高光谱成像作为研究基于兰塔尼的分子单晶光学自给性的工具

摘要

在这里，我们提出了一个协议，以获得发光高光谱成像数据，并使用高光谱成像系统分析基于兰他尼的单晶体的光自给特征。

摘要

在本作品中，我们描述了高光谱成像（HSI）在分析基于发光的蓝硅（Ln^3+）分子单晶时的新应用协议。作为具有代表性的例子，我们选择了基于异核Ln的复合物[TbEu（bpm）（tfaa）6] （bpm=2，2'-双丙氨酸，tfaa⁼ =1，1，1-三氟乙酰聚酰亚酸盐）的单晶，在紫外线激发下表现出明亮的可见发射。₆HSI是一种新兴技术，将发光结构的二维空间成像与所获取图像的每个像素的光谱信息相结合。具体来说，[Tb-Eu] 复合体单晶上的HSI提供了局部光谱信息，揭示了所研究晶体不同点的发光强度变化。这些变化归因于晶体中的光学自给性，这是由于Ln³⁺离子在晶体结构的每个方向中不同的分子包装造成的。本文描述的HSI是这种技术适合分子材料光谱空间研究的一个例子。然而，重要的是，该协议可以很容易地扩展到其他类型的发光材料（如微米大小的分子晶体，无机微粒，生物组织中的纳米粒子，或标记的细胞等），为更深入地研究结构与性质的关系开辟了许多可能性。最终，此类调查将为从生物成像到技术应用（如波导或光电器件）等各种应用的高级材料工程提供可供利用的知识。

引言

高光谱成像（HSI）是一种生成空间地图的技术，其中每个x-y坐标包含一个光谱信息，这些信息可以基于任何类型的光谱学，即光致发光、吸收和散射光谱^{1,1、2、3。,3}因此，获得了一组三维数据集（也称为"高光谱立方体"），其中x-y坐标为空间轴，z坐标是分析样本的光谱信息。因此，高光谱立方体包含空间和光谱信息，比传统光谱学对样品进行更详细的光谱研究。^,6,7,虽然HSI在遥感领域（如地质学、食品工业^4）已有多年所知，但最近它已成为一种用于^{生物医学应用的}纳米材料^2、55或探针的特性创新^2技术。一般来说，它不限于紫外线/可见/近红外（NIR）领域，而且还可以使用其他辐射源，如X射线扩展，例如，为了描述不同材料⁹或Terahertz辐射中的元素分布特征，其中HSI用于在生物组织⁸中进行热传传。此外，光致发光映射与拉曼映射相结合，以探测单层_MoS2¹⁰的光学特性。然而，在光学HSI的应用中，关于基于兰他尼的材料的HSI的例子仍然只有几个例子:11、12、13、14、15、16、17。^{11,12,13,14,15,16,17}例如，我们可以举一个例子:发现组织中的癌症^6，分析生物组织中的光穿透深度^7，多路复用生物成像^3，混合系统中多组分能量转移分析^11，以及研究向上转换纳米粒子的聚合诱导光谱特性变化^12。显然，HSI的吸引力源于它适合生成关于环境特定发光的知识，同时提供有关探测器的空间和光谱信息。

利用这一强大的技术，本文描述了一种研究异核Tb³⁺-Eu³⁺单晶[TbEu（bpm）（tfaa）6] （₆图1a）13的光学自给性的协议。¹³观测到的光相向异性是由于Ln³⁺离子在不同晶体方向中的分子包装不同（图1b），导致一些晶体表面显示更亮，其他晶体表面显示发光。有人建议，晶体特定表面的发光强度增加与Ln³⁼[]的晶体方向的更有效能量传输有关。Ln³⁺ ion 距离最短的¹³。

在这些结果的激励下，我们建议建立一个详细的方法，通过HSI分析光学各向异性，为更好地了解电离能量转移过程和特定分子排列产生的可调发光特性开辟道路^。,19这些结构特性关系被公认为创新光学材料设计的重要方面，包括但不限于纳米和微尺度的波导系统和光磁存储设备，满足对更高效、小型化光学系统²⁰的需求。

研究方案

注意:建议在操作成像器时，使用针对任何时候都使用的激发波长特有的安全护目镜。

1. 高光谱显微镜的配置

注:图2a概述了高光谱成像系统，并介绍了成像器的主要组件。成像系统可用于检测样品中的可见或近红外 （NIR） 发射。根据所需的检测（可见或近红外），光通过两个不同的光路（图2e）。不同的光束转向立方体和二色滤波器立方体（光学立方体）的组合必须放置在仪器的特定位置，以选择相应的路径。

1. 打开连接到成像系统的计算机。打开计算机的显示器。
2. 设置适当的光学立方体配置（图 2b，c）。
   注:这里介绍了使用紫外激发和可见发射检测进行HSI映射的成像器配置（光学立方体配置）。但是，根据所分析的样品，也可以将其更改为 NIR 激励和可见或近红外发射检测。有关示例，请参阅"代表结果"一节。
   1. 从显微镜阶段（图2a中的1）开始，沿着发射光束路径向探测器方向移动（图2a中的3），将光学立方体的第一个位置（图2b中的4）空置，并将共聚焦显微镜光学立方体（DFM1-P01）置于图2b中指示为5的位置，以便样品的发射通过可见光路径定向。
   2. 沿着向探测器方向的光学路径看，将包含二色镜和滤波器的可见光学立方体 （CM1-P01） 放置在图 2b中指示为 6 的位置，将可见发射定向到检测路径。
   3. 继续向探测器的方向，将共聚焦针孔光学立方体 （DFM1-P01） 置于图 2b中指示为 7 的位置，以引导光线通过可见光检测路径。然后，沿着路径，将共聚焦光谱仪光学立方体 （DFM1-P01） 置于图 2c中的位置 8 中，以便发射光到达探测器。
   4. 对于 HSI 映射，手动控制探测器狭缝开口（图 2c中的 9），以便与所使用的针孔大小相匹配（最佳约为 50 mm）。
   5. 在PHySpec软件中，选择针孔的光圈（图3中的 5）。
      注: 针孔孔径越小，HSI 分辨率越好，以信号强度为代价。
3. 通过将开关（图 2d中的 10）定位到 ON 位置，打开宽带灯（图 2d，inin）。要控制激发光的强度，请将 11（图 2d）指示的旋钮转向更高（32 = 最低强度）或较低值（1 = 最高强度）。在设置期间保持宽带灯快门（图 2d中的 12）关闭。
   注: 值越高，灯发出的功率密度衰减越高，而较低的值对应于较低的衰减。
4. 通过将交换机设置为 ON 位置，按以下顺序打开以下硬件:
   1. 打开 ThorLabs 运动控制器。
   2. 打开尼康电源。
   3. 打开 ASI 控制器。
   4. 打开 Galvo 控制器。
   5. 打开 ProEm 探测器。
   6. 打开贝斯佩克探测器。
5. 在计算机上，双击其图标打开PHySpec软件。
   1. 按键盘上的F8键以初始化 IMA向上转换系统，然后单击"连接到系统"窗口中的"确定"按钮。
      注:步骤 1.5.1。也可以通过单击"系统"选项卡，然后单击"连接"到达"连接系统"窗口来执行。然后，可以单击"确定"按钮将成像系统连接到软件。
   2. 确保所有菜单都显示在界面上（彩色摄像机、ProEm和Bayspec）以及屏幕左侧的仪表板控制面板上，如图3所示。

2. [TbEu（bpm）（tfaa）₆= 单晶的超光谱成像

1. 为了准备样品，请将晶体放在显微镜玻璃幻灯片上。如果需要使用更高的放大倍率，请使用薄盖玻璃盖住晶体，并使用胶带固定晶体，以便样品可以放置，薄盖玻璃朝向客观透镜。
2. 将样品制备的玻璃幻灯片放在显微镜舞台上，并用金属臂固定（图4a，b）。
3. 使用ASI 控制器的操纵杆 （图 4c） 移动样品，以便将样品放置在正在使用的目标上。
4. 手动将右侧滤光片立方体放置在目标下方的车轮中（图 5中的 3），以选择灯的紫外线激发，并让可见发射物传递到探测器。
   注: 其他滤光片立方体可用于使用绿色或蓝光激发，因此，将正确的滤芯位到位对于适当的激发波长非常重要。
5. 手动将 20X 目标（如图 5中的 5 所示）置于样品下方，然后按显微镜左侧的白色按钮（图 5中的 6）以打开白光。
   1. 通过转动白光电源按钮下方的旋钮来调节亮度（图 5中的 7）。
6. 在PHySpec软件中，按彩色相机窗口中的"播放（视频）"按钮，这将导致获取实时扫描。
   1. 如果彩色摄像机窗口显示黑色图像，则增加"彩色摄像机"选项卡下的"彩色摄像机"选项卡下的曝光时间（图 3中的 2）和/或"增益值"（图 3 中的3）。如果查看的图像太亮，则减少曝光时间和/或增益值。
   2. 确保显微镜右侧的前进旋钮（图 5中的 2） 设置为 R，以便将 20% 的信号发送到摄像机/望远镜，将 80% 的信号发送到探测器。
7. 通过调整目标和阶段之间的距离来关注样本（图 4b）。这是通过转动显微镜右侧图 4d所示的旋钮来实现的。
   注: 较大的旋钮用于粗略调整，而较小的旋钮用于更细腻和小的对焦变化。
8. 确保在软件中也选择了手动选择的目标。首先，单击顶部菜单栏中的"查看"按钮，然后单击一个显示/隐藏比例栏以在图像上显示比例栏（图 3中的 1）。然后，转到指令控制面板中的Galvanometer选项卡，然后选择使用的目标（图 3中的 4）。通过在软件中选择正确的目标，确保显示的刻度条正确。
9. 在软件中，通过前往 Tab分流器（图 3中的ProEM = 6）和光栅，在SpectraPro SP-2300选项卡下进入选项卡滤波器（1200 g/mm，在ProEM =图 3中的 7）下选择适当的探测器。
10. 打开宽带灯快门（图2中的12），使样品的紫外线激发得以发生。将强度旋钮（图 2d中的 11）旋转到所需位置（例如，8 = 中等强度），以控制宽带灯 （UV） 激发的强度。
    1. 要选择宽场照明（开孔径）或较小的光点照明（更闭合的光圈），请使用图 5中所示的斗杆和旋钮控制 UV 灯场孔径的大小。
11. 在SpectraPro SP-2300选项卡下，选择一个波长来观察样品发射。
12. 如果样品的发射波长未知，则获取发射光谱。
    1. 在定序器中，单击+符号以添加新序列（"节点"）以获取发射频谱。
       1. 单击光谱仪，然后单击光谱采集（带光谱扫描）。
       2. 输入最小波长（即 400 nm ）和最长（即 700 nm ），然后单击确定以设置将记录频谱的光谱范围。
       3. 在软件的左侧菜单中选择适当的曝光时间。选择非常明亮的样品的较短时间（例如 0.1 s），为昏暗发射器选择较长的时间（例如 2 s）。
       4. 调整宽带灯 （UV） 激发时的激发功率（请参阅上一步 1.3）。
          注:在 NIR 二极管激发的情况下，可以从PHySpec软件左侧的中性密度下拉菜单进行调整。
    2. 在音序器上，单击双播放按钮以运行整个序列。显示光谱后，请注意检测样品发射感兴趣的区域（例如，在 Tb³⁺和基于 Eu³⁺的样品的情况下为 580 至 640 nm）。
    3. 根据需要，通过更改样品焦点或调整PHySpec软件中的曝光时间来优化信号检测。如上所述，通过改变激励源（宽带灯）的功率，通过提高样品发射强度，进一步优化信号检测。
13. 相应地调整彩色相机的曝光时间（例如图 3中的 0.5 s = 2）和增益（图 3 中的3），以获得高质量的图像。如果需要，通过单击PHySpec软件窗口顶部菜单第二行的"显示/隐藏比例"栏，将比例栏添加到图像中。
14. 建议:在获取高光谱立方体之前，在白光下记录晶体的明亮场光学显微镜图像（图6a）和/或紫外全（图6b）或密闭（图6c）照明（由快门光圈控制的紫外线照明，如图5中所示4）。为此，在将示例聚焦时，单击彩色摄像机的播放按钮。
15. 单击"文件"然后导出窗口视图，选择所需的格式以导出获取的图像，然后使用所需的扩展名 （.h5， . 保存文件）。JPEG）。
16. 在获取高光谱图像之前，请关闭白光照明以及房间光线。
17. 要获取高光谱立方体，请编写一个新序列。因此，在序列器中，单击 + 符号以添加新节点。
    1. 单击共聚焦成像器。
       1. 单击多频谱采集。在这里，所需的视图字段由x和y方向中要获取的点数和步长大小定义。例如，使用x中的 100 点和y中的 100 点（5 μm 步长）来获取 500 x 500 μm 的图像。
          注意:采集点的总数和每个点的积分时间将直接影响高光谱立方体的总采集时间。
          1. 输入所需的X 位置（例如，100）和Y 位置（例如 100）计数以及所需的步长大小（例如 5 μm）。为摄像机同步选择"硬件"选项，用于可见发射映射（在红外检测时选择软件选项）。单击"确定"。
18. 在音序器中，单击新添加的多频谱采集线以突出显示节点。
19. 单击"播放"按钮以运行所选节点。
    注: 采集所花的剩余时间将显示在节点旁边（以分钟（例如 28分钟）。"
20. 采集完成后，以适当的文件格式 （.h5） 保存高光谱立方体。

3. 高光谱数据分析

1. 采集后，如果保存的高光谱立方体未在软件中自动打开，请通过单击顶部菜单栏中的"文件"然后悬停光标并单击"打开文件..."，将名为"选择数据"的窗口打开时，选择保存 .h5 文件的文件夹，然后双击该文件以打开该文件，从而恢复高光谱立方体。
2. 导入高光谱立方体文件后，修改显示的高光谱立方体图像，通过将立方体图像顶部的条移动到左侧（低波长，例如580 nm）或右侧（高波长，例如638 nm），显示特定光谱波长的强度。
   注: 所选波长显示在此上柱的左侧（图 7中的 1）。
3. 选择分析感兴趣的波长（例如，在 [TbEu（bpm）（tfaa）₆= 为 613.26 nm 的情况下的最大强度），使三种可能的光谱分析类型（A）以图像形式进行光谱分布（图 7中的 2）;（B） 跨感兴趣区域的排放强度剖面（图 7中的 3）;（C） 在特定感兴趣点或区域提取频谱（图 7中的 4）。
   1. 如果图像的光谱分布，请使用"裁剪"和"Bin"功能来增加图像中的信噪比。为此，请在顶部菜单"处理"中单击"处理"，然后选择"数据"，然后选择"裁剪"和"Bin"。
   2. 对于排放强度配置文件，在立方体图像上，右键单击并选择"创建目标"或"创建 X 配置文件"或"创建 Y 配置文件"，具体取决于是否需要分析一个点（图7中的目标 5 和 6）或一行（图 7 中的配置文件7和 8）。通过拖动目标、水平或带光标的垂直线轮廓，选择分析区域，并将其移动到立方体。
      1. 正确选择配置文件后，右键单击该区域并选择"将目标添加到图形"。选择该选项以创建一个新图形以显示发射强度（y轴） 作为目标（x轴）的物理位置的函数。频谱将显示在插入的新图形上（图 7中的 6 和 7）。
         注: 可以创建多个目标，这些目标将显示为不同的彩色排放配置文件（图 7中为 5 和 6）。
   3. 或者，获取样本特定区域的排放光谱（图 7中的 9）。首先，将光标悬停在立方体图像上，然后右键单击。单击弹出的选项卡上的"矩形选择"或"椭圆选择"选项。
      1. 通过单击并拖动光标穿过立方体，在所需区域上绘制选择形状（例如矩形）。正确选择区域后，右键单击该区域并选择"添加选择到图形"。
      2. 在显示的窗口"添加到图形"中，选择"创建新图形"以显示目标的排放光谱，然后单击"确定"。
         注:显示目标发射的图形上将显示一条新的彩色线（图 7中的 8），其中发射强度为 y 轴，x 轴处为波长。此频谱对应于每个波长所选区域的平均强度。
4. 获得频谱后，在选择新区域之前保存它，因为一次只能选择一个区域。为此，请选择包含图形的窗口。在"文件"菜单中，选择"保存为"，然后选择使用选择的名称（以 .h5 格式（可在PHySpec软件中打开）或 .csv 格式（可在 Excel 中导入）将图形保存在您选择的文件夹中。

结果

为了说明高光谱显微镜在基于Ln的分子单晶（即[TbEu（bpm）（tfaa）6+，图1a）上采集数据的配置，图2显示了系统的概述以及光学立方体在设置中的正确位置。₆图 3显示了包含 HSI 采集期间使用的菜单的 PHySpec 软件的屏幕截图。图 4和图 5更详细地显示了显微镜阶段，包括包含要分?...

讨论

此处描述的高光谱成像协议提供了一种直接的方法，允许在样品的精确位置获取光谱信息。使用所述设置，空间分辨率（x和y映射）可以达到 0.5 μm，而可见范围内的映射的光谱分辨率可以达到 0.2 nm，NIR 范围的光谱分辨率为 0.6 nm。

为了对单个晶体进行高光谱映射，样品制备遵循一个简单的过程:晶体可以简单地放置在玻璃显微镜幻灯片上，根据需要由盖玻璃覆盖...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number