Hyperspektrale Bildgebung als Werkzeug zur Untersuchung der optischen Anisotropie in Lanthanid-basierten molekularen Einzelkristallen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um lumineszierende hyperspektrale Bildgebungsdaten zu erhalten und optische Anisotropie-Features von Lanthanid-basierten Einzelkristallen mit einem Hyperspektral Imaging System zu analysieren.

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für eine neuartige Anwendung der hyperspektralen Bildgebung (HSI) bei der Analyse von lumineszierendem Lanthanid (Ln³⁺⁾basierenden molekularen Einzelkristallen. Als repräsentatives Beispiel wählten wir einen einzigen Kristall des heterodinuklearen Ln-basierten Komplexes [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (bpm=2,2'--bipyrimidin, tfaa^– =1,1,1-trifluoroacetylacetonate), der eine helle sichtbare Emission unter UV-Erregung aufweist. HSI ist eine aufkommende Technik, die die zweidimensionale räumliche Bildgebung einer lumineszierenden Struktur mit spektralen Informationen aus jedem Pixel des erhaltenen Bildes kombiniert. Insbesondere lieferte HSI auf Einzelkristallen des [Tb-Eu]-Komplexes lokale spektrale Informationen, die Variationen der Lumineszenzintensität an verschiedenen Punkten entlang der untersuchten Kristalle enthüllten. Diese Veränderungen wurden auf die optische Anisotropie im Kristall zurückgeführt, die sich aus der unterschiedlichen molekularen Verpackung von Ln³⁺ Ionen in jeder der Richtungen der Kristallstruktur ergibt. Das hier beschriebene HSI ist ein Beispiel für die Eignung einer solchen Technik für spektroräumliche Untersuchungen molekularer Materialien. Dennoch ist es wichtig, dass dieses Protokoll leicht auf andere Arten von leuchtminen Materialien erweitert werden kann (z. B. molekulare Kristalle in Mikrogröße, anorganische Mikropartikel, Nanopartikel in biologischen Geweben oder markierte Zellen, die viele Möglichkeiten für eine tiefere Untersuchung von Struktur-Eigenschaft-Beziehungen eröffnen. Letztlich werden solche Untersuchungen Wissen liefern, das in die Entwicklung fortschrittlicher Materialien für eine breite Palette von Anwendungen wie Bioimaging bis hin zu technologischen Anwendungen wie Wellenleitern oder optoelektronischen Geräten genutzt werden kann.

Einleitung

Hyperspektrale Bildgebung (HSI) ist eine Technik, die eine räumliche Karte generiert, bei der jede x-y-Koordinate spektrale Informationen enthält, die auf jeder Art von Spektroskopie basieren könnten, nämlich Photolumineszenz-, Absorptions- und Streuspektroskopien^1,2,3. Als Ergebnis wird ein dreidimensionaler Datensatz (auch "Hyperspektralwürfel" genannt) erhalten, wobei die x-y-Koordinaten die räumlichen Achsen und die z-Koordinate die Spektralinformationen aus der analysierten Stichprobe sind. Daher enthält der hyperspektrale Würfel sowohl räumliche als auch spektrale Informationen, die eine detailliertere spektroskopische Untersuchung der Probe als die herkömmliche Spektroskopie bieten. Während HSI seit Jahren im Bereich der Fernerkundung bekannt ist (z.B. Geologie, Lebensmittelindustrie⁴), hat es sich vor kurzem als innovative Technik zur Charakterisierung von Nanomaterialien^2,5 oder Sonden für biomedizinische Anwendungen^3,6,7,8entwickelt.., Im Allgemeinen ist sie nicht auf die UV/visible/near-infrared (NIR) Domäne beschränkt, sondern kann auch mit anderen Strahlungsquellen, wie Röntgenstrahlen – zum Beispiel zur Charakterisierung der Elementarverteilung in verschiedenen Materialien⁹ – oder Terahertz-Strahlung erweitert werden, bei der HSI zur thermischen Erfassung in biologischen Geweben⁸verwendet wurde. Darüber hinaus wurde photoluminescence mapping mit Raman Mapping kombiniert, um die optischen Eigenschaften von Monolayer MoS₂¹⁰zu untersuchen. Unter den gemeldeten Anwendungen von optischem HSI gibt es jedoch nur wenige Beispiele für HSI von Lanthanid-basierten Materialien^{11,12,13,14,15,16,17}. Zum Beispiel können wir zitieren: Nachweis von Krebs im Gewebe⁶, Analyse der Lichtdurchdringungstiefe in biologischen Geweben⁷, Multiplexed biologische Bildgebung³, Analyse der Mehrkomponenten-Energieübertragung in Hybridsystemen¹¹, und Untersuchung von Aggregation-induzierten Veränderungen der spektroskopischen Eigenschaften von upconverting nanoparticles¹². Die Attraktivität von HSI ergibt sich eindeutig aus seiner Eignung zur Generierung von Wissen über umgebungsspezifische Lumineszenz, die gleichzeitige räumliche und spektrale Informationen über die Sonde liefert.

Unter Ausnutzung dieser leistungsstarken Technik beschreiben wir hier ein Protokoll zur Untersuchung der optischen Anisotropie des heterodinuklearen Tb³⁺-Eu³⁺ Einzelkristalls [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (Abbildung 1a)¹³. Die beobachtete optische Anisotropie resultierte aus der unterschiedlichen molekularen Verpackung der Ln^3+-Ionen in den verschiedenen kristallographischen Richtungen(Abbildung 1b), was dazu führte, dass einige Kristallflächen heller waren, andere dimmerphotolumineszenz zeigten. Es wurde vermutet, dass die erhöhte Lumineszenzintensität an bestimmten Flächen des Kristalls mit einer effizienteren Energieübertragung entlang dieser kristallographischen Richtungen korrelierte, in denen die Ln³⁺ Ln³⁺ Ionendistanzen waren die kürzesten¹³.

Motiviert durch diese Ergebnisse schlagen wir die Einrichtung einer detaillierten Methodik zur Analyse der optischen Anisotropie durch HSI vor, die den Weg für ein besseres Verständnis von Ionen-Ionen-Energieübertragungsprozessen und abstimmbaren Leuchteigenschaften öffnet, die sich aus der spezifischen molekularen Anordnung^18,19ergeben. Diese Struktur-Eigenschaften-Beziehungen wurden als wichtige Aspekte für innovative optische Materialgestaltung anerkannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wellenleitersysteme und optomagnetische Speichergeräte im Nano- und Mikromaßstab – um die Nachfrage nach effizienteren und miniaturisierten optischen Systemen zu decken²⁰.

Protokoll

VORSICHT: Es wird empfohlen, Sicherheitsbrillen zu verwenden, die speziell für die Anregungswellenlänge verwendet werden, die bei der Bedienung des Imagers jederzeit verwendet wird.

1. Konfiguration des Hyperspektralmikroskops

HINWEIS: Eine Übersicht über das hyperspektrale Bildgebungssystem ist in Abbildung 2aenthalten, wobei die Hauptkomponenten des Imagers beschrieben werden. Das Bildgebungssystem kann zur Detektion der sichtbaren oder nahinfraroten (NIR) Emission aus einer Probe verwendet werden. Je nachdem, welche Detektion gewünscht wird (sichtbar oder NIR), geht das Licht durch zwei verschiedene Lichtpfade(Abbildung 2e). Eine Kombination aus verschiedenen Strahldrehwürfeln und dichroitischen Filterwürfeln (optische Würfel) muss an bestimmten Positionen im Instrument positioniert werden, um den jeweiligen Pfad auszuwählen.

1. Schalten Sie den Computer ein, der mit dem Bildgebungssystem verbunden ist. Schalten Sie den Monitor des Computers ein.
2. Legen Sie die entsprechende konfiguration des optischen Cubes fest (Abbildung 2b,c).
   HINWEIS: Hier wird die Imagerkonfiguration(optische Würfelkonfiguration) für die HSI-Zuordnung mit UV-Anregung und sichtbarer Emissionserkennung beschrieben. Je nach analysierter Probe ist es jedoch auch möglich, sie für die NIR-Erregung und die sichtbare oder NIR-Emissionsdetektion zu ändern. Ein Beispiel finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
   1. Ausgehend von der Mikroskopstufe (1 in Abbildung 2a) und nach dem Emissionsstrahlweg in Richtung der Detektoren (3 in Abbildung 2a)verlassen Sie die erste Position für einen optischen Würfel (4 in Abbildung 2b) frei und platzieren Sie den konfokalen optischen Würfel des Mikroskops (DFM1-P01) in der Position, die in Abbildung 2bals 5 angegeben ist, so dass die Emission aus der Probe durch den sichtbaren Lichtpfad geleitet wird.
   2. Wenn Sie den optischen Weg zum Detektor betrachten, platzieren Sie den sichtbaren optischen Würfel (CM1-P01), der den dichroitischen Spiegel und die Filter enthält, um die sichtbare Emission auf die Erfassungspfade zu lenken, an der Position, die in Abbildung 2bals 6 angegeben ist.
   3. Wenn Sie den Weg zum Detektor fortsetzen, platzieren Sie den konfokalen optischen Pinlochwürfel (DFM1-P01) in der Position, die in der Abbildung 2b als 7 angegeben ist, um das Licht durch den sichtbaren Lichterfassungspfad zu lenken. Legen Sie dann nach dem Pfad den optischen Kubokmeter (DFM1-P01) in Abbildung 2c an Position 8, damit das emittierte Licht den Detektor erreicht.
   4. Für die HSI-Mapping, manuell steuern Sie die Detektor-Schlitzöffnung (9 in Abbildung 2c) um die Größe der verwendeten Lochlöcher (ca. 50 mm ist optimal).
   5. Wählen Sie in der PHySpec-Software die Blende des Lochs aus (5 in Abbildung 3).
      HINWEIS: Je kleiner die Lochöffnung, desto besser ist die HSI-Auflösung auf Kosten der Signalintensität.
3. Schalten Sie die Breitbandlampe(Abbildung 2d, Inset) ein, indem Sie den Schalter (10 in Abbildung 2d)in die ON-Position positionieren. Um die Intensität des Anregungslichts zu steuern, drehen Sie den mit 11 (Abbildung 2d) angezeigten Knopf auf höhere (32 – niedrigste Intensität) oder niedrigere Werte (1 – höchste Intensität). Halten Sie den Breitband-Lampenverschluss (12 in Abbildung 2d) während des Aufbaus geschlossen.
   HINWEIS: Die höheren Werte entsprechen einer höheren Dämpfung der von der Lampe emittierten Leistungsdichte, während niedrigere Werte einer niedrigeren Dämpfung entsprechen.
4. Schalten Sie die folgende Hardware in der unten angegebenen Reihenfolge ein, indem Sie ihre Schalter in die ON-Position setzen:
   1. Schalten Sie den ThorLabs-Bewegungscontroller ein.
   2. Schalten Sie die Nikon-Stromquelle ein.
   3. Schalten Sie den ASI-Controller ein.
   4. Schalten Sie den Galvo-Controller ein.
   5. Schalten Sie den ProEm-Detektor ein.
   6. Schalten Sie den Bayspec-Detektorein.
5. Öffnen Sie am Computer die PHySpec-Software, indem Sie auf das entsprechende Symbol doppelklicken.
   1. Drücken Sie die F8-Taste auf der Tastatur, um das IMA Upconversion-System zu initialisieren, und klicken Sie im Fenster Verbinden mit System auf die Schaltfläche OK.
      HINWEIS: Schritt 1.5.1. kann auch durchgeführt werden, indem Sie auf die Registerkarte System klicken und dann auf Verbinden klicken, um zum Fenster Verbinden mit System zu gelangen. Dann kann auf die Schaltfläche OK geklickt werden, um das Bildgebungssystem mit der Software zu verbinden.
   2. Stellen Sie sicher, dass alle Menüs auf der Benutzeroberfläche (Farbkamera, ProEm und Bayspec) sowie auf der Instrumentensteuerung auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt werden, wie in Abbildung 3dargestellt.

2. Hyperspektrale Bildgebung eines [TbEu(bpm)(tfaa)₆]

1. Um die Probe vorzubereiten, legen Sie den Kristall auf eine Mikroskopie Glasrutsche. Falls es notwendig ist, eine höhere Vergrößerung zu verwenden, bedecken Sie den Kristall mit einem dünnen Deckglas und befestigen Sie ihn mit Klebeband, so dass die Probe mit dem dünnen Deckglas zur Objektivlinse hin platziert werden kann.
2. Legen Sie die Glasrutsche, auf die die Probe vorbereitet wurde, auf die Mikroskopbühne und sichern Sie sie mit den Metallarmen (Abbildung 4a,b).
3. Verschieben Sie die Probe mit dem Joystick (Abbildung 4c) des ASI-Controllers, um die Probe über den verwendungsgemäßen Zielen zu positionieren.
4. Positionieren Sie den rechten Filterwürfel manuell im Rad unter den Zielen (3 in Abbildung 5), um die UV-Erregung der Lampe auszuwählen und die sichtbare Emission in Richtung des Detektors passieren zu lassen.
   HINWEIS: Zusätzliche Filterwürfel stehen zur Verfügung, um entweder grüne oder blaue Lichtanregung zu verwenden, daher ist es wichtig, den richtigen Filterwürfel an Ort und Stelle zu haben, um die entsprechende Anregungswellenlänge zu erhalten.
5. Positionieren Sie das 20X-Objektiv (angezeigt durch 5 in Abbildung 5) manuell unter der Probe und drücken Sie die weiße Taste (6 in Abbildung 5) auf der linken Seite des Mikroskops, um das weiße Licht einzuschalten.
   1. Stellen Sie die Helligkeit ein, indem Sie den Knopf unter dem weißen Licht-Power-Regler drehen (7 in Abbildung 5).
6. Drücken Sie in der PHySpec-Software die Play-Taste (Video) im Farbkamerafenster, wodurch ein Live-Scan erstellt wird.
   1. Wenn im Farbkamerafenster ein schwarzes Bild angezeigt wird, erhöhen Sie die Belichtungszeit (2 in Abbildung 3) und/oder den Gain-Wert (3 in Abbildung 3), der sich im Bedienfeld des Instruments unter der Registerkarte Farbkamera befindet. Wenn das angezeigte Bild zu hell ist, verringern Sie die Belichtungszeit und/oder den Gain-Wert.
   2. Stellen Sie sicher, dass der Vorwärtsknopf auf der rechten Seite des Mikroskops (2 in Abbildung 5) auf R eingestellt ist, um 20 % des Signals an die Kamera/das Fernglas und 80 % des Signals an den Detektor zu senden.
7. Konzentrieren Sie sich auf die Stichprobe, indem Sie den Abstand zwischen dem Objektiv und der Stufe anpassen (Abbildung 4b). Dies geschieht durch Drehen der in Abbildung 4d dargestellten Knöpfe auf der rechten Seite des Mikroskops.
   HINWEIS: Der größere Knopf wird für grobe Einstellungen verwendet, während der kleinere Knopf für zartere und kleine Fokusänderungen ist.
8. Stellen Sie sicher, dass das manuell gewählte Ziel auch in der Software ausgewählt ist. Klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche Ansicht in der oberen Menüleiste, und klicken Sie dann auf eine Maßstabsleiste anzeigen/ausblenden, um die Maßstabsleiste auf dem Bild anzuzeigen (1 in Abbildung 3). Gehen Sie dann auf die Registerkarte Galvanometer im Befehlsbedienfeld und wählen Sie das verwendete Ziel aus (4 in Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die angezeigte Skalenleiste korrekt ist, indem Sie das richtige Ziel in der Software auswählen.
9. Wählen Sie in der Software den entsprechenden Detektor aus, indem Sie auf die Registerkarte Diverter (ProEM – 6 in Abbildung 3) und Gitterrosten gehen, indem Sie zum Tabfilter (1200 gr/mm bei ProEM – 7 in Abbildung 3) unter der Registerkarte SpectraPro SP-2300 gehen.
10. Öffnen Sie den Breitband-Lampenverschluss (12 in Abbildung 2), damit die UV-Erregung der Probe stattfinden kann. Drehen Sie den Intensitätsknopf (11 in Abbildung 2d) auf die gewünschte Position (z. B. 8 – Zwischenintensität), um die Intensität der Breitbandlampe (UV) Zustärke zu steuern.
    1. Um zwischen einer Breitenfeldbeleuchtung (offene Öffnung) oder einer kleineren Spotbeleuchtung (geschlossener Blende) zu wählen, steuern Sie die Größe der UV-Lampenfeldöffnung mit dem Stick und den Knöpfen, die in 4 in Abbildung 5dargestellt sind.
11. Wählen Sie unter der Registerkarte SpectraPro SP-2300 eine Wellenlänge aus, um die Probenemission zu beobachten.
12. Wenn die Emissionswellenlängen der Probe unbekannt sind, erfassen Sie ein Emissionsspektrum.
    1. Klicken Sie im Sequenzer auf das +-Zeichen, um eine neue Sequenz ("Knoten") für die Erfassung eines Emissionsspektrums hinzuzufügen.
       1. Klicken Sie auf Spektrometer und dann Spektrumerfassung (mit Spektralscan).
       2. Geben Sie eine Minimale Wellenlänge (d. h. 400 nm) und eine maximale Wellenlänge (d. h. 700 nm) ein und klicken Sie auf OK, um den Spektralbereich festzulegen, in dem das Spektrum aufgezeichnet wird.
       3. Wählen Sie die passende Belichtungszeit im linken Menü der Software aus. Wählen Sie kürzere Zeiten (z.B. 0,1 s) für sehr helle Proben und längere Zeiten (z.B. 2 s) für Dim-Emitter.
       4. Stellen Sie die Anregungsleistung bei der Anregung der Breitbandlampe (UV) ein (siehe Schritt 1.3 oben).
          HINWEIS: Im Falle einer NIR-Diodenerregung kann es über das Dropdown-Menü Neutraldichte auf der linken Seite der PHySpec-Software eingestellt werden.
    2. Klicken Sie auf den Sequenzer auf die Doppelabspiel-Schaltfläche, um die gesamte Sequenz auszuführen. Beachten Sie nach der Anzeige des Spektrums die Bereiche, die für den Nachweis der Probenemission von Interesse sind(z. B. 580 bis 640 nm bei Tb³⁺- und Eu³⁺-basierten Proben).
    3. Optimieren Sie bei Bedarf die Signalerkennung, indem Sie entweder den Fokus der Probe ändern oder die Belichtungszeit in der PHySpec-Software anpassen. Erzielen Sie eine weitere Optimierung der Signalerkennung durch die Erhöhung der Probenemissionsintensität durch Änderung der Leistung der Anregungsquelle (Breitbandlampe), wie oben beschrieben.
13. Passen Sie die Belichtungszeit (z. B. 0,5 s – 2 in Abbildung 3) und Gain (3 in Abbildung 3) der Farbkamera entsprechend an, um ein Bild in guter Qualität zu erhalten. Fügen Sie bei Bedarf die Maßstabsleiste zum Bild hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Maßstabsleiste anzeigen/ausblenden in der zweiten Zeile des Menüs oben im PHySpec-Softwarefenster klicken.
14. Empfehlung: Zeichnen Sie vor dem Erwerb des hyperspektralen Würfels ein helles optisches Mikroskopiebild des Kristalls unter weißem Licht auf (Abbildung 6a) und/oder UV-Voll (Abbildung 6b) oder eingeschränkt (Abbildung 6c) Beleuchtung (UV-Beleuchtung, gesteuert durch die Verschlussöffnung, dargestellt als 4 in Abbildung 5). Klicken Sie dazu mit dem Sample im Fokus auf den Wiedergabeknopf der Farbkamera.
15. Klicken Sie auf Datei und dann Fensteransicht exportieren, wählen Sie das gewünschte Format aus, um das erhaltene Bild zu exportieren, und speichern Sie die Datei mit der gewünschten Erweiterung (.h5, . JPEG).
16. Bevor Sie das hyperspektrale Bild erfassen, schalten Sie die weiße Lichtbeleuchtung sowie das Raumlicht aus.
17. Um den hyperspektralen Cube zu erhalten, schreiben Sie eine neue Sequenz. Klicken Sie daher im Sequenzer auf das +-Zeichen, um einen neuen Knoten hinzuzufügen.
    1. Klicken Sie auf Confocal Imager.
       1. Klicken Sie auf Multi-Spectrum Acquisition. Hier wird das gewünschte Sichtfeld durch die Anzahl der Punkte definiert, die in x- und y-Richtung erfasst werden sollen, und die Schrittgröße. Verwenden Sie z. B. 100 Punkte in x und 100 Punkte in y mit einer Schrittgröße von 5 m, um ein Bild von 500 x 500 m zu erhalten.
          Hinweis: Die Gesamtzahl der Erfassungspunkte und die Integrationszeit an jedem Punkt wirken sich direkt auf die Gesamterfassungszeit des Hyperspektralcubes aus.
          1. Geben Sie die gewünschte X-Position (z.B. 100) und Y-Position (z.B. 100) sowie die gewünschte Schrittgröße (z.B. 5 m) ein. Wählen Sie die Option Hardware für die Kamerasynchronisierung für die sichtbare Emissionszuordnung (und Softwareoption im Falle der NIR-Erkennung). Klicken Sie auf OK.
18. Klicken Sie im Sequenzer auf die neu hinzugefügte Multi-Spectrum-Erfassungszeile, um den Knoten hervorzuheben.
19. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um den ausgewählten Knoten auszuführen.
    HINWEIS: Die verbleibende Zeit, die die Erfassung in Anspruch nimmt, wird neben dem Knoten angezeigt (in Minuten, z. B. 28 min).
20. Speichern Sie den Hyperspektralwürfel im entsprechenden Dateiformat (.h5).

3. Hyperspektrale Datenanalyse

1. Direkt nach der Erfassung, wenn der gespeicherte hyperspektrale Würfel nicht automatisch in der Software geöffnet wird, stellen Sie den hyperspektralen Würfel wieder her, der als .h5-Datei gespeichert wurde, indem Sie in der oberen Menüleiste auf Datei klicken und dann den Cursor bewegen und auf Datei öffnen klicken.... Wenn das Fenster mit dem Titel Daten auswählen erscheint, wählen Sie den Ordner aus, in dem die .h5-Datei gespeichert ist, und klicken Sie auf die Datei, um sie zu öffnen.
2. Nachdem die hyperspektrale Würfeldatei importiert wurde, ändern Sie das angezeigte hyperspektrale Würfelbild, um die Intensität einer bestimmten Spektralwellenlänge anzuzeigen, indem Sie den Balken auf der Oberseite des Würfelbildes nach links (untere Wellenlänge, z. B. 580 nm) oder rechts (höhere Wellenlänge, z. B. 638 nm) bewegen.
   HINWEIS: Die ausgewählte Wellenlänge wird auf der linken Seite dieses oberen Balkens angezeigt (1 in Abbildung 7).
3. Nach der Wahl der Wellenlänge von Interesse für die Analyse(z.B.die maximale Intensität, die im Fall von [TbEu(bpm)(tfaa)₆] 613.26 nm beträgt), machen Sie eine (oder alle) der drei möglichen Arten der Spektralanalyse: (A) die Spektralverteilung in Form eines Bildes (2 in Abbildung 7); (B) ein Emissionsintensitätsprofil in einer Interessenregion (3 in Abbildung 7); (C) Extraktion eines Spektrums an einem bestimmten Punkt oder einer bestimmten Interessenregion (4 in Abbildung 7).
   1. Im Falle der Spektralverteilung von einem Bild verwenden Sie die Crop- und Bin-Funktion, um das Signal-Rausch-Verhältnis im Bild zu erhöhen. Um dies zu tun, klicken Sie im oberen Menü Verarbeitung dann wählen Sie Daten und dann die Option Zuschneiden und Bin.
   2. Für ein Emissionsintensitätsprofil klicken Sie auf dem Cubebild mit der rechten Maustaste auf das Profil Ziel erstellen oder X erstellen oder Y erstellen, je nachdem, ob nur ein Punkt (Ziel - 5 und 6 in Abbildung 7) oder eine Linie (Profil - 7 und 8 in Abbildung 7) analysiert werden muss. Wählen Sie den Analysebereich aus, indem Sie das Ziel, das horizontale oder das vertikale Linienprofil mit dem Cursor ziehen und über den Cube bewegen.
      1. Nachdem das Profil ordnungsgemäß ausgewählt wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Region, und wählen Sie das Ziel zu Diagramm hinzufügenaus. Wählen Sie die Option zum Erstellen eines neuen Diagramms, um die Emissionsintensität(y-Achse) als Funktion der physikalischen Position des Ziels(x-Achse) anzuzeigen. Das Spektrum wird auf dem neuen Diagramm angezeigt, das eingefügt wurde (6 und 7 in Abbildung 7).
         HINWEIS: Es können mehrere Ziele erstellt werden, die als unterschiedliche farbige Emissionsprofile angezeigt werden (5 und 6 in Abbildung 7).
   3. Alternativ können Sie ein Emissionsspektrum eines bestimmten Bereichs der Probe erhalten (9 in Abbildung 7). Bewegen Sie zunächst den Mauszeiger über das Cubebild, und klicken Sie mit der rechten Maustaste. Klicken Sie auf die Optionen Rechteckauswahl oder Ellipsenauswahl auf der Registerkarte, die angezeigt wird.
      1. Zeichnen Sie die Auswahlform (z. B. ein Rechteck) über den gewünschten Bereich, indem Sie auf den Cursor klicken und über den Würfel ziehen. Nachdem der Bereich ordnungsgemäß ausgewählt wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Region, und wählen Sie die Option Auswahl zu Diagramm hinzufügenaus.
      2. Wählen Sie im angezeigten Fenster Zum Diagrammhinzufügen aus, um die Emissionsspektren des Ziels anzuzeigen, und klicken Sie auf OK.
         ANMERKUNG: In der Grafik, in der die Zielemission angezeigt wird, wird eine neue farbige Linie (8 in Abbildung 7)angezeigt, wobei die Emissionsintensität als y-Achse und die Wellenlänge an der x-Achse angezeigt werden. Dieses Spektrum entspricht der gemittelten Intensität des ausgewählten Bereichs für jede Wellenlänge.
4. Nachdem das Spektrum abgerufen wurde, speichern Sie es, bevor Sie eine neue Region auswählen, da jeweils nur eine Region ausgewählt werden kann. Wählen Sie dazu das Fenster aus, in dem sich das Diagramm befindet. Wählen Sie im Menü Datei die Option Speichern unter aus, und wählen Sie aus, ob Sie das Diagramm im Ordner der Wahl speichern möchten, indem Sie den Namen der Wahl verwenden, entweder im .h5-Format, das in der PHySpec-Software geöffnet werden kann, oder im .csv-Format, das in Excel importiert werden kann.

Ergebnisse

Zur Veranschaulichung der Konfiguration des Hyperspektralmikroskops für die Datenerfassung auf einem Ln-basierten, molekularen Einzelkristall (d.h. [TbEu(bpm)(tfaa)₆], Abbildung 1azeigt Abbildung 2 einen Überblick über das System sowie die richtige Platzierung der optischen Würfel im Setup. Abbildung 3 zeigt einen Screenshot der PHySpec-Software mit den Menüs, die während der HSI-Erfassung verwendet wurden.

Diskussion

Das hier beschriebene hyperspektrale Bildgebungsprotokoll bietet einen einfachen Ansatz, der es ermöglicht, spektroskopische Informationen an genauen Stellen der Probe zu erhalten. Mit dem beschriebenen Setup kann die räumliche Auflösung(x- und y-Mapping) bis zu 0,5 m erreichen, während die Spektralauflösung für die Zuordnung im sichtbaren Bereich 0,2 nm und für den NIR-Bereich 0,6 nm betragen kann.

Um eine hyperspektrale Kartierung auf einem einzelnen Kristall durchzu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number