使用滑动运动蛋白运动度测定法制造多组分脂质纳米管网络

摘要

该协议描述了使用滑动运动蛋白运动与巨型单层脂质囊泡一起制造脂质纳米管网络的过程。

摘要

脂质纳米管（LNT）网络代表了一种体外模型系统，用于研究分子转运和脂质生物物理学，与真核细胞中发现的无处不在的脂质小管相关。然而，体内LNT是高度非平衡的结构，需要组装，维护和重组化学能和分子马达。此外，体内LNT的组成是复杂的，包括多种不同的脂质物质。挤出LNT的典型方法是时间和劳动密集型的，它们需要光学镊子，微珠和微量移液器从巨大的脂质囊泡中强行拉出纳米管。这里介绍的是滑动运动性测定（GMA）的方案，其中使用运动蛋白驱动的微管运动从巨大的单层囊泡（GUV）中快速产生大规模的LNT网络。使用这种方法，LNT网络由各种模仿生物LNT复杂性的脂质制剂形成，使其在脂质生物物理学和膜相关转运的体外研究中越来越有用。此外，该方法能够使用常用的实验室设备在短时间内（<30分钟）可靠地产生LNT网络。LNT网络特征（如长度、宽度和脂质分区）也可通过改变用于制造网络的GUV的脂质组成来调整。

引言

脂质纳米管（LNT）网络的制备对于非平衡脂质结构的体外检查^{越来越感兴趣1，2，3}。细胞使用脂质小管进行蛋白质⁴ 和核酸⁵ 的扩散转运以及细胞间通讯^6，7。内质网和高尔基体特别有趣，因为这些膜结合的细胞器是脂质和蛋白质合成以及这些整体生物分子在细胞^质8，9内运输的主要位置。这些细胞器的膜由多种脂质物质组成，包括鞘脂，胆固醇和磷脂¹⁰ ，最终有助于定义其功能。因此，为了更密切地复制和研究这些细胞器，体外LNT必须由具有日益复杂的脂质制剂¹¹的囊泡制造。

巨型单层囊泡（GUV）广泛用于研究脂质膜行为，因为它们可以与复杂的制剂可靠地合成，包括胆固醇，磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）^12，13。这里描述的是一种使用滑动运动度测定（GMA）从具有不同脂质配方的GUV制造LNT的方法，其中LNT基于作用于GUV的驱动蛋白马达和微管细丝所进行的工作进行挤出。在该系统中，吸附在表面的驱动蛋白推动生物素化的微管，将来自ATP水解的化学能转化为有用的功（特别是从生物素化囊泡中挤出LNT）¹¹。由此产生的LNT网络提供了一个模型平台，用于研究脂质相差异对LNT形态变化的影响。

简而言之，将驱动蛋白运动蛋白在含有酪蛋白的溶液中引入流动室，这使得电机能够吸附到腔室的玻璃表面上。接下来，含有ATP的溶液中的生物素化微管流过腔室并使其与驱动蛋白马达结合并开始运动。然后将链霉亲和素溶液引入腔室并使其与微管非共价结合。最后，将含有生物素化脂质的GUV引入腔室并与链霉亲和素包被的微管结合，然后在15-30分钟内挤出LNT以形成大规模网络。该方法使用标准实验室设备和试剂以低成本生产大型分支LNT网络¹¹。

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研究方案

1. 储备微管溶液的制备

注意:在整个实验方案中应始终佩戴安全护目镜、手套和实验室外套。

1. 准备5x BRB80缓冲液:将24.19克烟斗（哌嗪-N，N′-双[2-乙烷磺酸]）和0.38克EGTA（乙二醇-双[β-氨基乙基醚]-N，N，N′，N′-四乙酸）加入1升玻璃瓶中。加入1毫升1MMgCl₂ ，并用KOH将pH调节至6.9。加入去离子水，使溶液达到500 mL终体积。
2. 准备100 mM GTP溶液储备:称取52mg GTP并悬浮在1 mL蒸馏水中。将100 mM溶液分成20μL等分试样并储存在-20°C。
3. 制备GPEM溶液:混合200微升5x BRB80，10微升100 mM GTP溶液，100微升100%甘油和600微升去离子水。将GPEM溶液分成100μL等分试样，储存在-20°C。
4. 通过在冷（4°C）GPEM溶液中重建市售的冻干微管蛋白（每个小瓶生物素化，荧光标记和未标记）以5mg / mL的储备浓度来制备微管溶液。
5. 通过混合4μL生物素化微管蛋白，4μL荧光标记的微管蛋白和24μL未标记的微管蛋白（均以5mg / mL浓度）进行微管聚合，以在32mL的最终体积下产生1:1:6的比例。将其放在冰上。将微管蛋白混合物分成2μL等分试样，并储存在-80°C直至需要。
   注意:高效聚合要求微管蛋白的浓度等于或高于临界浓度（5 mg/mL）¹⁴。在这里，微管蛋白比例的选择经过优化，以达到足够浓度的生物素化微管蛋白，以有效地结合链霉亲和GUV，以及足够浓度的荧光微管蛋白以进行微观表征。

2. 巨型单层囊泡（GUV）的制备

1. 琼脂糖薄膜制备
   注意:该协议改编自Greene等人¹⁵。
   1. 通过将1g琼脂糖与100 mL去离子水在250 mL锥形瓶中混合来制备1%w / v溶液。使用标准微波加热琼脂糖溶液1-2分钟。
      注意:一旦琼脂糖完全溶解，溶液将变得半透明。使用前让溶液冷却至65-75°C。
   2. 使用切开的 1，000 μL 移液器吸头将 300–400 μL 琼脂糖溶液移液到 25 mm x 25 mm 玻璃盖玻片上。在用戴手套的手指握住盖玻片边缘的同时，使用另一个1，000μL移液器吸头将融化的琼脂糖均匀地铺在盖玻片上。
      注意:将琼脂糖保持在65-75°C将允许在盖玻片表面上有效铺展。
   3. 将琼脂糖包被的盖玻片在37°C培养箱中干燥至少2小时，此时琼脂糖将变得透明。通过在室温（RT）下将琼脂糖涂层表面朝上放置在干净的表面上（例如无绒纸或蜡基薄膜）上来存储盖玻片。
2. 脂质制剂
   1. 从-20°C冰箱中取出溶解在氯仿中的脂质，并将其置于化学通风橱中，直到它们到达室温。
   2. 使用以下公式计算配方所需的每种组分脂质的脂质储备体积:
      
      其中: V_脂质 是要使用的脂质体积， mol %是脂质组分的摩尔百分比， n 是制剂中使用的脂质的摩尔总数， M 是以摩尔单位为单位的脂质浓度。
      注意:例如，如果使用含有45摩尔%1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）的制剂，储备溶液浓度为12.72 mM，配方中总脂质为1微摩尔，则配方中使用的DOPC储液体积将为:
      
   3. 将脂质以计算的比例在化学通风橱的玻璃小瓶中混合在一起。
   4. 将30μL脂质溶液移液到琼脂糖包被盖玻片上的预热热板上，该热板设置在制剂的饱和脂质组分的熔点以上（例如，50°C热板用于 T_m 为40°C的脂质）。
   5. 使用18G针的长边以圆周运动将溶液铺展在琼脂糖膜上，直到氯仿蒸发并形成均匀的脂质层。在执行此步骤时，用戴手套的手指握住盖玻片的边缘。
      注意:应注意不要用针头损坏琼脂糖层。
   6. 将带有琼脂糖层和脂质膜的盖玻片置于铝箔覆盖的培养皿中，薄膜面朝上，然后将培养皿置于真空干燥器中至少2小时以除去残留溶剂。
3. 同时，通过将1.92g蔗糖与10mL去离子水混合来制备560 mM蔗糖溶液。
   注意:蔗糖溶液的浓度取决于将GUV稀释的缓冲液的渗透压。通常，蔗糖溶液的渗透压不应大于GUV将稀释的缓冲液的10%，特别是运动缓冲液（参见步骤3.11）。
4. 古夫形成
   1. 通过将粘合室轻轻地压在脂质涂层的盖玻片上，将粘合室粘附在涂有脂质膜的盖玻片上，使脂质膜朝上，确保形成紧密的密封。
   2. 向腔室中加入400μL560mM蔗糖溶液（在步骤2.3中制备）。
   3. 将盖玻片放入湿度室并合上盖子。
   4. 将湿度室放在预先加热的热板上，该热板设置在配方的饱和脂质组分的熔点以上。
   5. 让囊泡形成≥1小时才能恢复。
      注意:可以使用40倍空气物镜的荧光显微镜检查囊泡的形成。

3. 活性测定原液和试剂的制备

1. 酪蛋白原料的制备
   1. 向50 mL锥形离心管中加入3g干酪蛋白，然后加入30 mL 1x BRB80并旋转直至溶液变得粘稠。将管子以15，000 x g 离心30分钟。
   2. 将上清液转移到另一个50 mL锥形离心管中并丢弃沉淀。通过1μm注射器过滤器过滤溶液，将溶液收集在50mL锥形小瓶中。通过0.2μm过滤器过滤溶液，将溶液收集在50mL锥形小瓶中。
   3. 通过使用紫外可见分光光度计和石英比色皿测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。
   4. 使用以下公式计算以mg / mL为单位的酪蛋白浓度:
      
   5. 在1x BRB80中将溶液稀释至20mg / mL，分成100μL等分试样，并储存在-20°C。
2. 通过将2mg葡萄糖氧化酶与1mL的1x BRB80混合来制备葡萄糖氧化酶（2mg / mL）储备溶液。分成100μL等分试样并储存在-20°C。
3. 通过将0.8mg过氧化氢酶与1mL的1x BRB80混合来制备过氧化氢酶（0.8mg / mL）储备溶液。分成100μL等分试样并储存在-20°C。
4. 通过将0.3g D-葡萄糖悬浮在1mL去离子水中来制备2M葡萄糖溶液。分成100μL等分试样并储存在-20°C。
5. 通过将0.015g DTT悬浮在1 mL去离子水中来制备100 mM DTT储备。分成100μL等分试样并储存在-20°C。
6. 通过将0.055g二钠ATP悬浮在1 mL 100 mM MgCl₂溶液中来制备100 mM Mg-ATP储备。分成100μL等分试样并储存在-20°C。
7. 通过将0.055g AMP-PNP悬浮在1mL 100mMMgCl₂溶液中来制备100mMMg-AMP-PNP溶液，然后分成100μL等分试样并储存在-20°C。
8. 通过将25.03mg特罗洛克斯加入1mL甲醇中制备100mM特罗洛克斯溶液，并储存在-20°C。
9. 通过将1mg链霉亲和素加入100μL BRB80中制备10mg / mL链霉亲和素溶液，然后分成2μL等分试样并储存在-80ۛ°C。
10. 通过混合200微升5x BRB80，20微升酪蛋白溶液，10微升MgATP溶液，10微升特罗洛克斯，5微升紫杉醇溶液和765微升去离子水来制备BRB90CAT。储存在4°C。
11. 通过混合192μL BRB80CAT，2μLD-葡萄糖溶液，2μL葡萄糖氧化酶溶液，2μLDTT溶液和2μL过氧化氢酶溶液来制备运动溶液。储存在4°C。
12. 通过在 BRB80CAT 中稀释储备的驱动蛋白溶液（例如，在 98 μL BRB80CAT 中稀释 2 μL 50 mM 驱动蛋白溶液）来制备 1 μM 驱动蛋白溶液，并在 4 °C 下储存。
13. 通过在90μL室温BRB80CAT中稀释10μL稳定的微管来制备10μg/ mL微管溶液。在 RT 存储。
14. 通过在99.9μL运动溶液中加入0.1μL10mg / mL链霉亲和素溶液来制备10μg/ mL链霉亲和素溶液。储存在4°C。
15. 通过将5μLGUV储备液稀释到55μL运动溶液中来制备12x GUV溶液。储存在4°C。
16. 微管蛋白聚合成微管
    1. 从-80°C冰箱（在步骤1.5中制备）中收集先前制备的2μL等分试样微管蛋白，并放入37°C水浴中30分钟。
    2. 通过在1mL无水DMSO中加入1.71mg紫杉醇来制备2mM紫杉醇溶液，分成10μL等分试样，并储存在-20°C。
    3. 通过将99.5微升1x BRB80与0.5微升2mM紫杉醇混合来新鲜制备BRB80T。 在水浴中将100μL BRB80T加热至37°C。
    4. 30分钟后，将100μL BRB80T加入微管蛋白等分试样中以稳定微管。在 RT 存储。

4. 滑动运动度测定

1. 通过将两条间隔5毫米的双面胶带贴在载玻片上来准备流动室。重复此过程，直到每条带包含三层胶带。
2. 将盖玻片放在胶带顶部，然后用镊子或笔轻轻按下盖玻片/胶带接口，以确保足够的附着力。
   注:通道的宽度应为 5 mm，长度应为 25 mm，高度应为 300 mm。
3. 将30μL1mm驱动蛋白溶液（在步骤3.12中制备）移入流动池中并使其孵育5分钟。
   注意:酪蛋白在盖玻片/载玻片的表面上形成双层，并促进驱动蛋白尾部附着在表面上。
4. 将30 μL的10 μg/mL微管溶液（在步骤3.13中制备）移入流动池中，使用实验室擦拭轻轻压在流道的另一端以促进溶液交换。孵育5分钟。
5. 在室温下用1x运动溶液洗涤流动池1x-3x（在步骤3.11中制备）。
   注意:此时可以使用使用40倍空气物镜的荧光显微镜来确认微管附着和运动。微管表现为荧光灯丝（长度为数十微米）以〜0.5μm / s的速度在表面上移动（滑动）（图1）。
6. 将30μL的10μg/mL链霉亲和素溶液（在步骤3.14中制备）移入流动池中，使用实验室擦拭轻轻压在流道的另一端以促进溶液交换。孵育10分钟。
7. 将30μL12x GUV溶液（在步骤3.15中制备）流入流中，使用实验室擦拭轻轻压在流道的另一端以促进溶液交换。孵育30分钟。
8. 加入2μL100mM AMP-PNP溶液（在步骤3.7中制备）以停止运动，然后用密封剂密封腔室。

5. 液态转换网络表征

1. 将流动室转移到倒置显微镜进行成像。
2. 根据所使用的荧光脂质或微管蛋白的波长选择合适的滤光片组。例如，使用德克萨斯红标脂质时，请使用 560 nm/25 nm 激发滤光片和 607 nm/36 nm 发射滤光片。
3. 使用100倍油物镜聚焦在盖玻片表面。
4. 使用荧光显微镜对LNT网络进行成像。
   注意:LNT是从较大的囊泡挤出的线性结构。LNT比GUV小得多，荧光信号较弱。因此，必须根据图像LNT相应地调整曝光和对比度。这些调整也会导致GUV的过度曝光，因此，建议独立表征GUV中的层状性和相分离。
5. 将显微镜聚焦在感兴趣的网络上，并拍摄标准或平铺图像。
6. 调整曝光时间和中性密度滤光片以对 LNT 进行成像，并最大限度地减少 GUV 的饱和曝光。采集红色和绿色通道中的图像。
   注意:在这里，红色通道允许德克萨斯红脂质的可视化，而绿色通道允许微管的可视化（例如，俄勒冈绿脂质和HiLyte488染料）。
7. 通过叠加红色和绿色通道来创建复合图像（图1）。
8. 通过测量低空比分光长度来表征低空同温网络
   1. 使用图像分析软件（如 ImageJ）打开采集的图像。
   2. 使用设置比例功能校准显微镜的比例，将像素填充为 mm 转换因子，然后单击 确定。
      注意:转换因子取决于显微镜，物镜和相机，可以使用显微镜校准载玻片获得。它通常以像素/毫米表示。
   3. 使用 多点线工具 测量从母体GUV开始的纳米管的长度。按住 Ctrl +M 测量长度。
   4. 按照上述步骤继续测量各个管子的长度。图像处理工具会将每个新测量结果保存在结果窗口中。
   5. 绘制每条线后按住 Ctrl + D 以跟踪已测量的管子。
9. 测量 LNT 厚度（图 2）
   1. 在 ImageJ 中打开图像，然后选择"图像"选项卡下的"阈值"功能。
   2. 单击 应用 以应用阈值。
   3. 在所需管子上绘制一个已知长度的矩形（黑色像素的值为 0，红色像素的值为 255）。
   4. 测量区域的综合密度。
   5. 将密度除以 LNT 的长度（以像素为单位）以获得厚度（以像素为单位）。
      注意:只有当成像设置和阈值设置相同时，才能跨图像比较厚度测量值。
10. 确定 LNT 节点中的脂质分区（图 3）
    1. 在图像J中打开图像。
    2. 使用" 线 "工具在所需节点上绘制一条线。
    3. 测量俄勒冈绿通道和德州红通道中的节点强度。
    4. 将线移动到 LNT 并测量俄勒冈绿和德克萨斯红通道中的 LNT 强度。

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结果

LNT网络（图4）是使用所述协议制造的，该协议使用微管的驱动蛋白转运所执行的工作来挤出GUV中的LNT。简而言之，使用蔗糖溶液使用琼脂糖凝胶再水合制备了GUV，并在GPEM溶液中聚合微管并在BRB80T中稳定。接下来，将驱动蛋白电机引入流通池中，在盖玻片表面形成一层有源电机。然后引入微管并加入链霉亲和素溶液，这促进了生物素化脂质和GUV（随后引入）之间的结合。

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讨论

LNT网络是体外研究膜性质和生物分子（如跨膜蛋白）转运的有用工具。此外，使用复杂的脂质制剂来制造LNT网络可以进行更多生物学相关的研究。其他制备研究已经使用了1）简单的脂质制剂和多层囊泡或2）更繁琐的运动技术来制造由复杂脂质制剂组成的GUV的网络。这里描述的方法能够使用廉价的试剂和设备，从复杂的脂质制剂和GUV中有效地制备大规模LNT网络。因此，该方法提供了研究一系列生?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective	Olympus	1-U2B836	Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter	Olympus		Neutral Density Filter
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein	Sigma-Aldrich	22090	Casein hydrolysate for microbiology
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322	Catalase from Bovine Liver
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306	Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol	Avanti	700000P	cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin	Avanti	870282C	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC	Avanti	850355P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin	Avanti	870285P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G6125	Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol	Fisher	G33	Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope	Olympus	N/A	IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M1028	1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE	Invitrogen	O12650	Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel	ThermoFisher	P3456	Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin	Cytoskeleton	T333P	Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488	Cytoskeleton	TL488M	Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled	Cytoskeleton	T240	Tubulin protein porcine brain