamanho do rato) na área parietal sobre o córtex somatossensorial esquerdo ou direito.
   CUIDADO: Diluir o osso lenta e cuidadosamente para evitar penetrar no crânio. Durante a realização desta etapa, a solução salina deve ser aplicada liberalmente para evitar que a área superaqueça.
4. Uma vez que o crânio foi diluído e a área tem uma aparência rosa e/ou vasos sanguíneos são visualizados, cubra a área com óleo mineral e use um micromanipulador para posicionar a sonda Laser Doppler sobre a microcirculação cerebral exposta para que a ponta da sonda esteja apenas tocando o topo da piscina de óleo mineral (Figura 1).
   NOTA: É essencial tomar medidas ldf em uma área onde não há vibrações externas que interfiram com as leituras de Laser Doppler e que a sonda é fixada com segurança sobre a mesma área alvo ao longo do experimento.

4. Avaliação da autoregulação vascular cerebral

1. Uma vez que a sonda LDF é fixada em posição, permitir um período de equilíbrio de 30-45 min antes de iniciar o experimento. Após o período de equilíbrio, medir a pressão arterial média (MAP) e o fluxo sanguíneo cerebral a laser (LCBF) a cada 30 s para 2 min e calcular em média os valores para obter os valores de base para a pressão arterial de premorrágica e LCBF.
2. Para avaliar a autoregulação vascular cerebral em resposta à redução da pressão arterial, meda o LCBF e o MAP após sucessivas retiradas de 1,5 mL de sangue da artéria femoral^11. Para manter a patente do cateter, certifique-se de que um volume de solução de heparina (100 U/mL em isotônica sorota) aproximadamente igual ao volume do cateter seja infundido após cada coleta de sangue.
   NOTA: Ao infundir a solução heparina para manter a patência do cateter, é importante combinar o volume da solução de heparina ao volume do cateter o mais próximo possível para impedir que o animal receba demasiada heparina, o que poderia causar indesejados Sangrando.
3. Após cada retirada do volume de sangue, permita que o rato equilibre-se por 2 min, após o que o MAP e o LCBF são registrados a cada 30 s por 2 min. Repita as retiradas do volume sanguíneo até que o animal atinja um MAPA de aproximadamente 20 mmHg.
4. Determine a faixa autoreguladora efetiva, identificando a gama de pressões sanguíneas do MAPA de premorrágica até o LLA (etapas 4,5 e 5,3, abaixo).
5. Determine o LLA identificando a menor pressão na qual a LCBF ainda retorna para dentro de 20% do valor do controle de premorrágica após a retirada do volume sanguíneo, como descrito anteriormente^11,28 ou identificando o ponto de interseção das linhas de regressão determinadas durante a fase de platô da autoregulação e abaixo do LLA, onde a LCBF diminui a cada retirada de sangue sucessiva (passo 5,3, abaixo).
   NOTA: Os critérios para definir o LLA e o platô autoregulador podem diferir entre laboratórios (por exemplo, Takada et al.²⁸ vs. Jones et al.^29),bem como procedimentos para reduzir a pressão arterial (por exemplo, a retirada de um volume específico de sangue vs. hemorragia controlada para atingir níveis específicos de pressão arterial)¹¹.
6. No final do experimento, eutanásia do animal acriação de um pneumotórax bilateral, enquanto um plano cirúrgico de anestesia, como aprovado pela IACUC.
7. Os valores de LDF obtidos no tecido depois que o animal é euthanized fornecerão o valor de fluxo de linha de base zero para a configuração experimental.

5. Análise estatística

1. Realizar análise de regressão linear para avaliar a correlação entre os valores do LDF e sua pressão arterial correspondente. Use as leituras basal do LDF obtidas depois que o animal é sacrificado para garantir que não houvesse sinal LDF inespecífico afetando as taxas de fluxo medidas.
2. Calcule o LLA usando a interseção entre as linhas de regressão acima e abaixo do platô autoregulador. Para calcular o LLA usando este método, combinar as duas equações de regressão e resolver a equação resultante para a pressão arterial.
3. Ao comparar diferentes grupos experimentais, use a análise linear de regressão para calcular as inclinações da relação ldf vs. pressão arterial acima e abaixo do LLA para cada animal e resumi-los como média ± SEM para os animais nesse grupo experimental.

Resultados

A Figura 2 resume os resultados de experimentos realizados em 10 ratos machos Sprague-Dawley alimentados com ração laboratorial padrão. Nesses experimentos, a LCBF média foi mantida dentro de 20% do valor da premorrágica após as três primeiras retiradas do volume sanguíneo, até que a pressão arterial média atingiu o LLA. As retiradas subseqüentes do volume de sangue em pressões abaixo do LLA causaram uma redução progressiva de LCBF, mostrando que a circulação cerebral era j?...

Discussão

Avaliação das respostas do fluxo sanguíneo de tecidos com flowmetria laser doppler (LDF). Como observado acima, o sinal LDF é proporcional ao número e velocidade das partículas em movimento, neste caso RBC, na microcirculação. As leituras de LDF em diferentes órgãos estão bem correlacionadas com o fluxo sanguíneo de órgãos inteiros avaliado por métodos estabelecidos, como medidores de fluxo eletromagnético e microesferas radioativas³⁰ e são geralmente consistentes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 braided black silk suture	Midwest Vet	193.73000.2
Arterial Pressure Transducer	Merit Medical	041516504A
Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system)	DATAQ Instruments
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Circulating warm water pump	Gaymar Industries	T-pump
End-tidal CO2 monitor	Stoelting	Capstar-100
Heparin Sodium	Midwest Vet	191.46720.3
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Laser Doppler Flow Meter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
Laser Doppler Refill Motility Standard	Perimed	PF1001
Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula)	VWR	63018-828
Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters)	VWR	63019-048
Rodent Ventilator	Cwe/Stoelting	SAR-830/P
Saline	Midwest Vet	193.74504.3
Sprague-Dawley Outbred Rats	Variable	N/A	Rats were ordered from various companies
Standard Rat Chow	Dyets, Inc.	113755
Stereotaxic Instrument	Cwe/Stoelting	Clasic Lab Standard