Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung der Gleitkinesin-Motilität in Verbindung mit riesigen unilamellären Lipidvesikeln.

Zusammenfassung

Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerke (LNT) stellen ein In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Transports und der Lipidbiophysik dar, das für die ubiquitären Lipidtubuli in eukaryotischen Zellen relevant ist. In-vivo-LNTs sind jedoch stark ungleichgewichtsgleiche Strukturen, die chemische Energie und molekulare Motoren erfordern, um zusammengesetzt, aufrechterhalten und reorganisiert zu werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung von in vivo LNTs komplex und besteht aus mehreren verschiedenen Lipidspezies. Typische Methoden zum Extrudieren von LNTs sind sowohl zeit- als auch arbeitsintensiv und erfordern optische Pinzetten, Mikroperlen und Mikropipetten, um Nanoröhrchen gewaltsam aus riesigen Lipidvesikeln zu ziehen. Hier wird ein Protokoll für den Gleitmotilitätsassay (GMA) vorgestellt, bei dem großflächige LNT-Netzwerke schnell aus riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) unter Verwendung von Kinesin-betriebener Mikrotubuli-Motilität erzeugt werden. Mit dieser Methode werden LNT-Netzwerke aus einer Vielzahl von Lipidformulierungen gebildet, die die Komplexität biologischer LNTs nachahmen, was sie für In-vitro-Studien der Lipidbiophysik und des membranassoziierten Transports immer nützlicher macht. Darüber hinaus ist diese Methode in der Lage, LNT-Netzwerke in kurzer Zeit (<30 min) mit gängigen Laborgeräten zuverlässig herzustellen. LNT-Netzwerkeigenschaften wie Länge, Breite und Lipidpartitionierung sind ebenfalls abstimmbar, indem die Lipidzusammensetzung der GUVs, die für die Herstellung der Netzwerke verwendet werden, geändert wird.

Einleitung

Die Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken (LNT) ist von zunehmendem Interesse für die In-vitro-Untersuchung von Nichtgleichgewichtslipidstrukturen ^1,2,3. Zellen verwenden Lipidtubuli für den diffusiven Transport der Proteine⁴ und Nukleinsäuren⁵ sowie für die Zell-zu-Zell-Kommunikation ^6,7. Das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat sind besonders interessant, da diese membrangebundenen Organellen die primären Orte für die Lipid- und Proteinsynthese sowie den Transport dieser integralen Biomoleküle innerhalb des Zytoplasmas einer Zelle^{sind 8,9}. Die Membranen dieser Organellen bestehen aus mehreren Lipidspezies, einschließlich Sphingolipiden, Cholesterin und Phospholipiden¹⁰, die letztendlich dazu beitragen, ihre Funktionalität zu definieren. Um diese Organellen genauer zu replizieren und zu untersuchen, müssen daher in vitro LNTs aus Vesikeln mit immer komplexeren Lipidformulierungen hergestellt werden¹¹.

Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) werden häufig zur Untersuchung des Lipidmembranverhaltens verwendet, da sie zuverlässig mit komplexen Formulierungen synthetisiert werden können, die Cholesterin, Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylinositol (PI) ^12,13 enthalten. Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Herstellung von LNTs aus GUVs mit unterschiedlichen Lipidformulierungen unter Verwendung des Gleitmotilitätsassays (GMA), bei dem LNTs auf der Grundlage der Arbeit von Kinesin-Motoren und Mikrotubuli-Filamenten, die auf GUVs wirken, extrudiert werden. In diesem System treiben Kinesin-Motorproteine, die an einer Oberfläche adsorbiert werden, biotinylierte Mikrotubuli an und wandeln chemische Energie aus der Hydrolyse von ATP in nützliche Arbeit um (insbesondere die Extrusion von LNTs aus biotinylierten Vesikeln)¹¹. Das resultierende LNT-Netzwerk bietet eine Modellplattform, um die Auswirkungen der Unterschiede in den Lipidphasen auf Veränderungen in der LNT-Morphologie zu untersuchen.

Kurz gesagt, Kinesin-Motorproteine werden in einer caseinhaltigen Lösung in eine Strömungskammer eingebracht, die die Adsorption der Motoren auf die Glasoberfläche der Kammer ermöglicht. Als nächstes fließen biotinylierte Mikrotubuli in einer ATP-haltigen Lösung durch die Kammer und dürfen an die Kinesin-Motoren binden und die Motilität beginnen. Eine Streptavidinlösung wird dann in die Kammer eingeführt und lässt nicht-kovalent an die Mikrotubuli binden. Schließlich werden GUVs, die ein biotinyliertes Lipid enthalten, in die Kammer eingeführt und binden an die Streptavidin-beschichteten Mikrotubuli, extrudieren dann LNTs, um im Laufe von 15-30 min großräumige Netzwerke zu bilden. Diese Methode erzeugt große, verzweigte LNT-Netzwerke unter Verwendung von Standardlaborgeräten und Reagenzien zu niedrigen Kosten¹¹.

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Protokoll

1. Herstellung von Stamm-Mikrotubuli-Lösungen

ACHTUNG: Schutzbrille, Handschuhe und ein Laborkittel sollten während des gesamten Protokolls immer getragen werden.

1. 5x BRB80-Puffer vorbereiten: 24,19 g PIPES (Piperazin-N,N′-bis[2-Ethansulfonsäure]) und 0,38 g EGTA (Ethylenglykol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure) in eine 1 L Glasflasche geben. Fügen Sie 1 ml 1 M MgCl₂ hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 6,9 ein. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um die Lösung auf ein Endvolumen von 500 ml zu bringen.
2. Bereiten Sie 100 mM Vorrat an GTP-Lösung vor: Wiegen Sie 52 mg GTP und suspendieren Sie in 1 ml destilliertem Wasser. 100 mM Lösung in 20 μL Aliquots teilen und bei -20 °C lagern.
3. Bereiten Sie die GPEM-Lösung vor: Mischen Sie 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-Lösung, 100 μL 100% Glycerin und 600 μL deionisiertes Wasser. GPEM-Lösung in 100 μL Aliquots teilen und bei -20 °C lagern.
4. Herstellen einer Mikrotubulilösung durch Rekonstitution von Durchstechflaschen mit handelsüblichem, lyophilisiertem Tubulin (je eine Durchstechflasche mit biotinyliertem, fluoreszierend markiert und unmarkiert) in kalter (4 °C) GPEM-Lösung auf eine Stammkonzentration von 5 mg/ml.
5. Führen Sie eine Mikrotubulipolymerisation durch, indem Sie 4 μL biotinyliertes Tubulin, 4 μL fluoreszenzmarkiertes Tubulin und 24 μL unmarkiertes Tubulin (alle bei 5 mg/ml-Konzentrationen) mischen, um ein Verhältnis von 1:1:6 bei einem Endvolumen von 32 ml zu erhalten. Halten Sie es auf Eis. Das Tubulingemisch in 2 μL Aliquots teilen und bei -80 °C lagern, bis es benötigt wird.
   HINWEIS: Eine effiziente Polymerisation erfordert, dass die Tubulinkonzentration gleich oder höher als die kritische Konzentration (5 mg/ml)¹⁴ ist. Hier wird die Auswahl des Tubulinverhältnisses für eine ausreichende Konzentration von biotinyliertem Tubulin optimiert, um Streptavidin und GUVs effizient zu binden, sowie eine ausreichende Konzentration an fluoreszierendem Tubulin für die mikroskopische Charakterisierung.

2. Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

1. Agarose-Filmvorbereitung
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Greene et ^al.15 übernommen.
   1. Bereiten Sie eine 1% ige w/v-Lösung vor, indem Sie 1 g Agarose in 100 ml entionisiertem Wasser in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mischen. Verwenden Sie eine Standardmikrowelle, um die Agaroselösung für 1–2 min zu erhitzen.
      HINWEIS: Die Lösung wird durchscheinend, sobald die Agarose vollständig aufgelöst ist. Lassen Sie die Lösung vor Gebrauch auf 65–75 °C abkühlen.
   2. Verwenden Sie eine geschnittene 1.000 μL Pipettenspitze, um 300–400 μL Agaroselösung auf ein 25 mm x 25 mm großes Glasdeckglas zu pipettieren. Während Sie den Rand des Deckglases mit behandschuhten Fingern halten, verwenden Sie eine weitere 1.000 μL Pipettenspitze, um die geschmolzene Agarose gleichmäßig über das Deckglas zu verteilen.
      HINWEIS: Die Beibehaltung der Agarose bei 65–75 °C ermöglicht eine effiziente Verteilung auf der Deckglasoberfläche.
   3. Trocknen Sie die mit Agarose beschichteten Deckgläser in einem 37 °C Inkubator für mindestens 2 h, woraufhin die Agarose transparent wird. Lagern Sie die Deckgläser, indem Sie die mit Agarose beschichtete Oberfläche nach oben auf eine saubere Oberfläche wie fusselfreies Papier oder Wachsfolie bei Raumtemperatur (RT) legen.
2. Lipidformulierung
   1. In Chloroform gelöste Lipide aus einem Gefrierschrank von -20 °C entnehmen und in einen chemischen Rauch geben, bis sie RT erreichen.
   2. Berechnen Sie das Volumen des Lipidbestands jeder Komponente Lipid, die für die Formulierung benötigt wird, unter Verwendung der folgenden Formel:
      
      Dabei gilt: _V-Lipid ist das zu verwendende Lipidvolumen, mol % ist der molare Prozentsatz der Lipidkomponente, n ist die Gesamtzahl der Mol Lipid, die in der Formulierung verwendet werden, und M ist die Konzentration des Lipids in molaren Einheiten.
      HINWEIS: Wenn beispielsweise eine Formulierung verwendet wird, die 45 Mol-% 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) mit einer Stammlösungskonzentration von 12,72 mM und 1 Mikromol Gesamtlipiden in der Formulierung enthält, wäre das Volumen des in der Formulierung verwendeten DOPC-Stammes:
      
   3. Mischen Sie die Lipide im berechneten Verhältnis in einem Glasfläschchen im chemischen Abzug.
   4. Pipette 30 μL Lipidlösung auf die mit Agarose_{beschichteten} Deckgläser auf einer vorgewärmten Heizplatte, die über dem Schmelzpunkt der gesättigten Lipidkomponente der Formulierung eingestellt ist (z. B. 50 °C Heizplatte für ein Lipid mit T m von 40 °C).
   5. Verteilen Sie die Lösung über den Agarosefilm in einer kreisförmigen Bewegung mit dem langen Rand einer 18-G-Nadel, bis das Chloroform verdampft ist und sich eine gleichmäßige Lipidschicht gebildet hat. Halten Sie den Rand des Deckglases mit behandschuhten Fingern, während Sie diesen Schritt ausführen.
      HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass die Agaroseschicht nicht mit der Nadel beschädigt wird.
   6. Legen Sie das Deckglas mit Agaroseschicht und Lipidfilm in eine mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale, die Folienseite nach oben zeigt, und legen Sie die Petrischale mindestens 2 Stunden lang in einen Vakuum-Exsikkator, um das Restlösungsmittel zu entfernen.
3. In der Zwischenzeit stellen Sie 560 mM Saccharoselösung bereit, indem Sie 1,92 g Saccharose mit 10 ml entionisiertem Wasser mischen.
   HINWEIS: Die Konzentration der Saccharoselösung hängt von der Osmolarität des Puffers ab, in dem GUVs verdünnt werden. Typischerweise sollte die Osmolarität der Saccharoselösung nicht mehr als 10 % größer sein als der Puffer, in dem die GUVs verdünnt werden, insbesondere der Motilitätspuffer (siehe Schritt 3.11).
4. GUV-Bildung
   1. Kleben Sie eine mit dem Lipidfilm beschichtete Klebekammer auf das Abdeckglas, indem Sie die Klebekammer vorsichtig auf den lipidbeschichteten Deckglas drücken, wobei der Lipidfilm nach oben zeigt, um sicherzustellen, dass eine dichte Abdichtung gebildet wird.
   2. 400 μL 560 mM Saccharoselösung (hergestellt in Schritt 2.3) in die Kammer geben.
   3. Legen Sie den Deckglas in die Feuchtigkeitskammer und schließen Sie den Deckel.
   4. Legen Sie die Feuchtigkeitskammer auf eine vorgewärmte Heizplatte, die über dem Schmelzpunkt der gesättigten Lipidkomponente der Formulierung liegt.
   5. Lassen Sie die Vesikel für ≥1 h vor der Genesung bilden.
      HINWEIS: Die Vesikelbildung kann mit einer Fluoreszenzmikroskopie mit einer 40-fachen Luftobjektivlinse überprüft werden.

3. Vorbereitung von Motilitätsassay-Beständen und Reagenzien

1. Vorbereitung des Kaseinbestandes
   1. Fügen Sie 3 g trockenes Casein in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu, fügen Sie dann 30 ml 1x BRB80 hinzu und drehen Sie, bis die Lösung viskos wird. Zentrieren Sie das Röhrchen bei 15.000 x g für 30 min.
   2. Den Überstand in ein weiteres 50 mL konisches Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen. Filtern Sie die Lösung durch einen 1-μm-Spritzenfilter und sammeln Sie die Lösung in einer 50 ml konischen Durchstechflasche. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-μm-Filter und sammeln Sie die Lösung in einer 50 ml konischen Durchstechflasche.
   3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration, indem Sie die Absorption bei 280 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer und einer Quarzküvette messen.
   4. Berechnen Sie die Kaseinkonzentration in mg/ml nach folgender Formel:
      
   5. Verdünnen Sie die Lösung auf 20 mg/ml in 1x BRB80, teilen Sie sie in 100 μL Aliquots und lagern Sie sie bei -20 °C.
2. Stellen Sie Glucoseoxidase (2 mg / ml) Stammlösung her, indem Sie 2 mg Glucoseoxidase mit 1 ml 1x BRB80 mischen. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.
3. Bereiten Sie Katalase (0,8 mg / ml) Stammlösung vor, indem Sie 0,8 mg Katalase mit 1 ml 1x BRB80 mischen. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.
4. Bereiten Sie 2 M Glucoselösung vor, indem Sie 0,3 g D-Glucose in 1 ml deionisiertem Wasser suspendieren. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.
5. Bereiten Sie 100 mM DTT-Vorrat vor, indem Sie 0,015 g DTT in 1 ml deionisiertem Wasser suspendieren. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.
6. Bereiten Sie 100 mM Mg-ATP-Vorrat vor, indem Sie 0,055 g Dinatrium-ATP in 1 ml Lösung von 100 mM_{MgCl 2} suspendieren. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.
7. Bereiten Sie die 100 mM Mg-AMP-PNP-Lösung vor, indem Sie 0,055 g AMP-PNP in einer 1 ml Lösung von 100 mM_{MgCl 2} suspendieren, dann in 100 μL Aliquots teilen und bei -20 °C lagern.
8. Bereiten Sie 100 mM Trolox-Lösung vor, indem Sie 25,03 mg Trolox zu 1 ml Methanol hinzufügen und bei -20 ° C lagern.
9. Bereiten Sie 10 mg/ml Streptavidinlösung vor, indem Sie 1 mg Streptavidin zu 100 μL BRB80 hinzufügen, dann in 2 μL Aliquots teilen und bei -80ۛ °C lagern.
10. Bereiten Sie BRB90CAT vor, indem Sie 200 μL 5x BRB80, 20 μL Kaseinlösung, 10 μL MgATP-Lösung, 10 μL Trolox, 5 μL Paclitaxellösung und 765 μL DI-Wasser mischen. Bei 4 °C lagern.
11. Bereiten Sie die Motilitätslösung vor, indem Sie 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-Glucoselösung, 2 μL Glucoseoxidaselösung, 2 μL DTT-Lösung und 2 μL Katalaselösung mischen. Bei 4 °C lagern.
12. Eine 1 μM Kinesinlösung wird durch Verdünnen der Stammkinesinlösung in BRB80CAT (z. B. 2 μL 50 mM Kinesinlösung in 98 μL BRB80CAT) hergestellt und bei 4 °C gelagert.
13. Bereiten Sie eine 10 μg/ml Mikrotubulilösung vor, indem Sie 10 μL stabilisierte Mikrotubuli in 90 μL Raumtemperatur BRB80CAT verdünnen. Speichern bei RT.
14. Es wird eine 10 μg/ml Streptavidinlösung durch Zugabe von 0,1 μL 10 mg/ml Streptavidinlösung in 99,9 μL Motilitätslösung hergestellt. Bei 4 °C lagern.
15. Bereiten Sie eine 12-fache GUV-Lösung vor, indem Sie 5 μL GUV-Material in 55 μL Motilitätslösung verdünnen. Bei 4 °C lagern.
16. Polymerisation von Tubulin in Mikrotubuli
    1. Ein zuvor hergestelltes 2 μL Aliquot Tubulin wird aus dem Gefrierschrank von -80 °C (hergestellt in Schritt 1.5) gesammelt und für 30 min in ein 37 °C warmes Wasserbad gegeben.
    2. Bereiten Sie eine 2 mM Paclitaxel-Lösung vor, indem Sie 1,71 mg Paclitaxel in 1 ml wasserfreies DMSO hinzufügen, in 10 μL Aliquots teilen und bei -20 ° C lagern.
    3. BRB80T frisch zubereiten, indem Sie 99,5 μL 1x BRB80 mit 0,5 μL 2 mM Paclitaxel mischen.  100 μL BRB80T auf 37 °C im Wasserbad warm.
    4. Nach 30 min die 100 μL BRB80T in das Tubulinaliquot geben, um die Mikrotubuli zu stabilisieren. Speichern bei RT.

4. Gleitmotilitätsassay (GMA)

1. Bereiten Sie eine Durchflusskammer vor, indem Sie zwei Streifen aus doppelseitigem Klebeband, die durch 5 mm getrennt sind, auf einen Glasschieber legen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis jeder Streifen drei Bandschichten umfasst.
2. Legen Sie ein Deckglas auf das Band und drücken Sie es dann vorsichtig mit einer Pinzette oder einem Stift auf die Deckglas-/Bandschnittstelle, um eine ausreichende Haftung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Der Kanal sollte 5 mm breit, 25 mm lang und 300 mm hoch sein.
3. 30 μL 1 mm Kinesinlösung (hergestellt in Schritt 3.12) in die Durchflusszelle pipettieren und 5 min inkubieren lassen.
   HINWEIS: Das Casein bildet eine Doppelschicht auf der Oberfläche des Deckglases / Glasobjektträgers und erleichtert die Befestigung des Kinesin-Schwanzes an der Oberfläche.
4. Pipette 30 μL 10 μg/ml Mikrotubulielösung (hergestellt in Schritt 3.13) in die Durchflusszelle, wobei ein Labortuch verwendet wird, das sanft gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals gedrückt wird, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. 5 min inkubieren
5. Waschen Sie die Durchflusszelle 1x–3x mit 1x Motilitätslösung bei RT (vorbereitet in Schritt 3.11).
   HINWEIS: Die Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Luftobjektiv kann an dieser Stelle verwendet werden, um die Mikrotubuli-Befestigung und -Motilität zu bestätigen. Mikrotubuli erscheinen als fluoreszierende Filamente (Dutzende von Mikrometern Länge), die sich mit ~0,5 μm/s über die Oberfläche bewegen (gleiten) (Abbildung 1).
6. Pipette 30 μL 10 μg/ml Streptavidinlösung (hergestellt in Schritt 3.14) in die Durchflusszelle unter Verwendung eines Labortuchs, das vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals gedrückt wird, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. 10 min inkubieren
7. Fließen Sie 30 μL 12x GUV-Lösung (hergestellt in Schritt 3.15) in den Durchfluss mit einem Labortuch, das vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals gedrückt wird, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. 30 min inkubieren
8. Geben Sie 2 μL 100 mM AMP-PNP-Lösung (hergestellt in Schritt 3.7), um die Motilität zu stoppen, und verschließen Sie dann die Kammer mit Dichtmittel.

5. Charakterisierung des LNT-Netzwerks

1. Übertragen Sie die Durchflusskammer zur Bildgebung auf ein inverses Mikroskop.
2. Wählen Sie den geeigneten Filtersatz basierend auf den Wellenlängen der verwendeten fluoreszierenden Lipide oder Tubuline. Wenn Sie beispielsweise Texas Red-markierte Lipide verwenden, verwenden Sie einen 560 nm/25 nm Anregungsfilter und einen 607 nm/36 nm Emissionsfilter.
3. Verwenden Sie ein 100-faches Ölobjektiv, um auf die Oberfläche des Deckglases zu fokussieren.
4. Stellen Sie die LNT-Netzwerke mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie dar.
   HINWEIS: LNTs sind lineare Strukturen, die aus den größeren Vesikeln extrudieren. LNTs viel kleiner als GUVs und haben schwächere Fluoreszenzsignale. Daher müssen die Belichtung und der Kontrast entsprechend den Bild-LNTs angepasst werden. Diese Anpassungen führen auch zu einer Überbelichtung der GUVs, und daher wird empfohlen, die Lamellen- und Phasentrennung in GUVs unabhängig voneinander zu charakterisieren.
5. Fokussieren Sie das Mikroskop auf ein interessantes Netzwerk und nehmen Sie ein Standard- oder Kachelbild auf.
6. Passen Sie die Belichtungszeit und die Neutraldichtefilter an, um die LNTs abzubilden und die gesättigte Belichtung der GUVs zu minimieren. Erfassen Sie Bilder sowohl in roten als auch in grünen Kanälen.
   HINWEIS: Hier ermöglicht der rote Kanal die Visualisierung der Texas-Red-Lipide, während der grüne Kanal die Visualisierung der Mikrotubuli (z. B. Oregon Green-Lipide und HiLyte488-Farbstoffe) ermöglicht.
7. Erstellen Sie ein zusammengesetztes Bild, indem Sie den roten und den grünen Kanal überlagern (Abbildung 1).
8. Charakterisierung von LNT-Netzwerken durch Messung der LNT-Länge
   1. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Bildanalysesoftware wie ImageJ.
   2. Kalibrieren Sie die Skala für das Mikroskop mithilfe der eingestellten Skalierungsfunktion, geben Sie die Pixel auf den Umrechnungsfaktor mm ein und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Der Umrechnungsfaktor hängt vom Mikroskop, dem Objektivobjektiv und der Kamera ab und kann mit einem Objektträger zur Kalibrierung des Mikroskops ermittelt werden. Sie wird im Allgemeinen in Pixel/mm ausgedrückt.
   3. Verwenden Sie das Multipoint-Linienwerkzeug , um die Länge der Nanoröhrchen ausgehend vom Eltern-GUV zu messen. Halten Sie Strg + M gedrückt, um die Länge zu messen.
   4. Fahren Sie mit der Messung der Längen einzelner Rohre fort, indem Sie die obigen Schritte ausführen. Das Bildverarbeitungswerkzeug speichert jede neue Messung im Ergebnisfenster.
   5. Halten Sie Strg + D gedrückt, nachdem Sie jede Linie gezeichnet haben, um zu verfolgen, welche Rohre gemessen wurden.
9. Messung der LNT-Dicke (Abbildung 2)
   1. Öffnen Sie das Bild in ImageJ, und wählen Sie unter der Registerkarte Bild die Funktion Schwellenwert aus.
   2. Klicken Sie auf Übernehmen, um den Schwellenwert anzuwenden.
   3. Zeichnen Sie ein Rechteck bekannter Länge über das gewünschte Rohr (schwarze Pixel haben einen Wert von 0 und rote Pixel haben einen Wert von 255).
   4. Messen Sie die integrierte Dichte der Fläche.
   5. Teilen Sie die Dichte durch die Länge (in Pixel) der LNT, um die Dicke (in Pixel) zu erhalten.
      HINWEIS: Die Dickenmessungen können nur dann über Bilder hinweg verglichen werden, wenn die Bildeinstellungen und der Schwellenwert identisch eingestellt sind.
10. Bestimmung der Lipidpartitionierung in Knoten von LNTs (Abbildung 3)
    1. Öffnen Sie das Bild in ImageJ.
    2. Verwenden Sie das Linienwerkzeug , um eine Linie über den gewünschten Knoten zu zeichnen.
    3. Messen Sie die Knotenintensität sowohl im Oregon Green- als auch im Texas Red-Kanal.
    4. Verschieben Sie die Linie zum LNT und messen Sie die LNT-Intensität sowohl im Oregon Green- als auch im Texas Red-Kanal.

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Ergebnisse

LNT-Netzwerke (Abbildung 4) wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls hergestellt, das die Arbeit des Kinesin-Transports von Mikrotubuli verwendet, um LNTs aus GUVs zu extrudieren. Kurz gesagt, GUVs wurden unter Verwendung von Agarosegel-Rehydratation unter Verwendung von Saccharoselösung hergestellt, und Mikrotubuli wurden in GPEM-Lösung polymerisiert und in BRB80T stabilisiert. Als nächstes wurden Kinesin-Motoren in eine Durchflusszelle eingeführt, die eine aktive Schicht vo...

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Diskussion

LNT-Netzwerke sind ein nützliches Werkzeug für In-vitro-Studien zu Membraneigenschaften und dem Transport von Biomolekülen wie Transmembranproteinen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung komplexer Lipidformulierungen zur Herstellung von LNT-Netzwerken biologisch relevantere Studien. Andere Herstellungsstudien haben entweder 1) einfache Lipidformulierungen und mehrfeldrige Vesikel oder 2) umständlichere Motilitätstechniken verwendet, um Netzwerke aus GUVs herzustellen, die aus komplexen Lipidformulierungen best...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective	Olympus	1-U2B836	Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter	Olympus		Neutral Density Filter
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein	Sigma-Aldrich	22090	Casein hydrolysate for microbiology
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322	Catalase from Bovine Liver
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306	Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol	Avanti	700000P	cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin	Avanti	870282C	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC	Avanti	850355P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin	Avanti	870285P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G6125	Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol	Fisher	G33	Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope	Olympus	N/A	IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M1028	1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE	Invitrogen	O12650	Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel	ThermoFisher	P3456	Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin	Cytoskeleton	T333P	Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488	Cytoskeleton	TL488M	Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled	Cytoskeleton	T240	Tubulin protein porcine brain