Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Özet

Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.

Özet

Lipid nanotüp (LNT) ağları, ökaryotik hücrelerde bulunan her yerde bulunan lipit tübülleriyle ilgili moleküler taşıma ve lipit biyofiziğini incelemek için in vitro bir model sistemini temsil eder. Bununla birlikte, in vivo LNT'ler, kimyasal enerji ve moleküler motorların monte edilmesini, korunmasını ve yeniden düzenlenmesini gerektiren dengesiz yapılardır. Ayrıca, in vivo LNT'lerin bileşimi, birden fazla farklı lipit türünden oluşan karmaşıktır. LNT'leri ekstrüzyon yapmak için tipik yöntemler hem zaman hem de emek yoğundur ve nanotüpleri dev lipit veziküllerinden zorla çekmek için optik cımbız, mikro boncuk ve mikropipetler gerektirir. Burada, büyük ölçekli LNT ağlarının kinesin ile çalışan mikrotübül motilitesi kullanılarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) hızla üretildiği kayma hareketliliği testi (GMA) için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, LNT ağları, biyolojik LNT'lerin karmaşıklığını taklit eden çok çeşitli lipit formülasyonlarından oluşur ve bu da onları lipid biyofiziği ve membranla ilişkili transportun in vitro çalışmaları için giderek daha yararlı hale getirir. Ek olarak, bu yöntem yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanlarını kullanarak LNT ağlarını kısa sürede (<30 dakika) güvenilir bir şekilde üretebilir. Uzunluk, genişlik ve lipit bölümleme gibi LNT ağ özellikleri, ağları imal etmek için kullanılan GUV'ların lipit bileşimini değiştirerek de ayarlanabilir.

Giriş

Lipid nanotüp (LNT) ağlarının imalatı, dengesiz lipid yapılarının in vitro incelenmesi için artan bir ilgi alanıdır ^1,2,3. Hücreler, proteinlerin 4 ve nükleik asitlerin^5'in difüzyon taşınması ve hücreden hücreye iletişim ^6,7 için lipit tübülleri kullanır. Endoplazmik retikulum ve Golgi aparatı özellikle ilginçtir, çünkü bu zara bağlı organeller lipit ve protein sentezinin yanı sıra bu integral biyomoleküllerin bir hücrenin sitoplazması içinde taşınması için birincil yerlerdir ^8,9. Bu organellerin zarları, sonuçta işlevselliklerini tanımlamaya yardımcı olan sfingolipidler, kolesterol ve fosfolipitler¹⁰ dahil olmak üzere çoklu lipit türlerinden oluşur. Bu nedenle, bu organelleri daha yakından çoğaltmak ve incelemek için, in vitro LNT'ler giderek daha karmaşık lipit formülasyonlarına sahip veziküllerden imal edilmelidir¹¹.

Dev unilamellar veziküller (GUV'ler), lipid membran davranışını incelemek için yaygın olarak kullanılır, çünkü kolesterol, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilserin (PS) ve fosfatidilinositol (PI) ^12,13 içeren karmaşık formülasyonlarla güvenilir bir şekilde sentezlenebilirler. Burada açıklanan, LNT'lerin kinesin motorları ve GUV'lara etki eden mikrotübül filamentleri tarafından gerçekleştirilen çalışmalara dayanarak ekstrüde edildiği kayma hareketlilik testi (GMA) kullanılarak değişen lipit formülasyonlarına sahip GUV'lerden LNT'ler üretmek için bir yöntemdir. Bu sistemde, kinesin motor proteinleri, biyotinillenmiş mikrotübülleri bir yüzeye adsorbe ederek, ATP'nin hidrolizinden kimyasal enerjiyi yararlı bir işe dönüştürerek (özellikle, LNT'lerin biyotinillenmiş veziküllerden ekstrüzyonu)¹¹. Ortaya çıkan LNT ağı, lipit fazlarındaki farklılıkların LNT morfolojisindeki değişiklikler üzerindeki etkilerini incelemek için bir model platform sağlar.

Kısaca, kinesin motor proteinleri, motorların odanın cam yüzeyine adsorpsiyonunu sağlayan kazein içeren bir çözelti içindeki bir akış odasına sokulmuştur. Daha sonra, ATP içeren bir çözeltideki biyotinile mikrotübüller odadan akar ve kinesin motorlarına bağlanmasına ve hareketliliğe başlamasına izin verilir. Daha sonra odaya bir streptavidin çözeltisi verilir ve mikrotübüllere kovalent olmayan bir şekilde bağlanmasına izin verilir. Son olarak, biyotinile edilmiş bir lipit içeren GUV'lar odaya sokulur ve streptavidin kaplı mikrotübüllere bağlanır, daha sonra 15-30 dakika boyunca büyük ölçekli ağlar oluşturmak için LNT'leri ekstrüzyon yapar. Bu yöntem, standart laboratuvar ekipmanlarını ve reaktifleri kullanarak düşük maliyetle büyük, dallanmış LNT ağları üretir¹¹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Stok mikrotübül çözeltilerinin hazırlanması

DİKKAT: Güvenlik gözlükleri, eldivenler ve laboratuvar önlüğü protokol boyunca her zaman giyilmelidir.

1. 5x BRB80 tamponu hazırlayın: 1 L'lik bir cam şişeye 24.19 g PIPES (piperazin-N, N′-bis [2-etansülfonik asit]) ve 0.38 g EGTA (etilen glikol-bis [β-aminoetil eter]-N, N, N′, N′-tetraasetik asit) ekleyin. 1 mL'lik 1 M MgCl₂ ekleyin ve pH'ı KOH ile 6,9'a ayarlayın. Çözeltiyi 500 mL'lik bir son hacme getirmek için deiyonize su ekleyin.
2. 100 mM GTP çözeltisi stoğu hazırlayın: 52 mg GTP tartın ve 1 mL damıtılmış suda askıya alın. 100 mM solüsyonu 20 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
3. GPEM çözeltisini hazırlayın: 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP çözeltisi, 100 μL% 100 gliserol ve 600 μL deiyonize su karıştırın. GPEM çözeltisini 100 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
4. Ticari olarak temin edilebilen, liyofilize tübülin şişelerini (biyotinillenmiş, floresan olarak etiketlenmiş ve etiketlenmemiş her biri bir şişe) soğuk (4 ° C) GPEM çözeltisinde 5 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırarak mikrotübül çözeltisi hazırlayın.
5. 32 mL'lik bir son hacimde 1:1:6'lık bir oran oluşturmak için 4 μL biyotinile tübülin, 4 μL floresan etiketli tübülin ve 24 μL etiketlenmemiş tübülin (hepsi 5 mg / mL konsantrasyonlarında) karıştırarak mikrotübül polimerizasyonu gerçekleştirin. Buz üzerinde tutun. Tübülin karışımını 2 μL alikotlara bölün ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Verimli polimerizasyon, tübülin konsantrasyonunun kritik konsantrasyona (5 mg / mL) eşit veya üzerinde olmasını ^gerektirir14. Burada, tübülin oranının seçimi, streptavidin ve GUV'ları verimli bir şekilde bağlamak için yeterli konsantrasyonda biyotinillenmiş tübülin ve mikroskobik karakterizasyon için yeterli konsantrasyonda floresan tübülin için optimize edilmiştir.

2. Dev unilamellar veziküllerin (GUV'lar) hazırlanması

1. Agarose film hazırlığı
   NOT: Bu protokol Greene ve ^ark.15'ten uyarlanmıştır.
   1. 250 mL Erlenmeyer şişesinde 100 mL deiyonize suda 1 g agaroz karıştırarak% 1'lik bir w / v çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözeltisini 1-2 dakika ısıtmak için standart bir mikrodalga kullanın.
      NOT: Agaroz tamamen çözündükten sonra çözelti yarı saydam hale gelecektir. Kullanmadan önce çözeltinin 65–75 °C'ye soğumasını bekleyin.
   2. 25 mm x 25 mm'lik bir cam kapak kapağı üzerine 300-400 μL agaroz çözeltisi pipetlemek için kesilmiş 1.000 μL pipet ucu kullanın. Kapak kapağının kenarını eldivenli parmaklarla tutarken, erimiş agarozu kapak kapağı boyunca eşit şekilde yaymak için başka bir 1.000 μL pipet ucu kullanın.
      NOT: Agarozun 65–75 °C'de tutulması, kapak kayma yüzeyinde etkili bir şekilde yayılmaya izin verecektir.
   3. Agaroz kaplı örtüleri 37 ° C'lik bir inkübatörde en az 2 saat kurutun, bu noktada agaroz şeffaf hale gelecektir. Agaroz kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde oda sıcaklığında (RT) tüy bırakmayan kağıt veya balmumu bazlı film gibi temiz bir yüzeye yerleştirerek kapak kapaklarını saklayın.
2. Lipid formülasyonu
   1. Kloroform içinde çözünmüş lipitleri -20 °C'lik bir dondurucudan alın ve RT'ye ulaşana kadar kimyasal bir duman başlığına yerleştirin.
   2. Aşağıdaki formülü kullanarak formülasyon için gerekli olan her bir bileşen lipitinin lipit stoğunun hacmini hesaplayın:
      
      Nerede: V lipid kullanılacak lipid hacmidir, mol% lipit bileşeninin molar yüzdesidir, n formülasyonda kullanılan toplam _lipid mol sayısıdır ve M, molar birimlerdeki lipit konsantrasyonudur.
      NOT: Örneğin, 12,72 mM'lik bir stok çözeltisi konsantrasyonuna sahip %45 mol 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) içeren bir formülasyon ve formülasyonda 1 mikromol toplam lipit kullanılıyorsa, formülasyonda kullanılan DOPC stoğunun hacmi şöyle olacaktır:
      
   3. Lipitleri, kimyasal duman davlumbazındaki bir cam şişede hesaplanan oranda karıştırın.
   4. Agaroz kaplı kapaklar üzerine 30 μL lipit çözeltisi pipeti, formülasyonun doymuş lipit bileşeninin erime noktasının üzerine yerleştirilmiş önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde kayar (örneğin; T_m 40 °C olan bir lipit için 50 °C sıcak plaka).
   5. Çözeltiyi, kloroform buharlaşana ve düzgün bir lipit tabakası oluşana kadar 18 G'lik bir iğnenin uzun kenarını kullanarak dairesel bir hareketle agaroz filmi boyunca yayın. Bu adımı gerçekleştirirken kapak kapağının kenarını eldivenli parmaklarınızla tutun.
      NOT: İğne ile agaroz tabakasına zarar vermemeye özen gösterilmelidir.
   6. Agaroz tabakası ve lipit filmi içeren kapak kapağını alüminyum folyo kaplı Petri kabına, film tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve artık çözücüyü çıkarmak için Petri kabını en az 2 saat boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
3. Bu arada, 1.92 g sakkarozu 10 mL deiyonize su ile karıştırarak 560 mM sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Sakkaroz çözeltisinin konsantrasyonu, tampon GUV'ların seyreltildiği ozmolariteye bağlıdır. Tipik olarak, sakkaroz çözeltisinin ozmolaritesi, GUV'ların seyreltileceği tampondan, özellikle de hareketlilik tamponundan% 10'dan fazla olmamalıdır (bkz. adım 3.11).
4. GUV oluşumu
   1. Yapışkan odacığı, lipit filmi yukarı bakacak şekilde lipit kaplı kapak kapağının üzerine hafifçe bastırarak lipit filmi ile kaplanmış bir kapak kapağına yapışkan bir oda yapıştırın ve sıkı bir conta oluştuğundan emin olun.
   2. Odaya 400 μL 560 mM sakkaroz çözeltisi (adım 2.3'te hazırlanmış) ekleyin.
   3. Kapak kapağını nem odasına yerleştirin ve kapağı kapatın.
   4. Nem odasını, formülasyonun doymuş lipit bileşeninin erime noktasının üzerine yerleştirilmiş önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine yerleştirin.
   5. İyileşmeden önce veziküllerin ≥1 saat boyunca oluşmasına izin verin.
      NOT: Vezikül oluşumu, 40x hava objektif lens ile floresan mikroskopi ile kontrol edilebilir.

3. Motiliteli test stoklarının ve reaktiflerinin hazırlanması

1. Kazein stoğunun hazırlanması
   1. 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne 3 g kuru kazein ekleyin, ardından 30 mL 1x BRB80 ekleyin ve çözelti viskoz hale gelene kadar döndürün. Tüpü 30 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj yapın.
   2. Süpernatantı başka bir 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın. Çözeltiyi 1 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve çözeltiyi 50 mL'lik bir konik şişede toplayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirerek çözeltiyi 50 mL'lik bir konik şişede toplayın.
   3. Bir UV-Vis spektrofotometresi ve kuvars küvet kullanarak absorbansı 280 nm'de ölçerek protein konsantrasyonunu belirleyin.
   4. Aşağıdaki formülü kullanarak mg / mL cinsinden kazein konsantrasyonunu hesaplayın:
      
   5. Çözeltiyi 1x BRB80'de 20 mg / mL'ye kadar seyreltin, 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
2. 2 mg glikoz oksidazı 1 mL 1x BRB80 ile karıştırarak glikoz oksidaz (2 mg / mL) stok çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
3. 0.8 mg katalazı 1 mL 1x BRB80 ile karıştırarak katalaz (0.8 mg / mL) stok çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
4. 1 mL deiyonize suda 0.3 g D-glikozu askıya alarak 2 M glikoz çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
5. 1 mL deiyonize suda 0,015 g DTT'yi askıya alarak 100 mM DTT stoğu hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
6. 100 mM MgCl_2'lik 1 mL çözeltide 0.055 g disodyum ATP'yi askıya alarak 100 mM Mg-ATP stoğu hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
7. 100 mM MgCl_2'lik 1 mL'lik bir çözeltide 0,055 g AMP-PNP'yi askıya alarak 100 mM Mg-AMP-PNP çözeltisi hazırlayın, ardından 100 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
8. 1 mL metanole 25.03 mg Trolox ekleyerek 100 mM Trolox çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
9. 100 μL BRB80'e 1 mg streptavidin ekleyerek 10 mg / mL streptavidin çözeltisi hazırlayın, ardından 2 μL alikotlara bölün ve -80ۛ ° C'de saklayın.
10. 200 μL 5x BRB80, 20 μL kazein çözeltisi, 10 μL MgATP çözeltisi, 10 μL Trolox, 5 μL paklitaksel çözeltisi ve 765 μL DI suyu karıştırarak BRB90CAT hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
11. 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glikoz çözeltisi, 2 μL glikoz oksidaz çözeltisi, 2 μL DTT çözeltisi ve 2 μL katalaz çözeltisini karıştırarak hareketlilik çözeltisini hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
12. BRB80CAT'teki stok kinesin çözeltisini seyrelterek 1 μM kinesin çözeltisi hazırlayın (örneğin, BRB80CAT'in 98 μL'sinde 2 μL 50 mM kinesin çözeltisi) ve 4 °C'de saklayın.
13. 90 μL oda sıcaklığında 10 μL stabilize mikrotübülleri seyrelterek 10 μg / mL mikrotübül çözeltisi hazırlayın BRB80CAT. RT'de depolayın.
14. 99.9 μL hareketlilik çözeltisine 0.1 μL 10 mg / mL streptavidin çözeltisi ekleyerek 10 μg / mL'lik bir streptavidin çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
15. 5 μL GUV stoğunu 55 μL hareketlilik çözeltisine seyrelterek 12x GUV çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
16. Tübülinin mikrotübüllere polimerizasyonu
    1. Önceden hazırlanmış 2 μL tübülin alikotunu -80 °C dondurucudan (adım 1.5'te hazırlanmış) toplayın ve 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    2. 1 mL susuz DMSO'ya 1.71 mg paklitaksel ekleyerek 2 mM'lik bir paklitaksel çözeltisi hazırlayın, 10 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
    3. BRB80T'yi 99,5 μL 1x BRB80 ile 0,5 μL 2 mM paklitaksel karıştırarak taze olarak hazırlayın.  Su banyosunda 100 μL BRB80T ila 37 °C ısıtın.
    4. 30 dakika sonra, mikrotübülleri stabilize etmek için tübülin aliquotuna 100 μL BRB80T ekleyin. RT'de depolayın.

4. Kayan hareketlilik testi (GMA)

1. Bir cam kızağa 5 mm ile ayrılmış iki çift taraflı bant şeridi yapıştırarak bir akış odası hazırlayın. Her şeridi üç bant katmanı oluşturana kadar bu işlemi tekrarlayın.
2. Bandın üstüne bir kapak kayması yerleştirin, ardından yeterli yapışmayı sağlamak için bir cımbız veya kalemle kapak kayması/bant arayüzüne hafifçe bastırın.
   NOT: Kanal 5 mm genişliğinde 25 mm uzunluğunda ve 300 mm yüksekliğinde olmalıdır.
3. Pipet, akış hücresine 30 μL 1 mm kinesin çözeltisi (adım 3.12'de hazırlanmış) ve 5 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin.
   NOT: Kazein, kapak kayması/cam sürgü yüzeyinde bir çift katman oluşturur ve kinesin kuyruğunun yüzeye tutturulmasını kolaylaştırır.
4. Pipet, çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanılarak akış hücresine 10 μg/mL mikrotübül çözeltisinden (adım 3.13'te hazırlanmıştır) 30 μL'dir. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
5. 1x–3x akış hücresini RT'de 1x hareketlilik çözeltisi ile yıkayın (adım 3.11'de hazırlanır).
   NOT: Bu noktada mikrotübül bağlantısını ve hareketliliğini doğrulamak için 40x hava hedefi kullanan floresan mikroskobu kullanılabilir. Mikrotübüller, yüzey boyunca ~ 0.5 μm / s'de hareket eden (süzülen) floresan filamentler (onlarca mikron uzunluğunda) olarak ortaya çıkar (Şekil 1).
6. Pipet, çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanılarak akış hücresine 10 μg/mL streptavidin çözeltisinden (adım 3.14'te hazırlanmıştır) 30 μL'dir. 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
7. 30 μL 12x GUV çözeltisini (adım 3.15'te hazırlanmıştır), çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanarak akışa aktarın. 30 dakika boyunca inkübe edin.
8. Hareketliliği durdurmak için 2 μL 100 mM AMP-PNP çözeltisi (adım 3.7'de hazırlanmış) ekleyin, ardından odayı sızdırmazlık maddesi ile kapatın.

5. LNT ağ karakterizasyonu

1. Görüntüleme için akış odasını ters çevrilmiş bir mikroskopa aktarın.
2. Kullanılan floresan lipitlerin veya tübülinin dalga boylarına göre uygun filtre setini seçin. Örneğin, Texas Red etiketli lipitleri kullanırken, 560 nm / 25 nm uyarma filtresi ve 607 nm / 36 nm emisyon filtresi kullanın.
3. Kapak kapağının yüzeyine odaklanmak için 100x yağ hedefi kullanın.
4. Floresan mikroskobu kullanarak LNT ağlarını görüntüleyin.
   NOT: LNT'ler daha büyük veziküllerden ekstrüzyon yapan doğrusal yapılardır. LNT'ler GUV'lardan çok daha küçüktür ve daha zayıf floresan sinyallerine sahiptir. Bu nedenle, pozlama ve kontrast görüntü LNT'lerine göre ayarlanmalıdır. Bu ayarlamalar aynı zamanda GUV'ların aşırı maruz kalmasına da yol açar ve bu nedenle GUV'lardaki lamellerliğin ve faz ayrımının bağımsız olarak karakterize edilmesi önerilir.
5. Mikroskopu bir ilgi alanına odaklayın ve standart veya döşenmiş bir görüntü alın.
6. LNT'leri görüntülemek ve GUV'lerin doymuş pozlamasını en aza indirmek için pozlama süresini ve nötr yoğunluk filtrelerini ayarlayın. Hem kırmızı hem de yeşil kanallarda görüntüler alın.
   NOT: Burada, kırmızı kanal Teksas-Kırmızı lipitlerin görselleştirilmesine izin verirken, yeşil kanal mikrotübüllerin (örneğin, Oregon Green lipitleri ve HiLyte488 boyaları) görselleştirilmesine izin verir.
7. Kırmızı ve yeşil kanalları üst üste bekleyerek bileşik bir görüntü oluşturun (Şekil 1).
8. LNT uzunluğunun ölçülmesiyle LNT ağlarının karakterizasyonu
   1. ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak alınan görüntüleri açın.
   2. Ölçek ayarla özelliğini kullanarak mikroskop için teraziyi kalibre edin, pikselleri mm dönüştürme faktörüne doldurun ve Tamam'ı tıklatın.
      NOT: Dönüştürme faktörü mikroskop, objektif lens ve kameraya bağlıdır ve mikroskop kalibrasyon slaytı kullanılarak elde edilebilir. Genellikle piksel/mm cinsinden ifade edilir.
   3. Ana GUV'den başlayan nanotüplerin uzunluğunu ölçmek için Çok Noktalı çizgi aracını kullanın. Uzunluğu ölçmek için Ctrl + M tuşlarını basılı tutun.
   4. Yukarıdaki adımları izleyerek tek tek tüplerin uzunluklarını ölçmeye devam edin. Görüntü işleme aracı, her yeni ölçümü sonuçlar penceresine kaydeder.
   5. Hangi tüplerin ölçüldüğünü takip etmek için her çizgiyi çizdikten sonra Ctrl + D tuşlarını basılı tutun.
9. LNT kalınlığının ölçülmesi (Şekil 2)
   1. Görüntüyü ImageJ'de açın ve Görüntü sekmesinin altındaki Eşik özelliğini seçin.
   2. Eşiği uygulamak için Uygula'yı tıklayın.
   3. İstediğiniz tüpün üzerine bilinen uzunlukta bir dikdörtgen çizin (siyah piksellerin değeri 0, kırmızı piksellerin değeri ise 255'tir).
   4. Alanın entegre yoğunluğunu ölçün.
   5. Kalınlığı (piksel cinsinden) elde etmek için yoğunluğu LNT'nin uzunluğuna (piksel cinsinden) bölün.
      NOT: Kalınlık ölçümleri yalnızca görüntüleme ayarları ve eşik aynı şekilde ayarlandığında görüntüler arasında karşılaştırılabilir.
10. LNT'lerin düğümlerinde lipid bölümlemesinin belirlenmesi (Şekil 3)
    1. Görüntüyü ImageJ'de açın.
    2. İstediğiniz düğümün üzerine çizgi çizmek için Çizgi aracını kullanın.
    3. Hem Oregon Green hem de Texas Red kanallarındaki düğüm yoğunluğunu ölçün.
    4. Çizgiyi LNT'ye taşıyın ve hem Oregon Green hem de Texas Red kanallarındaki LNT yoğunluğunu ölçün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

LNT ağları (Şekil 4), LNT'leri GUV'lardan ekstrüde etmek için mikrotübüllerin kinesin taşınması tarafından gerçekleştirilen işi kullanan tarif edilen protokol kullanılarak üretilmiştir. Kısaca GUV'lar sakkaroz çözeltisi kullanılarak agaroz jel rehidrasyonu kullanılarak hazırlandı ve mikrotübüller GPEM çözeltisinde polimerize edilerek BRB80T'de stabilize edildi. Daha sonra, kinesin motorları, kapak kaymasının yüzeyinde aktif bir motor tabakası oluşturan bir a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

LNT ağları, membran özelliklerine ve transmembran proteinleri gibi biyomoleküllerin taşınmasına yönelik in vitro çalışmalar için yararlı bir araçtır. Ayrıca, LNT ağlarını üretmek için karmaşık lipit formülasyonlarının kullanılması, biyolojik olarak daha ilgili çalışmalara olanak tanır. Diğer imalat çalışmaları ya 1) basit lipit formülasyonları ve çok katmanlı veziküller ya da 2) karmaşık lipit formülasyonlarından oluşan GUV'lardan ağlar üretmek için daha hantal hareketlil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective	Olympus	1-U2B836	Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter	Olympus		Neutral Density Filter
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein	Sigma-Aldrich	22090	Casein hydrolysate for microbiology
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322	Catalase from Bovine Liver
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306	Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol	Avanti	700000P	cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin	Avanti	870282C	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC	Avanti	850355P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin	Avanti	870285P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G6125	Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol	Fisher	G33	Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope	Olympus	N/A	IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M1028	1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE	Invitrogen	O12650	Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel	ThermoFisher	P3456	Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin	Cytoskeleton	T333P	Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488	Cytoskeleton	TL488M	Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled	Cytoskeleton	T240	Tubulin protein porcine brain