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要約

ここでは、超スペクトルイメージングシステムを用いて、発光ハイパースペクトルイメージングデータを取得し、ランタニド系単結晶の光学異方性の特徴を解析するプロトコルを紹介する。

要約

本研究では、発光ランタニド(Ln3+)ベースの分子単結晶の解析におけるハイパースペクトルイメージング(HSI)の新規応用プロトコルについて説明する。代表的な例として、我々は、UV励起の下で明るい可視放出を示すヘテロダイコンニルベース複合体[TbEu(bpm)(tfaa)6](bpm=2,2'-ビピリミジン、tfaa-=1,1,1-トリフルオロアセチルアセトネート)の単結晶を選んだ。6–HSIは、得られた画像の各画素からのスペクトル情報と発光構造の2次元空間イメージングを組み合わせた新たな技術である。具体的には、[Tb-Eu]複合体の単結晶上のHSIは、研究された結晶に沿って異なる点で発光強度の変動を明らかにする局所スペクトル情報を提供した。これらの変化は、結晶中に存在する光学異方性に起因し、これは結晶構造の各方向におけるLn3+イオンの異なる分子パッキングから生じる。本明細書に記載するHSIは、分子材料の分光空間的調査に対するこのような技術の適合性の一例である。しかし重要なことに、このプロトコルは、他の種類の発光材料(ミクロンサイズの分子結晶、無機微粒子、生体組織のナノ粒子、標識された細胞など)に容易に拡張することができ、構造特性関係のより深い調査のための多くの可能性を開くことができます。最終的には、バイオイメージングから、波導管や光電子デバイスなどの技術アプリケーションまで、幅広い用途に向けた先端材料のエンジニアリングに活用される知識を提供します。

概要

ハイパースペクトルイメージング(HSI)は、各x-y座標があらゆる種類の分光法、すなわち光発光、吸収および散乱分光1、2、32,3に基づくスペクトル情報を含む空間マップを生成する技術である。1その結果、3次元データの集合(「ハイパースペクトルキューブ」とも呼ばれる)が得られ、x-y座標は空間軸、z座標は分析されたサンプルからのスペクトル情報である。したがって、ハイパースペクトルキューブには空間情報とスペクトル情報の両方が含まれているため、従来の分光法よりも詳細な分光分析を行う。HSIはリモートセンシングの分野(例えば、地質学、食品産業4)で長年知られてきましたが,6,7,、最近ではナノ材料22、5、5または生体医学用アプリケーション用プローブの特性評価のための革新的な技術として登場しました。一般的に言うと、UV/可視/近赤外(NIR)ドメインに限定されるものではなく、例えば異なる材料の元素分布を特徴付けるためにX線などの他の放射線源を使用して拡張することもできます。 8また、光発光マッピングは、単層MoS210の光学特性をプローブするラマンマッピングと組み合わされている。しかし、報告された光学,HSIの用途の中で、ランタニド系材料,11、12、13、14、15、16、17のHSIに関する例はまだごくわずかです。11,12,13,14,151617例えば、組織6における癌の検出、生体組織における光貫通深度の解析7、多重化生物学的イメージング3、ハイブリッド系11における多成分エネルギー移動の解析、およびナノ粒子12の分光特性における凝集誘導変化の調査を挙げられる。明らかに、HSIの魅力は、環境特異的な発光に関する知識を生成し、プローブに関する空間情報とスペクトル情報を同時に提供する適合性から生じます。

この強力な技術を利用して、我々はヘテロ二次核結核3+ -Eu3+単結晶の光学異方性を3+調査するためのプロトコルを記述する [TbEu(bpm)(tfaa)6] (図 1a)13.観察された光学異方性は、異なる結晶学的方向(図1b)におけるLn3+イオンの異なる分子パッキングから生じ、結晶面が明るい状態を示すものもあれば、光発光が薄暗くなるものもある。結晶の特定の面での発光強度の増加は、Ln3+···Ln3+イオン距離は最短の 13 .

これらの結果に動機づけられて、我々はHSIを通じた光学異方性を分析するための詳細な方法論の確立を提案し、特定の分子配置18,19,19に起因するイオンイオンエネルギー伝達プロセスおよび調整可能な発光特性をよりよく理解するための道を開く。これらの構造特性関係は、ナノおよびマイクロスケールでの導波システムおよび光磁気記憶装置を含むが、これに限定されない革新的な光学材料設計のための重要な側面として認識されてきた- より効率的で小型化された光学系20の需要に対処する。

プロトコル

注意: イメージャーを操作するときに常に使用されている励起波長に固有の安全ゴーグルを使用することをお勧めします。

1. ハイパースペクトル顕微鏡の構成

注: ハイパースペクトルイメージングシステムの概要を図 2aに示し、イメージャーの主要コンポーネントについて説明します。イメージングシステムは、サンプルからの可視または近赤外(NIR)発光の検出に使用できます。どの検出が必要か(可視またはNIR)に応じて、ライトは2つの異なる光の経路を通過します(図2e)。異なるビーム旋回立方体と二色性フィルタキューブ(光学キューブ)の組み合わせは、それぞれのパスを選択するために、機器内の特定の位置に配置する必要があります。

  1. イメージングシステムに接続されているコンピュータの電源を入れます。コンピュータのモニタの電源を入れます。
  2. 適切な光キューブ構成を設定します (図 2b,c)。
    注: ここでは、UV励起および可視放出検出を用いたHSIマッピング用のイメージャー構成(光キューブ構成)について説明する。ただし、分析したサンプルに応じて、NIR励起や可視またはNIR発光検出のために変更することも可能です。例については、「代表的な結果」を参照してください。
    1. 顕微鏡ステージ(図2aの1)から、検出器に向かう発光ビーム経路(図2aの3)に続いて、光学キューブの最初の位置(図2bの4)を空けて、共焦点顕微鏡の光学立方体(DFM1-P01)を図2bの5と示す位置に置き、サンプルからの放出が可視光路を通って向けられるようにする。
    2. 検出器に向かって光路に沿って見て、可視光ミラーとフィルタを含む可視光立方体(CM1-P01)を配置して、可視放出を検出経路に向け、図2bの6と示す位置に配置する。
    3. 検出器に向かって経路を続け、共焦点ピンホール光キューブ(DFM1-P01)を図2bの7と示す位置に配置し、可視光検出経路を通して光を導く。次に、経路をたどって、放射光が検出器に到達するように図2cの位置8に共焦点分光計(DFM1-P01)を配置する。
    4. HSIマッピングの場合、使用されるピンホールのサイズに合わせて検出器スリット開口部(図2cの9)を手動で制御します(50mm程度が最適)。
    5. PHySpecソフトウェアで、ピンホールの絞りを選択します(図 3の 5)。
      注: ピンホールの開口部が小さいほど、信号強度を犠牲にして HSI 解像度が優れています。
  3. スイッチ(図2dの10)をONの位置に置いて、広帯域ランプ(図2d、差し込み)をオンにします。励起光の強度を制御するには、11(図2d)で示されるノブを、より高い(32 -最低強度)または低い値(1 - 最高強度)に回します。セットアップ中は、広帯域ランプシャッター(図2dの12)を閉じておきます。
    注: 値が高いほど、ランプが発する電力密度の減衰が高くなり、低い値は減衰の低い減衰に対応します。
  4. スイッチをONの位置に設定して、以下の順序で次のハードウェアをオンにします。
    1. ThorLabs モーションコントローラの電源を入れます。
    2. ニコン電源をオンにします。
    3. ASI コントローラの電源を入れます。
    4. Galvo コントローラの電源を入れます。
    5. ProEm検出器をオンにします。
    6. ベイスペック検出器をオンにします。
  5. コンピュータで、アイコンをダブルクリックしてPHySpecソフトウェアを開きます。
    1. IMA Upconversionシステムを初期化するためにキーボードのF8キーを押して、システムへの接続ウィンドウのOKボタンをクリックします。
      注: ステップ 1.5.1.[システム] タブをクリックし、[接続] をクリックして[システムに接続] ウィンドウに移動することもできます。次に、OKボタンをクリックして、イメージングシステムをソフトウェアに接続することができます。
    2. 図 3に示すように、すべてのメニューが、画面の左側にあるインターフェイス (カラー カメラ、ProEm、および Bayspec)と計器コントロールパネルに表示されていることを確認します。

2. [TbEu(bpm)(tfaa)6] 単結晶のハイパースペクトルイメージング

  1. サンプルを調製するために、結晶を顕微鏡ガラススライドに置きます。より高い倍率を使用する必要がある場合は、薄いカバーガラスで結晶を覆い、テープで固定し、試料を薄いカバーガラスを対物レンズに向けて置くことができます。
  2. サンプルを調製したガラススライドを顕微鏡ステージに置き、金属アームを使用して固定します(図4a,b)。
  3. ASIコントローラのジョイスティック(図4c)を使用してサンプルを移動し、使用中の目的にサンプルを配置します。
  4. 目的の下のホイールに右フィルターキューブを手動で配置し(図5の3)、ランプのUV励起を選択し、可視放出を検出器に向けて通過させます。
    注: 追加のフィルター キューブは、緑または青色光の励起を使用するために利用可能です、したがって、適切な励起波長の適切なフィルター キューブを配置することが重要です。
  5. サンプルの下に 20X の目的 (図 5の 5 で示す) を手動で配置し、顕微鏡の左側にある白いボタン (図5の 6) を押して白色光を点灯させます。
    1. 白色のライトの電源ボタンの下にノブを回して明るさを調整します(図5の7)。
  6. PHySpecソフトウェアで、ライブ スキャンの取得を引き起こすカラー カメラ ウィンドウの再生(ビデオ) ボタンを押します。
    1. カラーカメラウィンドウに黒い画像が表示されている場合は、インストゥルメントコントロールパネルの「カラーカメラ」タブの「露出時間(図3の2)」または「ゲイン値」(図3の3)を大きくします。表示された画像が明るすぎる場合は、露出時間を短くしたり、ゲインの値を得たりします。
    2. カメラ/双眼鏡に信号の20%と検出器に信号の80%を送信するために、顕微鏡の右側の前方ノブ(図5の2)がRに設定されていることを確認します。
  7. 目的とステージの距離を調整してサンプルに焦点を当てます (図 4b)。これは、顕微鏡の右側にある図4dに示すノブを回すことによって行われます。
    メモ:大きなノブは粗い調整に使用され、小さいノブはより繊細で小さな焦点の変更のためにある。
  8. ソフトウェアで手動で選択した目的も選択されていることを確認します。まず、上部のメニュー バーの[表示] ボタンをクリックし、次に 1 つの[表示/非表示] スケール バーをクリックして、イメージ上に縮尺記号を表示します (図 3の 1)。次に、指示コントロール パネルの[ガルバノメーター ] タブに移動し、[使用する目的] を選択します (図 3の 4)。ソフトウェアで適切な目的を選択して、表示されているスケールバーが正しいことを確認します。
  9. ソフトウェアでは、タブダイバータ(ProEM –図 3の 6 ) に移動し、SpectraPro SP-2300タブの下にあるタブフィルター (ProEMの場合は 1200 gr/mm -図 3の場合は 7) に移動して、適切な検出器を選択します。
  10. 広帯域ランプシャッター(図2の12)を開いて、サンプルのUV励起を行えるようにします。強度ノブ(図2dの11)を希望の位置(例えば、8 – 中間強度)に回して、広帯域ランプ(UV)励起の強度を制御します。
    1. 広視野照明(開いた開口)またはより小さいスポット照明(より閉じた絞り)から選択するには、図5の4に示すスティックとノブを使用してUVランプフィールド絞りのサイズを制御します。
  11. SpectraPro SP-2300タブで、サンプルの放出を観察する波長を選択します。
  12. 試料の発光波長が不明な場合は、発光スペクトルを取得する。
    1. シーケンサーで+記号をクリックして、放出スペクトルを取得するための新しいシーケンス(「ノード」)を追加します。
      1. スペクトロメーターをクリックし、次にスペクトル取得(スペクトルスキャン付き)をクリックします。
      2. 最小波長(すなわち、400 nm)と最大波長(すなわち、700 nm)を入力し、OKをクリックしてスペクトルが記録されるスペクトル範囲を設定する。
      3. ソフトウェアの左側のメニューで適切な露出時間を選択します。非常に明るいサンプルの場合は短い時間(例えば0.1 s)、薄暗いエミッタの場合は長い時間(例えば2 s)を選択します。
      4. 広帯域ランプ(UV)励起の場合には励起力を調整します(上記のステップ1.3を参照)。
        メモ:NIRダイオード励起の場合、PHySpecソフトウェアの左側にある[ニュートラル密度]ドロップダウンメニューから調整できます。
    2. シーケンサーで、ダブル再生ボタンをクリックしてシーケンス全体を実行します。スペクトルが表示されたら、サンプル放出の検出に関心のある領域(例えば、Tb3+およびEu3+ベースのサンプルの場合は580〜640 nm)に注意してください。
    3. 必要に応じて、サンプルの焦点を変更するか、PHySpecソフトウェアで露光時間を調整して、信号検出を最適化します。上記のように励起源(広帯域ランプ)の電力を変化させることにより、サンプル発光強度の増加を通じて信号検出のさらなる最適化を達成する。
  13. カラーカメラの露光時間(例えば、0.5 s – 2(図3)とゲイン(図3)を適宜調整して、良質の画像を得ます。必要に応じて、PHySpecソフトウェア ウィンドウの上部にあるメニューの 2 行目にある [スケール バーの表示/非表示] ボタンをクリックして、イメージにスケール バーを追加します。
  14. 推奨: ハイパースペクトルキューブを取得する前に、白色光(図6a)および/またはUVフル(図6b)または閉じ込められた(図6c)照明(図5の4)で、光光の光顕微鏡画像を記録してください。これを行うには、サンプルをフォーカスして、カラーカメラの再生ボタンをクリックします。
  15. [ファイル]をクリックし、[ウィンドウビューをエクスポート]をクリックし、取得した画像をエクスポートする形式を選択し、目的の拡張子(.h5,)を付けてファイルを保存します。JPEG)。
  16. ハイパースペクトル画像を取得する前に、部屋の照明と同様に白色光照明をオフにします。
  17. ハイパースペクトル キューブを取得するには、新しいシーケンスを作成します。したがって、シーケンサーで+ 記号をクリックして新しいノードを追加します。
    1. [共焦点イメージャー]をクリックします。
      1. マルチスペクトル取得をクリックします。ここで、望ましい視野は、xおよびy方向およびステップサイズで獲得する点数によって定義される。例えば、xの100ポイント、5μmのステップサイズのyの100ポイントを使用して、500 x 500 μmの画像を得る。
        注: 各ポイントの取得ポイントの合計数と統合時間は、ハイパースペクトル キューブの合計取得時間に直接影響します。
        1. 希望のX位置(例えば、100)とY位置(例えば、100)を入力すると、希望するステップサイズ(例えば、5μm)と同様にカウントされます。可視放出マッピングの場合はカメラ同期のハードウェアオプションを選択します(NIR検出の場合はソフトウェアオプション)。[OK] をクリックします。
  18. シーケンサーで、新しく追加されたマルチスペクトル集録線をクリックしてノードをハイライト表示します。
  19. [再生] ボタンをクリックして、選択したノードを実行します。
    注: 取得にかかる残り時間はノードの横に表示されます(分単位、28分など)。
  20. 取得が完了したら、ハイパースペクトル キューブを適切なファイル形式 (.h5) で保存します。

3. ハイパースペクトルデータ解析

  1. 取得直後に、保存されたハイパースペクトル キューブがソフトウェアで自動的に開かない場合は、上部のメニュー バーの[ファイル] をクリックし、カーソルを置いて[Open File.. ] ウィンドウが開く ] ウィンドウが表示されたら、.h5 ファイルが保存されているフォルダーを選択し、ファイルをダブルクリックして開きます。
  2. ハイパースペクトルキューブファイルをインポートしたら、表示されたハイパースペクトルキューブ画像を変更して、立方体画像の上部にあるバーを左(低波長、例えば580nm)または右(例えば、638nm)に移動して、特定のスペクトル波長の強度を示します。 e.g.,
    メモ:選択した波長は、この上のバーの左側に表示されます(図7の1)。
  3. 解析に関する対象波長を選択した後(例えば、[TbEu(bpm)(tfaa)6]の場合は613.26nmの6最大強度を、3種類のスペクトル分析の1つ(またはすべて)を行います:(A)画像の形でスペクトル分布を(図7の2)。(B) 対象領域全体の発光強度プロファイル (図 7の 3)。(C)特定の点または対象領域におけるスペクトルの抽出(図7の4)。
    1. 画像からのスペクトル分布の場合は、トリミングとビン関数を使用して、画像の信号対雑音比を大きくします。そのためには、上部メニューの[処理]をクリックし、[データ]を選択し、次にオプションの[トリミングとビン]をクリックします。
    2. 放出強度プロファイルの場合、キューブ イメージ上で右クリックして[ターゲットの作成]または[X プロファイルを作成]または[Yプロファイルを作成]を 1 つのポイント([ターゲット - 5]および[図 7 の 6]) またはライン (図 7の[プロファイル - 7] および [8]) のみに応じて選択します。ターゲット、水平線または垂直線のプロファイルをカーソルでドラッグして分析領域を選択し、キューブを横切って移動します。
      1. プロファイルが正しく選択されたら、領域を右クリックして[グラフにターゲットを追加]を選択します。目標(x軸)の物理的位置の関数として発光強度(y軸)を表示する新しいグラフを作成するオプションを選択しました。スペクトルは、挿入された新しいグラフに表示されます (図 7の 6 と 7)。
        注: 複数のターゲットを作成することができ、これらは異なる色付きの放出プロファイルとして表示されます(図7の5と6)。
    3. あるいは、試料の特定の領域の発光スペクトルを得る(図7の9)。まず、キューブイメージの上にカーソルを置き、右クリックします。ポップアップ表示されるタブの[矩形選択] または [楕円選択]オプションをクリックします。
      1. 選択図形 (長方形など) を、目的の領域に描画するには、カーソルをクリックして、キューブを横切ってドラッグします。領域が適切に選択されたら、領域を右クリックし、グラフに選択を追加を選択します。
      2. 表示されるウィンドウで、[新しいグラフを作成]を選択してターゲットの放出スペクトルを表示し、[OK]をクリックします。
        注: 新しい色の線(図 7の 8)が、ターゲットエミッションが表示されているグラフに表示され、放射強度は y 軸、波長は x 軸で表示されます。このスペクトルは、各波長の選択された領域の平均強度に対応しています。
  4. スペクトルが取得されたら、新しいリージョンを選択する前に保存します。これを行うには、グラフが含まれているウィンドウを選択します。[ファイル]メニューの [名前を付けて保存] を選択し、選択した名前を使用して、選択したフォルダーにグラフを保存します。

結果

Lnベースの分子単結晶(すなわち、TbEu(bpm)(tfaa)6]、図1a)におけるデータ取得用ハイパースペクトル顕微鏡の構成を例示すると、図2は、システムの概観とセットアップにおける光学キューブの正しい配置を示す。6図 3は、HSI 取得時に使用したメニューを含む PHySpec ソフトウェアのスクリーン ショットを示しています。

ディスカッション

ここで説明するハイパースペクトルイメージングプロトコルは、サンプルの正確な位置で分光情報を得ることができる簡単なアプローチを提供します。上記の設定を使用すると、空間解像度(xおよびyマッピング)は0.5μmまでまで達し、スペクトル解像度は可視範囲でのマッピングでは0.2 nm、NIR範囲では0.6nmに達することができます。

単一の結晶でハイパース?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。著者は競合する財政的利益を持っていません。

謝辞

著者らは、オタワ大学化学生命分子科学科のディラン・エラーラット氏とムラリー・ムルゲス教授に対し、単結晶の提供に対して感謝している。E.M.R.、N.R.、E.H.は、オタワ大学、カナダイノベーション財団(CFI)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)が提供する財政支援を感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Microscope glass slidesFisherBrand12-550-15Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal ImagerPhotonETCMicroscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number

参考文献

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