動脈瘤高脂血症マウスモデルにおけるオイルレッドO染色全大動脈病変のイメージングと解析

要約

このプロトコルは 、マウスにおけるアテローム性動脈硬化負荷を分析するためのステップバイステップの手順を提供する。研究者は、このプロトコルを使用して、異なる動物におけるアテローム性動脈硬化病変の存在量、位置、およびサイズを比較することができる。

要約

アポリポタンパク質E(Apoe)-または低密度リポタンパク質受容体(Ldlr)欠損高脂血症マウスは、アテローム性動脈硬化症研究に最も一般的に使用される2つのモデルである。それらは、アテローム性動脈硬化病変形成に対する様々な遺伝的要因および異なる細胞型の影響を研究し、ならびに新しい治療法の開発をテストするために使用される。大動脈全体の単離、切除、およびオイルレッドO染色されたアテローム性動脈硬化病変の定量化は、アテローム性動脈硬化負荷を評価するために使用される基本的な形態測定法である 。このプロトコルの目標は、Oil Red Oを用いてマウス大動脈のアテローム性動脈硬化病変を解剖、灌流固定、単離、染色、画像化、分析するための最適化された段階的な外科的方法を記述することです。無気球硬化性病変は大動脈樹全体のどこにでも形成され得るので、この大動脈全体オイルレッドO染色法は、大動脈全体およびすべての枝の脂質を含むプラークを単一のマウスで評価するという利点を有する。オイルレッドO染色に加えて、新鮮な単離された全大動脈は、様々なインビトロおよびインビボ実験および細胞単離に使用することができる。

概要

米国における主要な死因である冠状動脈疾患は、通常、動脈壁内部のプラークの蓄積につながるアテローム性動脈硬化症によって引き起こされます¹。高脂血症を起こしやすいApoeおよびLdlr欠損マウスは、アテローム性動脈硬化症およびその合併症の調査および治療法の開発の中心である2,3,4,5。エンフェイス大動脈からのアテローム性動脈硬化病変の定量化は、異なる細胞型における遺伝子操作の影響を評価するための重要なエンドポイント分析である。また、アテローム性動脈硬化性疾患の開始、進行、および退行に影響を与えるように設計された新しい治療法の研究にも役立ちます。アテローム性動脈硬化病変は、大動脈およびその枝(すなわち、胸部の腕頭症、頸動脈および鎖骨下動脈、ならびに横隔膜の下の腎動脈、総腸骨動脈および大腿動脈)のどこにでも形成され得る⁶。アテローム性動脈硬化症の負担と適切な治療の包括的な評価は、異なる場所での疾患負担の評価を必要とし、しばしば見過ごされがちな課題である。

このプロトコルは、未開封の大動脈全体から始まり、顔面調製に進むアテローム性動脈硬化病変の包括的な分析を単一のマウスで行う方法を説明しています。未開封の大動脈全部オイルレッドO染色は、大動脈全体およびその枝における脂質を含んだプラークの迅速で定性的な評価を可能にし、一方、顔面調製は、マウス大動脈におけるアテローム性動脈硬化病変分布の定量的評価を提供する。

この技術は、Apoe-^/-高脂血症バックグラウンド上の平滑筋細胞特異的TGFβR2欠失を有する8週齢のマウスを使用する(MYH11-CreERT2;Tgfbr2f/f;mT/mGf^/f;アポエ-^/-;以下、TGFβR2iSMC-Apoeマウスという)および同腹仔の^Apoe-/-コントロール(MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f;アポエ-^/-;以下、アポエ-^/-マウスという)。動物は、研究材料として高コレステロール高脂肪食(HCHFD)で16週間飼育^{されています7}。研究終了時に、未開封の大動脈全体をオイルレッドOで染色および画像化し、脂質を含んだプラークの定性的評価を行う。大動脈は、顔面準備によって切り開かれ、すべてのアテローム性動脈硬化病変が画像化され、定量化される。このプロトコールは、Apoe-/-またはLdlr^-/-高脂血症マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化病変の発症を研究するために使用でき、一般的な大動脈関連血管生物学アプリケーションに拡張することができます。

プロトコル

mT/mG(ストック番号007676)、およびApoe^-/-(ストック番号002052)マウスをジャクソン研究所から購入した。Myh11-CreERT2マウスは、Stefan Offermanns(ストック番号019079としてジャクソン研究所から入手可能)からの贈り物であった。Tgfbr2fl^/flマウスはハロルド・L・モーゼス(ヴァンダービルト大学)から入手した。すべての動物処置は、イェール大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して実施された。

1. マウス

1. MYH11-CreERT2;mT/mGf/^fを生成する。アポエ-^/-およびMYH11-CreERT2;Tgfbr2f/f;mT/mGf^/f;前述のようにアポエ-^/-マウス⁷。変異株をC57BL/6Jの背景に10世代以上にわたって繁殖させた。
   注:Myh11-CreERT2 Creマウスラインは、血管恒常性および血管病理における平滑筋細胞の役割を研究するための強力なツールを提供する。Cre対立遺伝子はY染色体に挿入される。したがって、雌マウスはこの構築物を発現しない。

2.マウスの遺伝子型決定、タモキシフェン誘導、および高コレステロール高脂肪食摂食

1. マウス耳DNAおよびPCR分析を用いてマウスのジェノタイピングを行う。マウスの耳のDNAは、製造元の指示に従って、血液および組織DNA分離キット(材料表)を使用して単離する必要があります。PCRプライマーを 表1に記載した。
2. 6週齢のMYH11-CreERT2;mT/mGf/^fにおいて、1mg/日のi.p.でタモキシフェン注射によりクレロックス組換えを誘導する;アポエ-^/-およびMYH11-CreERT2;Tgfbr2f/f;mT/mGf^/f;アポエ-^/-雄マウス。
3. 8週齢の雄マウス(タモキシフェン治療後2週間)をHCHF食餌(40%kcal脂肪、1.25%コレステロール、0%コール酸)に16週間置くことにより、アテローム性動脈硬化症を誘導する。

3. 試薬および解剖用具の調製

1. ストックオイルレッドO溶液調製:1gのオイルレッドOをイソプロピルアルコール100mLに溶解する。
2. 作業用オイルレッドO溶液調製:24 mLのストックオイルレッドO溶液と16 mLの_dH2Oを混合します。希釈したオイルレッドOを0.45 μmの滅菌シリンジフィルターでろ過します(溶液は1〜2時間しか適していません)。
3. 60%イソプロピルアルコール調製:60mLのイソプロピルアルコールと40mLの_dH2Oを混合する。
4. 1x DPBS調製物中の4%ホルムアルデヒド:1x DPBSの30mL中の16%ホルムアルデヒド10mLを希釈する。
5. すべての解剖ツールを70%エタノールで洗浄します(図1)。

4. 安楽死(図2A)

1. 安楽死の前にマウスの体重を測定します。
2. ケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射によってマウスを安楽死させる(各ミリリットルは10mg / mLケタミンおよび2mg / mLキシラジンを含む)。
3. マウスを仰臥位(腹側を上向き)に置きます。

5.胸腔および腹腔の開口部および心臓灌流(図2B)

1. 10mLの1x DPBSを含む10mLシリンジを調製する。25G針でキャップ。シリンジは心臓を洗い流すために使用されます。
2. ピンセット(スタイル5)で肌を持ち、腹部の付け根から首のてっぺんまで細かいハサミで切ります。
3. 胸郭の下の腹壁を開きます。
4. ピンセット(スタイル5)で胸骨を持ち上げ、横隔膜を切断し、胸郭を切り取って胸腔を露出させます。
5. 心臓の右心房に小さな切開を行います。
6. 10mLの1x DPBSをゆっくりと注射することによって、頂端左心室穿刺を通して灌流する。一度完全に灌流されると、肝臓と腎臓は淡褐色になります。
7. 不織布のスポンジを使用して、無関係な血液や体液の胸腔をきれいにし、材料を吸収します。

6. 大動脈と枝の単離(図2C)

1. 臓器(肺、肝臓、脾臓、胃腸および生殖器官)を除去し、ピンセット(スタイル5)と細かいはさみを使用して鎖骨を切断し、心臓、腎臓、大動脈はその場にそのまま残します。
   注:心臓や主要な血管を裂かないようにしてください。
2. マウスを実体顕微鏡下に置きます。
3. ピンセット(スタイル4)と春はさみを使用して、腕頭動脈、頸動脈、鎖骨下動脈、腎動脈、総腸骨動脈、大腿動脈を含む大動脈および大動脈枝を解剖する。
   注:大動脈の枝を解剖している間、脱水を避けるために、濡れた不織布のスポンジで大動脈を覆ってください。
4. ピンセット(スタイル4)とスプリングハサミを使用して、大動脈と大動脈の枝の周りの外側脂肪と結合組織を慎重に解剖して除去します。
   注:動脈瘤高脂血症マウスでは炎症が顕著であるため、外来を除去することは困難である。大動脈と大動脈の枝を引き裂いたり、傷をつけたりしないように注意してください。このステップには練習と忍耐が必要です。

7.心臓と大動脈の固定(図2D、E)

1. DPBSの1xに10mLの4%ホルムアルデヒドを含む10mLシリンジを準備する。25G針でキャップ。
   警告: ホルムアルデヒドは危険です。この化学物質を使用する前にMSDSをお読みください。手袋と安全メガネを着用し、ヒュームフード内で希釈液を製造してください。
   注:4%ホルムアルデヒド溶液は時間の経過とともに劣化します。固定には作りたての4%ホルムアルデヒドを使用することが重要です。
2. 4%ホルムアルデヒド10mLをゆっくりと注入することによって、頂端左心室穿刺を通して血管樹を固定する。
   注:ホルムアルデヒド固定は、細胞培養、FACS分析、単一細胞RNAシーケンシング分析など、いくつかの下流アプリケーションに干渉します。大動脈がこれらのアプリケーションのいずれかに使用される場合は、この手順をスキップします。
3. 不織布のスポンジで胸腔をきれいにして、材料を吸収します。
4. ピンセット(スタイル4)で心臓を持ち、マイクロ解剖スプリングハサミを使用して、心臓を大動脈から分離します。
   注:このステップの後にエンフェイスオイルレッドO染色を行うには、エクスビボではなくその場で大動脈を切断し、セクション8に進むことをお勧めします。これにより、エンフェイス大動脈が平らに横たわることが容易になります。
5. ピンセット(スタイル4)とスプリングハサミを使用して、大動脈とその大動脈を頸動脈の上1mmから大腿動脈の端まで隔離して切除します。
6. 容器をワックスペトリ皿または1.5mL微量遠心チューブに移し、大動脈を覆うまで1x DPBSで充填する。
   メモ: プロトコルはここで一時停止できます。

8. オイルレッドO染色と未開封大動脈全部のイメージング(図3)

1. 容器をワックスペトリ皿にピンで留め、細いピンを使用します(図3A)。
2. 容器を1x DPBSで1回すすいでください。
3. 新鮮なオイルレッドO溶液25mLをシャーレに注ぎます(図3B)。
   注:(1)イソプロパノールは危険であり、可燃性液体です。適切な個人用保護具を使用してください。(2)オイルレッドO液は析出しやすい。沈殿した粒子は、その後の染色を妨げる可能性がある。使用前にオイルレッドO溶液を0.45μmのフィルターでろ過して沈殿物を除去することが重要です。(3)新鮮なオイルレッドO溶液を調製し、未使用の溶液を捨てるのが最善です。(4)オイルレッドOに加えて、スーダンIVは脂質、トリグリセリド、およびリポタンパク質の染色に使用される別の化合物である。しかし、オイルレッドOによって生成される赤い色がより強く、したがって脂肪をはるかに見やすくすることができるので、オイルレッドOは徐々にスーダンIVに取って代わりました。
4. 大動脈を室温(RT)で60分間染色する。オイルレッドOは、脂質が豊富なプラークを赤く染め、他の非プラーク含有領域を淡い色のままにします。
5. RTで60%イソプロパノールで20分間1回洗浄する。
   注:過度のすすぎは、プラークを脱汚することができます。
6. 大動脈3xを_dH2Oで5分間すすぎ、イソプロパノールを除去した。
7. 実体顕微鏡下で、ピンセット(スタイル4)およびスプリングハサミ(図3C、D)を使用して、大動脈周辺のすべての血管周囲脂肪組織を穏やかに洗浄する。
   注:オイルレッドO染色された血管周囲脂肪組織は偽のバックグラウンドを生じ、プラーク形態測定およびプラーク面積の定量を妨げる可能性があるため、染色後に大動脈およびその枝の周りのすべての血管周囲脂肪組織を洗浄することが重要です。大動脈壁の一部を取り除かないようにしてください。洗浄中に染色された大動脈を覆うまで、ワックス皿に_dH2Oを入れます。このステップには練習と忍耐が必要です。
8. 容器を清潔なガラス顕微鏡スライドに移します。
9. 光学顕微鏡に接続されたカメラを使用してデジタル顕微鏡写真を取得します。高解像度の画像を、できればタグ付き画像ファイル形式(TIFF)で保存します(図3E)。
   メモ: プロトコルはここで一時停止できます。大動脈の乾燥を防ぐには、容器を1.5mLの微量遠心チューブに移し、大動脈を覆うまで1x DPBSで満たします。4°Cで保存してください。

9. エンフェイス大動脈装着(図4、 図5)

1. 容器をワックスペトリ皿に移し、大動脈を覆うまで1x DPBSで満たします。
2. 大動脈弓の頸動脈、鎖骨下動脈および腹部大動脈の腸骨動脈を1〜2mm切断する。腎動脈を切断する。(図4A)
3. 大動脈製剤を内側の曲率に沿って縦方向に切り開き(図4B1)、単独で腸骨動脈(図4B2)を微小解剖スプリングハサミで切り開きます。
4. 大動脈弓の3つの枝(すなわち、無名、左総頚動脈、左鎖骨下動脈)を、マイクロ解剖スプリングハサミで内側湾曲の基底レベル(xマーク)(図4B3-B8)まで、より大きな曲率に沿って切り開く。
5. 大動脈を平らに(内腔側を上向きに)小さなピンでワックス皿に固定し、乾燥を防ぐために大動脈を覆うまで1倍のDPBSを塗布します(図4C)。
   注:(1)巻き上げた大動脈を平らにし、伸ばさずに顔にピン留めすることが重要です。このステップは、アテローム性動脈硬化症の重症度に応じて数日かかります.(2)Apoe-/-またはLdlr^-/-動物の大動脈の場合、大動脈を24時間平らに固定することをお勧めします(3)プロトコルはここで一時停止できます。
6. ガラス顕微鏡スライドを70%エタノールと繊細な作業ワイパーでクリーニングします(図5A)。
7. 大動脈を清潔なガラス顕微鏡スライドに移し、15滴の最適切断温度(OCT)化合物を別の清潔なガラス顕微鏡スライドに入れます(図5B)。
8. OCTコンパウンドを含むガラス顕微鏡スライドを大動脈の上に慎重に置き、スライドに気泡がトラップされないようにします(図5C)。
9. スライドにサンプル名でラベルを付けます(図5D)。
   注:取り付けられたエンフェイス大動脈スライドは、4°Cの水分チャンバーに数ヶ月間保管することができます。

10. エンフェイス大動脈のイメージングと病変定量(図6)

1. 光学顕微鏡に接続されたカメラを使用してデジタル顕微鏡写真を取得します。高解像度の画像を、好ましくはタグ付き画像ファイル形式(TIFF)で保存する(図6A)。
2. 大動脈全体を染色したエンフェイスの画像をImageJソフトウェアを搭載したコンピュータに転送します。
3. ImageJで、「フリーハンド選択」ツールを選択し、「Alt」キー(Windows PCの場合)または「Shift」キー(Macの場合)を押しながら、オイルレッドO染色されたすべてのプラーク(濃い赤い斑点)を手動で丸で囲みます。次に、「分析」メニューの「測定」をクリックして、結果ウィンドウに病変領域を表示します(図6B 左)。
   注:アテローム性動脈硬化病変の定量化にはいくつかの落とし穴があります:(1)ステップ8.7から大動脈に付着したままの染色された外来脂肪の小片は、誤ったバックグラウンドを生じ、プラークの定量を妨げる可能性があります。(2)ステップ6.4および8.7から大動脈壁の一部を除去したり、大動脈を損傷したりすると、プラークの定量が妨げられる可能性がある。(3)装着後の大動脈に形成された気泡やひだ(工程9.8)がプラーク定量を妨げる可能性がある;(4)アテローム性動脈硬化プラークは3D現象であり、2D平面で行われた測定はプラークの真の程度を反映していない可能性がある。エンフェイス大動脈プラーク領域の解析に加えて、大動脈根、上行大動脈、腹部大動脈のプラークサイズを別々に解析することをお勧めします⁸。
4. 大動脈の外側の境界線を丸で囲み、「分析」メニューの「測定」をクリックすると、結果ウィンドウに大動脈領域が表示されます(図6B 右)。
5. すべての測定値をExcelファイルにエクスポートします。
6. 全大動脈面積からプラーク面積の割合を計算し、その値をオイルレッドO表面積全体に対する割合として正規化する。
7. 8~10匹のApoe-/-マウスおよび8~10匹のTGFβR2iSMC-Apoeマウスにおけるプラーク面積の比率を計算する。SEMで平均±データを提示する(図6C)。
8. 別のマウス群と比較したプラーク面積データの比率の統計分析のために、不対のスチューデントのt検定を実行します。平均値の差をp<0.05で有意と考えてください。

結果

このプロトコールにおいて、TGFβR2iSMC-Apoeマウスにおけるアテローム性動脈硬化病変を、HCHF食餌で4ヶ月後に解析した⁷。広範なアテローム性動脈硬化症に加えて、これらのマウスは、以前に報告されたように、胸部および腹部大動脈瘤の両方を発症した。Apoe-^/-マウスと比較して、TGFβR2iSMC-Apoeマウスは大動脈壁が重度のアテローム性動脈硬化症を示し、病変を...

ディスカッション

アポリポタンパク質E(Apoe)および低密度リポタンパク質受容体(Ldlr)欠損マウスは、アテローム性動脈硬化症の発生および治療の研究に有用である。研究者は、大動脈全体のオイルレッドO染色を用いて、アテローム性動脈硬化症関連疾患の開始、進行、および退行に対する遺伝学および治療操作の影響を評価することができます⁹。大動脈オイルレッドO染色および...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta