Imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de imagem hiperespectrais luminescentes e analisar características de anisotropia óptica de cristais únicos baseados em lantanoide usando um Sistema de Imagem Hiperespectral.

Resumo

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para uma nova aplicação de imagens hiperespectrais (HSI) na análise de cristais únicos moleculares luminescentes^{(Ln 3+}). Como exemplo representativo, escolhemos um único cristal do complexo heterodinuclear baseado em Ln [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (bpm=2,2'-bipirimidina, tfaa^– =1,1,1-trifluoroaaceylacetonato) exibindo emissão visível brilhante sob excitação UV. O HSI é uma técnica emergente que combina imagens espaciais bidimensionais de uma estrutura luminescente com informações espectrais de cada pixel da imagem obtida. Especificamente, o HSI sobre cristais únicos do complexo [Tb-Eu] forneceu informações espectrais locais revelando a variação da intensidade da luminescência em diferentes pontos ao longo dos cristais estudados. Essas mudanças foram atribuídas à anisotropia óptica presente no cristal, que resulta da embalagem molecular diferente de^{Íons Ln 3+} em cada uma das direções da estrutura cristalina. O HSI aqui descrito é um exemplo da adequação dessa técnica para investigações espectro-espaciais de materiais moleculares. No entanto, é importante que este protocolo possa ser facilmente estendido para outros tipos de materiais luminescentes (como cristais moleculares de tamanho micron, micropartículas inorgânicas, nanopartículas em tecidos biológicos, ou células rotuladas, entre outros), abrindo muitas possibilidades para uma investigação mais profunda das relações estruturais-propriedade. Em última análise, tais investigações fornecerão conhecimento a ser aproveitado na engenharia de materiais avançados para uma ampla gama de aplicações, desde bioimagem até aplicações tecnológicas, como guias de onda ou dispositivos optoeletrônicos.

Introdução

Imagem Hiperespectral (HSI) é uma técnica que gera um mapa espacial onde cada coordenada x-y contém uma informação espectral que poderia ser baseada em qualquer tipo de espectroscopia, ou seja, fotoluminescência, absorção e espectroscopia de dispersão^1,2,3. Como resultado, um conjunto tridimensional de dados (também chamado de "cubo hiperespectral") é obtido, onde as coordenadas x-y são os eixos espaciais e a coordenada z é a informação espectral da amostra analisada. Portanto, o cubo hiperespectral contém informações espaciais e espectrais, proporcionando uma investigação espectroscópica mais detalhada da amostra do que a espectroscopia tradicional. Embora o HSI seja conhecido há anos no campo do sensoriamento remoto (porexemplo, geologia, indústrias alimentícias^4),recentemente emergiu como uma técnica inovadora para a caracterização de nanomateriais^2,,5 ou sondas para aplicações biomédicas^3,,6,7,8. De um modo geral, não se limita ao domínio UV/visível/infravermelho próximo (NIR), mas também pode ser estendido usando outras fontes de radiação, como raios-X – por exemplo, a fim de caracterizar a distribuição elementar em diferentes materiais⁹ – ou a radiação Terahertz, onde o HSI foi usado para realizar sensoriamento térmico em tecidos biológicos⁸. Além disso, o mapeamento da fotoluminescência foi combinado com o mapeamento de Raman para sondar as propriedades ópticas da monocamada MoS₂¹⁰. No entanto, entre as aplicações relatadas de HSI óptico, ainda existem apenas alguns exemplos de HSI de materiais à base de lantthanidas^{11,,12,,13,,14,,15,,16,17}. Por exemplo, podemos citar: detecção de câncer nos tecidos⁶, análise da profundidade de penetração da luz em tecidos biológicos⁷, imagem biológica multiplexada^3,análise de transferência de energia multicomponente em sistemas híbridos¹¹, e investigação de alterações induzidas por agregação nas propriedades espectroscópicas de nanopartículas de upconverter¹². Claramente, a atratividade do HSI decorre de sua adequação à geração de conhecimento sobre luminescência específica do ambiente, fornecendo informações espaciais e espectrais simultâneas sobre a sonda.

Aproveitando essa poderosa técnica, descrevemos um protocolo para investigar a anisotropia óptica da tb heterodinuclear Tb³⁺-Eu³⁺ cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)₆](Figura 1a)¹³. A anisotropia óptica observada resultou da embalagem molecular diferente dos íons^{Ln 3+} nas diferentes direções cristalográficas(Figura 1b),resultando em alguns rostos de cristal mostrando mais brilhante, outros mostrando fotoluminescência dimmer. Foi sugerido que o aumento da intensidade de luminescência em faces específicas do cristal estava correlacionado com uma transferência de energia mais eficiente ao longo dessas direções cristalográficas onde o Ln³⁺··· Em³⁺ distâncias de íons foram as mais curtas¹³.

Motivados por esses resultados, propomos o estabelecimento de uma metodologia detalhada para analisar a anisotropia óptica por meio do HSI, abrindo caminho para melhor compreensão dos processos de transferência de energia íon-íon e propriedades luminescentes ajustáveis decorrentes de arranjo molecular específico^18,19. Essas relações estrutura-propriedades têm sido reconhecidas como aspectos importantes para o design inovador de materiais ópticos, incluindo, mas não se limitando a sistemas de guias de ondas e dispositivos de armazenamento optomagnético em nano e microescala – atendendo à demanda por sistemas ópticos mais eficientes e miniaturizados²⁰.

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Protocolo

ATENÇÃO: Recomenda-se usar óculos de segurança específicos para o comprimento de onda de excitação que seja usado em todos os momentos durante a operação do imager.

1. Configuração do microscópio hiperespectral

NOTA: Uma visão geral do sistema de imagem hiperespectral é dada na Figura 2a,com os principais componentes do imager sendo descritos. O sistema de imagem pode ser usado para a detecção da emissão visível ou infravermelha próxima (NIR) de uma amostra. Dependendo de qual detecção é desejada (visível ou NIR), a luz passa por dois caminhos de luz diferentes (Figura 2e). Uma combinação de diferentes cubos giradores de feixe e cubos de filtro dicoicos (cubos ópticos) deve ser posicionada em posições específicas no instrumento para selecionar o respectivo caminho.

1. Energia no computador que está conectado ao sistema de imagem. Ligue o monitor do computador.
2. Defina a configuração óptica adequada do cubo(Figura 2b,c).
   NOTA: Aqui, a configuração do imager(configuração do cubo óptico)para mapeamento de HSI usando excitação UV e detecção de emissões visíveis é descrita. No entanto, também é possível alterá-lo para excitação nir e detecção visível ou de emissão de NIR, dependendo da amostra analisada. Consulte a seção Resultados representativos, por exemplo.
   1. A partir do estágio do microscópio (1 na Figura 2a) e seguindo o caminho do feixe de emissão em direção aos detectores (3 na Figura 2a),deixe a primeira posição para um cubo óptico (4 na Figura 2b) vago e coloque o cubo óptico de microscópio confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 5 na Figura 2b,de modo que a emissão da amostra seja direcionada através do caminho de luz visível.
   2. Olhando ao longo do caminho óptico em direção ao detector, coloque o cubo óptico visível (CM1-P01), que contém o espelho dicórico e os filtros para direcionar a emissão visível para os caminhos de detecção, na posição indicada como 6 na Figura 2b.
   3. Continuando o caminho em direção ao detector, coloque o cubo óptico de pinhole confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 7 na Figura 2b para direcionar a luz através do caminho de detecção de luz visível. Em seguida, seguindo o caminho, coloque o cubo óptico espectrômetro confocal (DFM1-P01) na posição 8 na Figura 2c para que a luz emitida atinja o detector.
   4. Para o mapeamento do HSI, controle manualmente a abertura da fenda do detector (9 na Figura 2c)para combinar com o tamanho dos orifícios utilizados (cerca de 50 mm é ótimo).
   5. No software PHySpec, escolha a abertura do orifício (5 na Figura 3).
      NOTA: Quanto menor a abertura do orifício, melhor é a resolução do HSI, ao custo da intensidade do sinal.
3. Ligue a lâmpada de banda larga(Figura 2d,inset) posicionando o interruptor (10 na Figura 2d)na posição ON. Para controlar a intensidade da luz de excitação, gire o botão indicado por 11 (Figura 2d) para valores mais altos (32 – menor intensidade) ou menores (1 – maior intensidade). Mantenha o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2d) fechado durante a configuração.
   NOTA: Os valores mais elevados correspondem à maior atenuação da densidade de potência emitida pela lâmpada, enquanto valores mais baixos correspondem à menor atenuação.
4. Ligue o seguinte hardware na ordem dada abaixo, definindo seus switches na posição ON:
   1. Ligue o controlador de movimento ThorLabs.
   2. Ligue a fonte de energia Nikon.
   3. Ligue o controlador ASI.
   4. Ligue o controlador Galvo.
   5. Ligue o detector ProEm.
   6. Ligue o detector Bayspec.
5. No computador, abra o software PHySpec clicando duas vezes em seu ícone.
   1. Pressione a tecla F8 no teclado para inicializar o sistema de conversão IMA Upconversion e clique no botão OK na janela Conectar ao sistema.
      NOTA: Passo 1.5.1. também pode ser realizado clicando na guia Sistema e, em seguida, clicando em Conectar para chegar à janela Conectar ao sistema. Em seguida, o botão OK pode ser clicado para conectar o sistema de imagem ao software.
   2. Certifique-se de que todos os menus aparecem na interface(Câmera colorida, ProEm e Bayspec),bem como no painel de controle de instrumentos, no lado esquerdo da tela, conforme mostrado na Figura 3.

2. Imagem hiperespectral de um cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)₆]

1. Para preparar a amostra, coloque o cristal em uma lâmina de vidro de microscopia. Caso seja necessário usar uma ampliação mais elevada, cubra o cristal com um vidro de cobertura fina e fixe-o com fita adesiva, para que a amostra possa ser colocada com o vidro de cobertura fina voltado para a lente objetiva.
2. Coloque o slide de vidro no qual a amostra foi preparada no estágio do microscópio e fixe-a usando os braços metálicos(Figura 4a,b).
3. Mova a amostra usando o joystick(Figura 4c)do controlador ASI para posicionar a amostra sobre os objetivos em uso.
4. Posicione manualmente o cubo do filtro direito na roda sob os objetivos (3 na Figura 5) para selecionar a excitação UV da lâmpada e deixar passar a emissão visível em direção ao detector.
   NOTA: Cubos de filtro adicionais estão disponíveis para usar excitação de luz verde ou azul, portanto, ter o cubo de filtro certo no lugar é importante para o comprimento de onda de excitação apropriado.
5. Posicione manualmente o objetivo 20X (indicado por 5 na Figura 5) sob a amostra e pressione o botão branco (6 na Figura 5) no lado esquerdo do microscópio para acender a luz branca.
   1. Ajuste o brilho girando o botão sob o botão de energia da luz branca (7 na Figura 5).
6. No software PHySpec, pressione o botão Play (vídeo) na janela da câmera colorida, o que causará a aquisição de uma varredura ao vivo.
   1. Se a janela da câmera colorida mostrar uma imagem preta, aumente o Tempo de Exposição (2 na Figura 3) e/ou o Valor de Ganho (3 na Figura 3) encontrado no painel de controle do instrumento, sob a guia Câmera Colorida. Se a imagem visualizada for muito brilhante, diminua o tempo de exposição e/ou ganhe valor.
   2. Certifique-se de que o botão dianteiro no lado direito do microscópio (2 na Figura 5) está configurado como R, a fim de enviar 20% do sinal para a câmera/binóculos e 80% do sinal para o detector.
7. Concentre-se na amostra ajustando a distância entre o objetivo e o estágio(Figura 4b). Isso é feito girando os botões mostrados na Figura 4d no lado direito do microscópio.
   NOTA: O botão maior é usado para ajustes grosseiros, enquanto o botão menor é para mudanças mais delicadas e pequenas de foco.
8. Certifique-se de que o objetivo escolhido manualmente também seja selecionado no software. Primeiro, clique no botão Exibir na barra superior do menu e, em seguida, clique em uma barra de escala Show/hide para exibir a barra de escala na imagem (1 na Figura 3). Em seguida, vá para a guia Galvanometer no painel de controle de instruções e selecione o Objetivo utilizado (4 na Figura 3). Certifique-se de que a barra de escala exibida está correta selecionando o objetivo adequado no software.
9. No software, selecione o detector apropriado indo para a guia Desvior (ProEM – 6 na Figura 3) e grades indo para a aba Filtro (1200 gr/mm no caso do ProEM – 7 na Figura 3) sob a guia SpectraPro SP-2300 .
10. Abra o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2) para permitir que ocorra a excitação UV da amostra. Gire o botão de intensidade (11 na Figura 2d) para a posição desejada (por exemplo, 8 – intensidade intermediária) para controlar a intensidade da excitação da lâmpada de banda larga (UV).
    1. Para escolher entre iluminação de campo largo (abertura aberta) ou uma iluminação de ponto menor (abertura mais fechada), controle o tamanho da abertura do campo da lâmpada UV usando a vara e os botões mostrados em 4 na Figura 5.
11. Na guia SpectraPro SP-2300, selecione um comprimento de onda para observar a emissão da amostra.
12. Se os comprimentos de onda de emissão da amostra forem desconhecidos, adquira um espectro de emissões.
    1. No sequenciador, clique no sinal + para adicionar uma nova seqüência ("nó") para a aquisição de um espectro de emissões.
       1. Clique no Espectrômetro e, em seguida, aquisição de espectro (com varredura espectral).
       2. Insira um comprimento de onda mínimo (ou seja, 400 nm) e um comprimento de onda máximo (ou seja, 700 nm) e clique em OK para definir a faixa espectral na qual o espectro será gravado.
       3. Escolha o Tempo de Exposição adequado no menu do lado esquerdo do software. Escolha tempos mais curtos (por exemplo, 0,1 s) para amostras muito brilhantes e tempos mais longos (por exemplo, 2 s) para emissores dim.
       4. Ajuste a potência de excitação em caso de excitação da lâmpada de banda larga (UV) (ver passo 1.3 acima).
          NOTA: No caso de excitação de diodo NIR, pode ser ajustado a partir do menu suspenso de densidade neutra no lado esquerdo do software PHySpec.
    2. No sequenciador, clique no botão de reprodução dupla para executar toda a seqüência. Uma vez mostrado o espectro, observe as regiões de interesse para a detecção da emissão amostral (por exemplo, 580 a 640 nm no caso de amostras baseadas em Tb³⁺- e^{Eu 3+).}
    3. Conforme necessário, otimize a detecção de sinais alterando o foco da amostra ou ajustando o Tempo de Exposição no software PHySpec. Obter uma otimização adicional da detecção de sinal através do aumento da intensidade de emissão da amostra alterando a potência da fonte de excitação (lâmpada de banda larga), conforme descrito acima.
13. Ajuste o Tempo de Exposição ( porexemplo, 0,5 s – 2 na Figura 3) e Ganhe (3 na Figura 3) da Câmera Colorida em conformidade, para obter uma imagem de boa qualidade. Se necessário, adicione a barra de escala à imagem clicando na barra de escala Show/hide no botão Mostrar/ocultar a barra na segunda linha do menu na parte superior da janela do software PHySpec.
14. Recomendação: Antes de adquirir o cubo hiperespectral, grave uma imagem de microscopia óptica de campo brilhante do cristal sob luz branca (Figura 6a) e/ou UV full(Figura 6b)ou confinada(Figura 6c) (Figura 6c)iluminação (iluminação UV controlada pela abertura do obturador, mostrada como 4 na Figura 5). Para isso, com a amostra em foco, clique no botão de reprodução da câmera colorida.
15. Clique em 'Arquivo' e, em seguida, Exportar janela de exportação,escolha o formato desejado para exportar a imagem obtida e salve o arquivo com a extensão desejada (.h5, . JPEG).
16. Antes de adquirir a imagem hiperespectral, desligue a iluminação da luz branca, bem como a luz do quarto.
17. Para obter o cubo hiperespectral, escreva uma nova sequência. Portanto, no sequenciador, clique no sinal + para adicionar um novo nó.
    1. Clique em Confocal Imager.
       1. Clique em Aquisição multi-espectro. Aqui, o campo de visão desejado é definido pelo número de pontos a serem adquiridos nas direções x e y e pelo tamanho da etapa. Por exemplo, use 100 pontos em x e 100 pontos em y com um tamanho de passo de 5 μm para obter uma imagem de 500 por 500 μm.
          Nota: O número total de pontos de aquisição e o tempo de integração em cada ponto afetarão diretamente o tempo total de aquisição do cubo hiperespectral.
          1. Insira a posição X desejada (por exemplo, 100) e a posição Y (por exemplo, 100) conta, bem como o tamanho do passo desejado (por exemplo, 5 μm). Selecione a opção Hardware para a sincronização da câmera, para mapeamento de emissões visíveis (e opção de software em caso de detecção de NIR). Clique em OK.
18. No sequenciador, clique na recém-adicionada linha de aquisição multi-espectro para destacar o nó.
19. Clique no botão Reproduzir para executar o nó selecionado.
    NOTA: O tempo restante que a aquisição levará aparecerá ao lado do nó (em minutos, por exemplo, 28 min).
20. Uma vez concluída a aquisição, salve o cubo hiperespectral no formato de arquivo apropriado (.h5).

3. Análise de dados hiperespectrais

1. Logo após a aquisição, se o cubo hiperespectral salvo não abrir automaticamente no software, recuperar o cubo hiperespectral, que foi salvo como arquivo .h5, clicando no Arquivo na barra superior do menu e, em seguida, pairando o cursor e clique em Abrir arquivo.... Quando a janela intitulada Selecionar dados(s) para abrir aparece, escolha a pasta onde o arquivo .h5 é salvo e clique duas vezes no arquivo para abri-lo.
2. Uma vez que o arquivo do cubo hiperespectral seja importado, modifique a imagem do cubo hiperespectral exibido para mostrar a intensidade de um comprimento de onda espectral específico movendo a barra na parte superior da imagem do cubo para a esquerda (comprimento de onda inferior, por exemplo, 580 nm) ou direita (comprimento de onda mais alto, por exemplo, 638 nm).
   NOTA: O comprimento de onda selecionado é exibido no lado esquerdo desta barra superior (1 na Figura 7).
3. Após a escolha do comprimento de onda de interesse para a análise (por exemplo,a intensidade máxima, que no caso de [TbEu(bpm)(tfaa)₆] é de 613,26 nm), faça um (ou todos) dos três tipos possíveis de análise espectral: (A) a distribuição espectral em forma de imagem (2 na Figura 7); (B) um perfil de intensidade de emissões em uma região de interesse (3 na Figura 7); c Extração de espectro em um ponto ou região de interesse específico (4 na Figura 7).
   1. No caso da distribuição espectral de uma imagem, use a função Crop e Bin para aumentar a relação sinal-ruído na imagem. Para fazer isso, clique no menu superior Processamento e escolha Data e, em seguida, a opção Crop e Bin.
   2. Para um perfil de intensidade de emissão, na imagem do cubo, clique com o botão direito do mouse e selecione o perfil Criar destino ou Criar X ou Criar perfil Y, dependendo se apenas um ponto (Alvo - 5 e 6 na Figura 7) ou uma linha (Perfil - 7 e 8 na Figura 7) precisar ser analisado. Selecione a área de análise arrastando o alvo, o perfil de linha horizontal ou vertical com o cursor e mova-o através do cubo.
      1. Uma vez que o perfil tenha sido devidamente selecionado, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar destino a gráfico. Escolheu a opção de criar um novo gráfico para exibir a intensidade de emissão (eixoy) em função da posição física do alvo (eixox). O espectro aparecerá no novo gráfico que foi inserido (6 e 7 na Figura 7).
         NOTA: Vários alvos podem ser criados, e estes aparecerão como diferentes perfis de emissões coloridas (5 e 6 na Figura 7).
   3. Alternativamente, obter um espectro de emissão de uma área específica da amostra (9 na Figura 7). Para começar, gire o cursor sobre a imagem do cubo e clique com o botão direito do mouse. Clique nas opções Seleção de Retângulo ou Seleção de Elipse na guia que aparece.
      1. Desenhe a forma de seleção (por exemplo, um retângulo) sobre a região desejada clicando e arrastando o cursor através do cubo. Uma vez que a área tenha sido devidamente selecionada, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar seleção ao gráfico.
      2. Na janela de agregação Adicionar ao gráfico,selecione Criar um novo gráfico para exibir o espectro de emissões do destino e clique em OK.
         NOTA: Uma nova linha colorida (8 na Figura 7) aparecerá no gráfico em que a emissão de destino está sendo mostrada, com a intensidade de emissão como o eixo y e o comprimento de onda no eixo x. Este espectro corresponde à intensidade média da área selecionada para cada comprimento de onda.
4. Uma vez que o espectro é obtido, salve-o antes de selecionar uma nova região porque apenas uma região pode ser selecionada por vez. Para isso, selecione a janela em que contém o gráfico. No menu Arquivo, selecione Salvar como e escolha salvar o gráfico na pasta de escolha, usando o nome de escolha, seja no formato .h5, que pode ser aberto no software PHySpec, ou no formato .csv, que pode ser importado no Excel.

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Resultados

Para ilustrar a configuração do microscópio hiperespectral para a aquisição de dados em um cristal único molecular baseado em Ln (ou seja, [TbEu(bpm)(tfaa)₆], Figura 1a), a Figura 2 mostra uma visão geral do sistema, bem como a colocação correta dos cubos ópticos na configuração. A Figura 3 mostra uma captura de tela do software PHySpec contendo os menus usados durante a aquisição do HSI.

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Discussão

O protocolo de imagem hiperespectral descrito fornece uma abordagem simples que permite obter informações espectroscópicas em locais precisos da amostra. Utilizando a configuração descrita, a resolução espacial(mapeamento x e y) pode chegar até 0,5 μm, enquanto a resolução espectral pode ser de 0,2 nm para o mapeamento na faixa visível e 0,6 nm para a faixa NIR.

Para realizar o mapeamento hiperespectral em um único cristal, a preparação da amostra segue um proc...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number