Imágenes hiperespectrales como herramienta para estudiar la anisotropía óptica en cristales únicos moleculares basados en lantanoia

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos de imágenes hiperespectrales luminiscentes y para analizar las características de anisotropía óptica de cristales únicos basados en lantanoide utilizando un sistema de imágenes hiperespectrales.

Resumen

En este trabajo, describimos un protocolo para una novedosa aplicación de imágenes hiperespectrales (HSI) en el análisis de cristales únicos moleculares basados en lantanoide luminiscente (Ln³⁺). Como ejemplo representativo, elegimos un único cristal del complejo heterodinuclear basado en Ln [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (bpm-2,2'-bipirimidina, tfaa^– 1,1,1-trifluoroacetylacetonate) que exhibe una emisión visible brillante bajo excitación UV. HSI es una técnica emergente que combina imágenes espaciales en 2 dimensiones de una estructura luminiscente con información espectral de cada píxel de la imagen obtenida. Específicamente, HSI en cristales individuales del complejo [Tb-Eu] proporcionó información espectral local revelando la variación de la intensidad de la luminiscencia en diferentes puntos a lo largo de los cristales estudiados. Estos cambios se atribuyeron a la anisotropía óptica presente en el cristal, que resulta del embalaje molecular diferente de los iones Ln³⁺ en cada una de las direcciones de la estructura cristalina. El HSI aquí descrito es un ejemplo de la idoneidad de dicha técnica para las investigaciones espectro-espaciales de materiales moleculares. Sin embargo, es importante destacar que este protocolo se puede extender fácilmente para otros tipos de materiales luminiscentes (como cristales moleculares del tamaño de micrones, micropartículas inorgánicas, nanopartículas en tejidos biológicos o células etiquetadas, entre otros), lo que abre muchas posibilidades para una investigación más profunda de las relaciones estructura-propiedad. En última instancia, estas investigaciones proporcionarán conocimientos que se aprovecharán en la ingeniería de materiales avanzados para una amplia gama de aplicaciones, desde la bioimagen hasta aplicaciones tecnológicas, como guías de ondas o dispositivos optoelectrónicos.

Introducción

La imagen hiperespectral (HSI) es una técnica que genera un mapa espacial donde cada coordenada x-y contiene una información espectral que podría basarse en cualquier tipo de espectroscopia, a saber, fotoluminiscencia, absorción y dispersión de espectroscopias^1,,2,,3. Como resultado, se obtiene un conjunto tridimensional de datos (también llamado "cubo hiperespectral"), donde las coordenadas x-y son los ejes espaciales y la coordenada z es la información espectral de la muestra analizada. Por lo tanto, el cubo hiperespectral contiene información espacial y espectral, proporcionando una investigación espectroscópica más detallada de la muestra que la espectroscopia tradicional. Si bien HSI se conoce desde hace años en el campo de la teledetección (porejemplo, geología, industrias alimentarias^4),recientemente surgió como una técnica innovadora para la caracterización de nanomateriales^2,,5 o sondas para aplicaciones biomédicas^3,6,7,8. En términos generales, no se limita al dominio UV/visible/casi infrarrojo (NIR), sino que también puede extenderse utilizando otras fuentes de radiación, como los rayos X, por ejemplo, con el fin de caracterizar la distribución elemental en diferentes materiales^9, o la radiación de Terahertz, donde se utilizó HSI para realizar la sensibilidad térmica en tejidos biológicos^8. Además, el mapeo de fotoluminiscencia se ha combinado con el mapeo de Raman para sondear las propiedades ópticas de la monocapa MoS₂¹⁰. Sin embargo, entre las aplicaciones notificadas de HSI óptico, todavía hay sólo unos pocos ejemplos sobre HSI de materiales a base de lantanoide^{11,12,13,14,15,16,17}. Por ejemplo, podemos citar: detección de cáncer en tejidos^6,análisis de la profundidad de penetración de la luz en tejidos biológicos^7,imágenes biológicas multiplexadas^3,análisis de transferencia de energía multicomponente en sistemas híbridos^11,e investigación de cambios inducidos por la agregación en propiedades espectroscópicas de la conversión de nanopartículas^12. Claramente, el atractivo de HSI surge de su idoneidad para generar conocimiento sobre la luminiscencia específica del entorno, proporcionando información espacial y espectral simultánea sobre la sonda.

Aprovechando esta poderosa técnica aquí describimos un protocolo para investigar la anisotropía óptica del heterodinuclear Tb³⁺-Eu³⁺ single crystal [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (Figura 1a)¹³. La anisotropía óptica observada fue el resultado del diferente empaque molecular de los iones Ln³⁺ en las diferentes direcciones cristalográficas(Figura 1b),lo que dio lugar a que algunas caras de cristal mostraran más brillante, otras que muestran fotoluminiscencia más tenue. Se sugirió que el aumento de la intensidad de la luminiscencia en caras específicas del cristal se correlacionaba con una transferencia de energía más eficiente a lo largo de esas direcciones cristalográficas donde el Ln³⁺ Las distancias de iones Ln³⁺ fueron las¹³más cortas.

Motivados por estos resultados, proponemos el establecimiento de una metodología detallada para analizar la anisotropía óptica a través de HSI, abriendo el camino para una mejor comprensión de los procesos de transferencia de energía ión-ion y propiedades luminiscentes ajustables derivadas de la disposición molecular específica^18,,19. Estas relaciones estructura-propiedades han sido reconocidas como aspectos importantes para el diseño de materiales ópticos innovadores, incluidos, entre otros, los sistemas de guía de ondas y los dispositivos de almacenamiento optomagnéticos a nano y microescala, atendiendo la demanda de sistemas ópticos más eficientes y miniaturizados^20.

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Protocolo

ADVERTENCIA: Se recomienda utilizar gafas de seguridad específicas para la longitud de onda de excitación que se utiliza en todo momento al operar el imager.

1. Configuración del microscopio hiperespectral

NOTA: En la Figura 2ase ofrece una visión general del sistema de imágenes hiperespectral, y se describen los principales componentes del imager. El sistema de imágenes se puede utilizar para la detección de la emisión visible o infrarroja cercana (NIR) de una muestra. Dependiendo de qué detección se desea (visible o NIR), la luz pasa a través de dos caminos de luz diferentes(Figura 2e). Se debe colocar una combinación de diferentes cubos de torneado de haz y cubos de filtro dicroico (cubos ópticos) en posiciones específicas del instrumento para seleccionar la ruta respectiva.

1. Encienda el ordenador que está conectado al sistema de imágenes. Encienda el monitor del ordenador.
2. Establezca la configuración de cubo óptico adecuada(Figura 2b,c).
   NOTA: Aquí se describe la configuración del imager(configuración de cubo óptico)para la asignación HSI mediante excitación UV y detección de emisiones visibles. Sin embargo, también es posible cambiarlo para la excitación NIR y la detección de emisiones visibles o NIR, dependiendo de la muestra analizada. Consulte la sección Resultados representativos para obtener un ejemplo.
   1. A partir de la etapa del microscopio (1 en la Figura 2a)y siguiendo la vía del haz de emisión hacia los detectores (3 en la Figura 2a), deje la primera posición para un cubo óptico (4 en la Figura 2b)vacante y coloque el cubo óptico del microscopio confocal (DFM1-P01) en la posición indicada como 5 en la Figura 2b,de modo que la emisión de la muestra se dirija a través de la trayectoria de luz visible.
   2. Mirando a lo largo de la trayectoria óptica hacia el detector, coloque el cubo óptico visible (CM1-P01), que contiene el espejo dicroico y los filtros para dirigir la emisión visible a las trayectorias de detección, en la posición indicada como 6 en la Figura 2b.
   3. Continuando con el camino hacia el detector, coloque el cubo óptico de agujero confocal (DFM1-P01) en la posición indicada como 7 en la Figura 2b para dirigir la luz a través de la trayectoria de detección de luz visible. A continuación, siguiendo el camino, coloque el cubo óptico del espectrómetro confocal (DFM1-P01) en la posición 8 de la Figura 2c para que la luz emitida llegue al detector.
   4. Para la asignación HSI, controle manualmente la abertura de la ranura del detector (9 en la figura 2c)para que coincida con el tamaño de los agujeros que se utilizan (alrededor de 50 mm es óptimo).
   5. En el software PHySpec, elija la apertura del agujero (5 en la Figura 3).
      NOTA: Cuanto más pequeña sea la apertura del agujero, mejor será la resolución HSI, a costa de la intensidad de la señal.
3. Encienda la lámpara de banda ancha(Figura 2d, inserción) colocando el interruptor (10 en la Figura 2d)en la posición ON. Para controlar la intensidad de la luz de excitación, gire la perilla indicada por 11(Figura 2d)a valores más altos (32 – intensidad más baja) o más bajos (1 – intensidad más alta). Mantenga el obturador de la lámpara de banda ancha (12 en la Figura 2d)cerrado durante la configuración.
   NOTA: Los valores más altos corresponden a una mayor atenuación de la densidad de potencia emitida por la lámpara, mientras que los valores más bajos corresponden a una atenuación más baja.
4. Encienda el siguiente hardware en el orden indicado a continuación estableciendo sus interruptores en la posición ON:
   1. Encienda el controlador de movimiento ThorLabs.
   2. Encienda la fuente de alimentación Nikon.
   3. Encienda el controlador ASI.
   4. Encienda el controlador Galvo.
   5. Encienda el detector ProEm.
   6. Encienda el detector Bayspec.
5. En el ordenador, abra el software PHySpec haciendo doble clic en su icono.
   1. Presione la tecla F8 en el teclado para inicializar el sistema de upconversion IMA y haga clic el botón OK en la ventana conectar con el sistema.
      NOTA: Paso 1.5.1. También se puede realizar haciendo clic en la pestaña Sistema y luego haciendo clic en Conectar para llegar a la ventana Conectar al sistema. A continuación, se puede hacer clic en el botón Aceptar para conectar el sistema de imágenes al software.
   2. Asegúrese de que todos los menús aparecen en la interfaz (Cámara decolor, ProEm y Bayspec),así como en el panel de control del instrumento, en el lado izquierdo de la pantalla, como se muestra en la Figura 3.

2. Imágenes hiperespectrales de un cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)₆]

1. Para preparar la muestra, coloque el cristal en un portaobjetos de vidrio de microscopía. En caso de que sea necesario utilizar un aumento más alto, cubra el cristal con un vidrio de cubierta delgada y fíjelo con cinta adhesiva, de modo que la muestra se pueda colocar con el vidrio de cubierta delgada orientado hacia la lente objetivo.
2. Coloque el portaobjetos de vidrio sobre el que se ha preparado la muestra en la etapa del microscopio y fíjela con los brazos metálicos(Figura 4a,b).
3. Mueva la muestra utilizando el joystick(Figura 4c)del controlador ASI para colocar la muestra sobre los objetivos en uso.
4. Coloque manualmente el cubo de filtro derecho en la rueda debajo de los objetivos (3 en la Figura 5)para seleccionar la excitación UV de la lámpara y dejar pasar la emisión visible hacia el detector.
   NOTA: Los cubos de filtro adicionales están disponibles para utilizar la excitación de luz verde o azul, por lo tanto, tener el cubo de filtro adecuado en su lugar es importante para la longitud de onda de excitación adecuada.
5. Coloque manualmente el objetivo 20X (indicado por 5 en la Figura 5)debajo de la muestra y presione el botón blanco (6 en la Figura 5) en el lado izquierdo del microscopio para encender la luz blanca.
   1. Ajuste el brillo girando la perilla debajo del botón de encendido de luz blanca (7 en la Figura 5).
6. En el software PHySpec, pulse el botón Reproducir (vídeo) en la ventana de la cámara en color, lo que provocará la adquisición de un escaneo en vivo.
   1. Si la ventana de la cámara en color muestra una imagen negra, aumente el tiempo de exposición (2 en la figura 3)y/o el valor de ganancia (3 en la figura 3)que se encuentra en el panel de control del instrumento, en la pestaña Cámara de color. Si la imagen vista es demasiado brillante, disminuya el tiempo de exposición y/o el valor de ganancia.
   2. Asegúrese de que la perilla delantera en el lado derecho del microscopio (2 en la Figura 5)esté establecida en R para enviar el 20% de la señal a la cámara/binoculares y el 80% de la señal al detector.
7. Concéntrese en la muestra ajustando la distancia entre el objetivo y la etapa(Figura 4b). Esto se hace girando las perillas que se muestran en la Figura 4d en el lado derecho del microscopio.
   NOTA: La perilla más grande se utiliza para ajustes gruesos, mientras que la perilla más pequeña es para cambios de enfoque más delicados y pequeños.
8. Asegúrese de que el objetivo elegido manualmente también está seleccionado en el software. En primer lugar, haga clic en el botón Ver en la barra de menú superior y, a continuación, haga clic en una barra de escala Mostrar/ocultar para mostrar la barra de escala en la imagen (1 en la Figura 3). A continuación, vaya a la pestaña Galvanómetro en el panel de control de instrucciones y seleccione el Objetivo utilizado (4 en la Figura 3). Asegúrese de que la barra de escala mostrada es correcta seleccionando el objetivo adecuado en el software.
9. En el software, seleccione el detector adecuado yendo a la pestaña Diverter (ProEM – 6 en la Figura 3) y las rejillas yendo a la pestaña Filtro (1200 gr/mm en caso de ProEM – 7 en la Figura 3) en la pestaña SpectraPro SP-2300 .
10. Abra el obturador de la lámpara de banda ancha (12 en la Figura 2)para permitir que se lleve a cabo la excitación UV de la muestra. Gire la perilla de intensidad (11 en la Figura 2d)a la posición deseada (por ejemplo, 8 – intensidad intermedia) para controlar la intensidad de la excitación de la lámpara de banda ancha (UV).
    1. Para elegir entre una iluminación de campo ancho (apertura abierta) o una iluminación puntual más pequeña (apertura más cerrada), controle el tamaño de la apertura del campo de la lámpara UV utilizando el stick y las perillas que se muestran en 4 en la Figura 5.
11. En la pestaña SpectraPro SP-2300, seleccione una longitud de onda para observar la emisión de la muestra.
12. Si se desconocen las longitudes de onda de emisión de la muestra, adquiera un espectro de emisión.
    1. En el secuenciador, haga clic en el signo + para agregar una nueva secuencia ("nodo") para la adquisición de un espectro de emisiones.
       1. Haga clic en Espectrómetro y luego en Adquisición de espectro (con escaneo espectral).
       2. Introduzca una longitud de onda mínima (es decir, 400 nm) y una longitud de onda máxima (es decir, 700 nm) y haga clic en Aceptar para establecer el rango espectral en el que se registrará el espectro.
       3. Elija el tiempo de exposición adecuado en el menú del lado izquierdo del software. Elija tiempos más cortos (por ejemplo, 0,1 s) para muestras muy brillantes y tiempos más largos (por ejemplo, 2 s) para emisores tenues.
       4. Ajuste la potencia de excitación en caso de excitación de la lámpara de banda ancha (UV) (véase el paso 1.3 anterior).
          NOTA: En caso de excitación de diodos NIR, se puede ajustar desde el menú desplegable Densidad neutra en el lado izquierdo del software PHySpec.
    2. En el secuenciador, haga clic en el botón de reproducción doble para ejecutar toda la secuencia. Una vez mostrado el espectro, tenga en cuenta las regiones de interés para la detección de la emisión de la muestra (porejemplo, 580 a 640 nm en el caso de las muestras basadas en Tb³⁺y Eu^3+).
    3. Según sea necesario, optimice la detección de señal cambiando el enfoque de la muestra o ajustando el tiempo de exposición en el software PHySpec. Lograr una mayor optimización de la detección de señal a través del aumento de la intensidad de emisión de la muestra cambiando la potencia de la fuente de excitación (lámpara de banda ancha), como se ha descrito anteriormente.
13. Ajuste el tiempo de exposición (p. ej., 0,5 s – 2 en la Figura 3) y la ganancia (3 en la figura 3)de la cámara de color en consecuencia, para obtener una imagen de buena calidad. Color Camera Si es necesario, agregue la barra de escala a la imagen haciendo clic en el botón Mostrar/ocultar barra de escala en la segunda fila del menú en la parte superior de la ventana del software PHySpec.
14. Recomendación: Antes de adquirir el cubo hiperespectral, registre una imagen de microscopía óptica de campo brillante del cristal bajo luz blanca(Figura 6a)y/o iluminación UV completa(Figura 6b)o confinada(Figura 6c)(iluminación UV controlada por la abertura del obturador, mostrada como 4 en la Figura 5). Para ello, con la muestra enfocada, haga clic en el botón de reproducción de la cámara a color.
15. Haga clic en Archivo y luego en Exportar vistade ventana , elija el formato deseado para exportar la imagen obtenida y guarde el archivo con la extensión deseada (.h5, . JPEG).
16. Antes de adquirir la imagen hiperespectral, apague la iluminación de luz blanca, así como la luz de la habitación.
17. Para obtener el cubo hiperespectral, escriba una nueva secuencia. Por lo tanto, en el secuenciador, haga clic en el signo + para agregar un nuevo nodo.
    1. Haga clic en Confocal Imager.
       1. Haga clic en Adquisición multiespectro. Aquí, el campo de visión deseado se define por el número de puntos a adquirir en las direcciones x e y y el tamaño del paso. Por ejemplo, utilice 100 puntos en x y 100 puntos en y con un tamaño de paso de 5 m para obtener una imagen de 500 por 500 m.
          Nota: El número total de puntos de adquisición y el tiempo de integración en cada punto afectarán directamente al tiempo total de adquisición del cubo hiperespectral.
          1. Introduzca los recuentos de posición X deseada (p. ej., 100) y posición Y (p. ej., 100) así como el tamaño de paso deseado (p. ej., 5 m). Seleccione la opción Hardware para la sincronización de la cámara, para la asignación de emisiones visible (y la opción Software en caso de detección NIR). Haga clic en Aceptar.
18. En el secuenciador, haga clic en la línea de adquisición multiespectro recién agregada para resaltar el nodo.
19. Haga clic en el botón Reproducir para ejecutar el nodo seleccionado.
    NOTA: El tiempo restante que tomará la adquisición aparecerá junto al nodo (en minutos, por ejemplo, 28 min).
20. Una vez completada la adquisición, guarde el cubo hiperespectral en el formato de archivo adecuado (.h5).

3. Análisis de datos hiperespectrales

1. Justo después de la adquisición, si el cubo hiperespectral guardado no se abre automáticamente en el software, recupere el cubo hiperespectral, que se guardó como archivo .h5, haciendo clic en Archivo en la barra de menú superior y luego pasando el cursor y haga clic en Abrir archivo.... Cuando la ventana titulada Seleccionar datos para abrir aparezca, elija la carpeta donde se guarda el archivo .h5 y haga doble clic en el archivo para abrirlo.
2. Una vez importado el archivo de cubo hiperespectral, modifique la imagen del cubo hiperespectral mostrada para mostrar la intensidad de una longitud de onda espectral específica moviendo la barra en la parte superior de la imagen del cubo hacia la izquierda (longitud de onda inferior, por ejemplo, 580 nm) o derecha (longitud de onda más alta, por ejemplo, 638 nm).
   NOTA: La longitud de onda seleccionada se muestra en el lado izquierdo de esta barra superior (1 en la Figura 7).
3. Después de elegir la longitud de onda de interés para el análisis(porejemplo, la intensidad máxima, que en el caso de [TbEu(bpm)(tfaa)₆] es 613,26 nm), hacer uno (o todos) de los tres tipos posibles de análisis espectral: (A) la distribución espectral en forma de imagen (2 en la Figura 7); (B) un perfil de intensidad de emisión en una región de interés (3 en la figura 7); (C) extracción de un espectro en un punto o región de interés específico (4 en la Figura 7).
   1. En el caso de la distribución espectral de una imagen, utilice la función Recortar y Bin para aumentar la relación señal-ruido en la imagen. Para hacer eso, haga clic en el menú superior Procesamiento entonces elija los datos y después la opción Recortar y Bin.
   2. Para un perfil de intensidad de emisión, en la imagen del cubo, haga clic con el botón derecho y seleccione el perfil Crear destino o Crear X o Crear y, dependiendo de si solo es necesario analizar un punto (Objetivo - 5 y 6 en la Figura 7)o una línea (Perfil - 7 y 8 en la Figura 7). Seleccione el área de análisis arrastrando el destino, el perfil de línea horizontal o vertical con el cursor y muévalo a través del cubo.
      1. Una vez que el perfil se ha seleccionado correctamente, haga clic con el botón derecho en la región y seleccione Agregar destino al gráfico. Elija la opción para crear un nuevo gráfico para mostrar la intensidad de emisión (ejey) en función de la posición física del objetivo (eje x). El espectro aparecerá en el nuevo gráfico que se insertó (6 y 7 en la Figura 7).
         NOTA: Se pueden crear varios objetivos, que se mostrarán como perfiles de emisión de diferentes colores (5 y 6 en la Figura 7).
   3. Alternativamente, obtener un espectro de emisión de un área específica de la muestra (9 en la figura 7). Para empezar, coloque el cursor sobre la imagen del cubo y haga clic con el botón derecho. Haga clic en las opciones Selección de rectángulo o Selección de elipse en la pestaña que aparece.
      1. Dibuje la forma de selección (por ejemplo, un rectángulo) sobre la región deseada haciendo clic y arrastrando el cursor por el cubo. Una vez que el área se ha seleccionado correctamente, haga clic con el botón derecho en la región y seleccione Agregar selección al gráfico.
      2. En la ventana que aparece Añadir al gráfico, seleccione Crear un nuevo gráfico para mostrar los espectros de emisión del objetivo y haga clic en Aceptar.
         NOTA: Aparecerá una nueva línea de color (8 en la Figura 7) en el gráfico en el que se muestra la emisión objetivo, con la intensidad de emisión como eje y y la longitud de onda en el eje x. Este espectro corresponde a la intensidad promediada del área seleccionada para cada longitud de onda.
4. Una vez obtenido el espectro, guárdelo antes de seleccionar una nueva región porque solo se puede seleccionar una región a la vez. Para ello, seleccione la ventana en la que contiene el gráfico. En el menú Archivo, seleccione Guardar como y elija guardar el gráfico en la carpeta de su elección, utilizando el nombre de elección, ya sea en formato .h5, que se puede abrir en el software PHySpec, o en formato .csv, que se puede importar en Excel.

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Resultados

Para ilustrar la configuración del microscopio hiperespectral para la adquisición de datos en un cristal único molecular basado en Ln (es decir, [TbEu(bpm)(tfaa)₆], Figura 1a), la Figura 2 muestra una visión general del sistema, así como la colocación correcta de los cubos ópticos en la configuración. La Figura 3 muestra una captura de pantalla del software PHySpec que contiene los menús utilizados durante la adq...

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Discusión

El protocolo de imágenes hiperespectrales aquí descrito proporciona un enfoque sencillo que permite obtener información espectroscópica en ubicaciones precisas de la muestra. Usando la configuración descrita, la resolución espacial (asignaciónx e y) puede alcanzar hasta 0.5 m mientras que la resolución espectral puede ser de 0.2 nm para la asignación en el rango visible y 0.6 nm para el rango NIR.

Con el fin de realizar mapeo hiperespectral en un solo cristal, la pre...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number