动脉瘤高脂血症小鼠模型中油红O染色全主动脉病变的成像和分析

摘要

该协议提供了 分析小鼠动脉粥样硬化负担的分步程序。研究人员可以使用该协议来比较不同动物中动脉粥样硬化病变的丰度，位置和大小。

摘要

载脂蛋白E（Apoe）或低密度脂蛋白受体（Ldlr）缺陷高脂小鼠是动脉粥样硬化研究最常用的两种模型。它们用于研究各种遗传因素和不同细胞类型对动脉粥样硬化病变形成的影响，以及测试新疗法的开发。分离、切除整个主动脉和定量油红 O 染色动脉粥样硬化病变是用于评估动脉粥样硬化负荷的基本形态测量方法。该协议的目标是描述一种优化的，循序渐进的手术方法，用于用油红O解剖，灌注固定，分离，染色，成像和分析小鼠主动脉中的动脉粥样硬化病变。由于动脉粥样硬化病变可以在整个主动脉树的任何地方形成，因此这种整个主动脉油红O染色方法具有评估单个小鼠中整个主动脉和所有分支中富含脂质的斑块的优点。除了油红O染色外，新鲜分离的全主动脉还可用于各种体外和体内实验以及细胞分离。

引言

冠状动脉疾病是美国死亡的主要原因，通常由动脉粥样硬化引起，这一过程导致斑块在动脉壁内积聚¹。易患高脂血症的Apoe和Ldlr缺陷小鼠是动脉粥样硬化及其并发症和治疗开发的核心^{2，3，4，5}。来自面部主动脉的动脉粥样硬化病变的定量是评估遗传操作对不同细胞类型的影响的重要终点分析。它还有助于研究旨在影响动脉粥样硬化性疾病发生，进展和消退的新疗法。动脉粥样硬化病变可在主动脉及其分支（即胸部的臂头动脉、颈动脉和锁骨下动脉，以及髂膜下方的肾脏、髂总动脉和股动脉）⁶的任何地方形成。对动脉粥样硬化负担的全面评估和适当的治疗需要评估不同地点的疾病负担，这是一个经常被忽视的挑战。

该协议描述了如何在单个小鼠中对动脉粥样硬化病变进行全面分析，从未打开的整个主动脉开始，然后进行面部准备。未开封的全主动脉油红O染色允许快速，定性地评估整个主动脉及其分支中富含脂质的斑块，而en面部制剂则提供小鼠主动脉中动脉粥样硬化病变分布的定量评估。

该技术使用8周龄的小鼠，在Apoe-^/-高脂血症背景（MYH11-CreERT2;Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f;Apoe^-/-;以下简称TGFβR2iSMC-Apoe小鼠）和凋落物Apoe^-/-对照（MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f;Apoe^-/-;以下简称为Apoe^-/-小鼠）。这些动物以高胆固醇高脂肪饮食（HCHFD）作为研究材料饲养16周⁷。在研究终止时，对未打开的整个主动脉进行染色并用油红O成像（包括所有主要分支），以定性评估富含脂质的斑块。主动脉通过面部准备切开，所有动脉粥样硬化病变成像和定量。该协议可用于研究Apoe-/-或^Ldlr-/-高脂血症小鼠模型中的动脉粥样硬化病变发展，并扩展到一般主动脉相关的血管生物学应用。

研究方案

mT / mG（库存号007676）和Apoe^-/-（库存号002052）小鼠从杰克逊实验室购买。Myh11-CreERT2小鼠是Stefan Offermanns的礼物（可从杰克逊实验室获得，库存号为019079）。Tgfbr2fl ^{/ fl}小鼠是从Harold L. Moses（范德比尔特大学）获得的。所有动物程序均使用耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行。

1. 老鼠

1. 生产 MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f;Apoe^-/-和MYH11-CreERT2;Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f;如前所述，Apoe^-/-小鼠⁷。将突变菌株培育到C57BL / 6J背景超过十代。
   注意:Myh11-CreERT2 Cre小鼠系为研究平滑肌细胞在血管稳态和血管病理学中的作用提供了强大的工具。Cre等位基因插入Y染色体;因此，雌性小鼠不表达这种结构。

2.小鼠基因分型，他莫昔芬诱导和高胆固醇高脂肪饮食喂养

1. 使用小鼠耳DNA和PCR分析进行小鼠基因分型。应根据制造商的说明使用血液和组织DNA分离试剂盒（材料表）分离小鼠耳DNA。PCR引物列于 表1中。
2. 通过他莫昔芬注射液以1mg /天ip诱导Cre-Lox重组，在6周龄MYH11-CreERT2;mT/ mGf ^{/ f}中5天;Apoe^-/-和MYH11-CreERT2;Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f;Apoe^-/-雄性小鼠。
3. 通过将8周龄的雄性小鼠（他莫昔芬治疗后2周）置于HCHF饮食（40%kcal脂肪，1.25%胆固醇，0%胆酸）中诱导动脉粥样硬化16周。

3. 试剂和解剖工具制备

1. 原料油红O溶液制备:将1克油红O溶于100毫升异丙醇中。
2. 工作油红O溶液制备:将24mL储备油红O溶液与16mL dH ₂ O混合。用0.45μm无菌注射器过滤器过滤稀释的油红O（溶液仅有效1-2小时）。
3. 60%异丙醇制备:将60 mL异丙醇与40 mL dH ₂ O混合。
4. 1x DPBS制备中的4%甲醛:将10 mL的16%甲醛稀释在30 mL的1x DPBS中。
5. 用70%乙醇清洁所有解剖工具（图1）。

4. 安乐死（图2A）

1. 在安乐死之前测量小鼠的体重。
2. 通过腹膜内注射氯胺酮和木拉嗪（每毫升含有10mg / mL氯胺酮和2mg / mL木拉嗪）对小鼠实施安乐死。
3. 将鼠标置于仰卧位（腹部朝上）。

5.胸腔和腹腔的开口和心脏灌注（图2B）

1. 准备一个10毫升注射器，内含10毫升1x DPBS。用25克针头盖帽。注射器将用于冲洗心脏。
2. 用镊子（样式5）支撑皮肤，并用细剪刀从腹部底部到颈部顶部切割。
3. 打开胸腔下方的腹壁。
4. 用镊子抬起胸骨（样式5）并切开隔膜，然后切掉胸腔以暴露胸腔。
5. 在心脏的右心房做一个小切口。
6. 通过缓慢注射 10 mL 1x DPBS，通过心尖左心室穿刺进行灌注。一旦彻底灌注，肝脏和肾脏就会变成浅棕色。
7. 使用无纺布海绵吸收材料，清洁胸腔内多余的血液和液体。

6. 主动脉和分支的隔离（图2C）

1. 切除器官（即肺、肝、脾、胃肠道和生殖器官），并使用镊子（样式 5）和细剪刀切开锁骨，同时保持心脏、肾脏和主动脉原位完整。
   注意:确保不要撕裂心脏或任何主要血管。
2. 将鼠标放在立体显微镜下。
3. 使用镊子（4 型）和弹簧剪刀夹开主动脉和主动脉分支，包括肱头动脉、颈动脉、锁骨下动脉、肾动脉、髂总动脉和股动脉。
   注意:用湿的无纺布海绵覆盖主动脉，以避免在解剖主动脉分支时脱水。
4. 使用镊子（样式4）和弹簧剪刀仔细解剖并去除主动脉和主动脉分支周围的外来脂肪和结缔组织。
   注意:由于炎症在动脉瘤高脂血症小鼠中很突出，因此很难去除外来。注意不要撕裂或划伤主动脉和主动脉分支。这一步需要练习和耐心。

7. 固定心脏和主动脉（图2D，E）

1. 准备一个10毫升注射器，在1x DPBS中加入10毫升4%甲醛。用25克针头盖帽。
   注意:甲醛是有害的。在使用这种化学品之前，请阅读MSDS。戴上手套和安全眼镜，在通风橱内产生稀释溶液。
   注意:4%甲醛溶液会随着时间的推移而降解。使用新鲜制作的4%甲醛进行固定很重要。
2. 通过左心室顶端穿刺，缓慢注入10 mL 4%甲醛来固定血管树。
   注意:甲醛固定会干扰多种下游应用，如细胞培养、FACS 分析和单细胞 RNA 测序分析。如果主动脉将用于任何这些应用，请跳过此步骤。
3. 用无纺布海绵清洁胸腔中任何多余的液体以吸收材料。
4. 用镊子（样式4）握住心脏并使用微解剖弹簧剪刀将心脏与主动脉分开。
   注意:要在此步骤后进行面部油红O染色，建议将主动脉原位切开而不是离体，然后进入第8部分。这使得面部主动脉很容易平放。
5. 使用镊子（4型）和弹簧剪刀隔离并切除主动脉及其主动脉，从颈动脉上方1mm到股动脉末端。
6. 将容器转移到蜡培养皿或1.5 mL微量离心管中，并用1x DPBS填充，直到它覆盖主动脉。
   注意:协议可以在此处暂停。

8. 油红O染色和未开封的整个主动脉的成像（图3）

1. 使用细针将容器固定在蜡培养皿上（图3A）。
2. 用1x DPBS冲洗容器一次。
3. 将25毫升新鲜的油红O溶液倒入培养皿中（图3B）。
   注:（1）异丙醇是有害的易燃液体。使用适当的个人防护装备。（2）油红O溶液易沉淀。沉淀的颗粒会干扰随后的染色。重要的是在使用前通过0.45μm过滤器过滤油红O溶液来去除沉淀物。（3）最好准备新鲜的油红O溶液，并丢弃任何未使用的溶液。（4）除油红O外，苏丹IV是另一种用于脂质，甘油三酯和脂蛋白染色的化合物。然而，油红O逐渐取代了苏丹IV，因为油红O产生的红色更强烈，因此可以使脂肪更容易看到。
4. 在室温（RT）下染色主动脉60分钟。油红O会将富含脂质的斑块染成红色，使其他含有非斑块的区域颜色苍白。
5. 用60%异丙醇室温洗涤一次20分钟。
   注意:过度冲洗会使牙菌斑变色。
6. 用dH ₂ O冲洗主动脉3x5分钟以除去异丙醇。
7. 在立体显微镜下，使用镊子（样式4）和弹簧剪刀轻轻清洁主动脉周围的所有血管周围脂肪组织（图3C，D）。
   注意:染色后清洁主动脉及其分支周围的所有血管周围脂肪组织非常重要，因为油红色O染色的血管周围脂肪组织会产生假背景并干扰斑块形态测量和斑块面积定量。确保不要切除主动脉壁的一部分。在蜡皿中填充dH ₂ O，直到它在清洁过程中覆盖染色的主动脉。这一步需要练习和耐心。
8. 将容器转移到干净的玻璃显微镜载玻片上。
9. 使用连接到光学显微镜的相机获取数字显微照片。保存高分辨率图像，最好是标记图像文件格式（TIFF）（图3E）。
   注意:协议可以在此处暂停。为防止主动脉干燥，将容器转移到1.5 mL微量离心管中，并用1x DPBS填充，直到它覆盖主动脉。储存在4°C。

9. 主动脉安装（图4、 图5）

1. 将容器转移到蜡培养皿中，并填充1x DPBS，直到它覆盖主动脉。
2. 分叉后1-2mm切断主动脉的颈动脉，主动脉弓的锁骨下动脉和腹主动脉的髂动脉。切断肾动脉。（图4A）
3. 用微解剖弹簧剪刀纵向切开主动脉准备沿着内曲率（图4B1）和单独的髂动脉（图4B2）。
4. 用微解剖弹簧剪刀切开主动脉弓的三个分支（即无名，左颈总动脉，左锁骨下动脉），直到内曲率（x标记）的基本水平（图4B3-B8）。
5. 将主动脉平整（管腔面朝上）放在带有细针的蜡皿中，并应用1x DPBS，直到它覆盖主动脉以防止其干燥（图4C）。
   注意:（1）重要的是要使卷起的主动脉平坦，并将其固定在脸上而不拉伸。根据动脉粥样硬化的严重程度，这一步骤将需要几天时间。（2）对于来自Apoe^-/- 或Ldlr^-/- 动物的主动脉，建议将主动脉平整24小时。
6. 用70%乙醇和精密的刮水器清洁玻璃显微镜载玻片（图5A）。
7. 将主动脉转移到干净的玻璃显微镜载玻片中，并将15滴最佳切割温度（OCT）化合物放入另一个干净的玻璃显微镜载玻片上（图5B）。
8. 小心地将带有OCT化合物的玻璃显微镜载玻片放在主动脉上，避免在载玻片上捕获气泡（图5C）。
9. 用样品名称标记载玻片（图5D）。
   注意:安装的 en 面主动脉载玻片可在 4 °C 的湿度室中储存数月。

10. 面部主动脉的影像学检查和病变定量（图 6）

1. 使用连接到光学显微镜的相机获取数字显微照片。保存高分辨率图像，最好是标记图像文件格式（TIFF）（图6A）。
2. 将整个主动脉表面染色的图像传输到配备ImageJ软件的计算机。
3. 在ImageJ中，选择"手绘选择"工具并手动圈出所有油红色O染色的斑块（强烈的红色斑点），同时按"Alt"键（适用于Windows PC）或"Shift"键（适用于Mac）。然后，单击"分析"菜单中的"测量"以在结果窗口中显示病变区域（图6B 左侧）。
   注意:动脉粥样硬化病变的定量有几个缺陷:（1）从步骤8.7中仍然附着在主动脉上的任何小块染色外来脂肪都可能产生虚假的背景并干扰斑块定量;（2）从步骤6.4和8.7中移除部分主动脉壁或损坏主动脉可能会干扰斑块定量;（3）安装后主动脉中形成的气泡和褶皱（步骤9.8）会干扰斑块定量;（4）动脉粥样硬化斑块是一种3D现象，在2D平面上进行的测量可能无法反映斑块的真实范围。除了分析面部主动脉斑块区域外，建议分别分析主动脉根部、臂头动脉、升主动脉和腹主动脉的斑块大小⁸。
4. 圈出主动脉的外边界线，然后单击"分析"菜单中的"测量"，在结果窗口中显示主动脉区域（图6B 右侧）。
5. 将所有测量值导出到 Excel 文件。
6. 计算斑块面积与总主动脉面积的比率，并将该值归一化为总油红O表面积的百分比。
7. 计算8-10 Apoe^-/-和8-10 TGFβR2iSMC-Apoe小鼠的斑块面积比。将数据表示为SEM±平均值（图6C）。
8. 执行未配对的学生 t 检验，以统计分析斑块面积数据与另一组小鼠组的比率。考虑在 p < 0.05 时平均值的差异是显著的。

结果

在该协议中，在HCHF饮食4个月后分析TGFβR2iSMC-Apoe小鼠的动脉粥样硬化病变⁷。除了广泛的动脉粥样硬化外，这些小鼠还发展了胸部和腹部主动脉瘤，如前所述。与Apoe^-/-小鼠相比，TGFβR2iSMC-Apoe小鼠主动脉壁显示严重的动脉粥样硬化，使其难以解剖病变（图2C，D，E）。此外，动脉瘤在肾上主动脉下方特别广泛，高度联想到?...

讨论

载脂蛋白E（Apoe）和低密度脂蛋白受体（Ldlr）缺乏小鼠可用于研究动脉粥样硬化的发展和治疗。研究人员可以使用整个主动脉的油红O染色来评估遗传学和治疗操作对动脉粥样硬化相关疾病的发生，进展和消退的影响⁹。主动脉油红O染色和病变定量是动脉粥样硬化研究的金标准终点。这种技术价格低廉，不需要特殊设备¹⁰。然而，获得高质量的油红O?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta