הדמיה וניתוח של שמן אדום O מוכתם כולו אבי העורקים נגעים במודל עכבר היפרליפידמיה מפרצת

Summary

פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לניתוח נטל טרשת עורקים בעכברים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את השפע, המיקום והגודל של נגעים טרשת עורקים בבעלי חיים שונים.

Abstract

Apolipoprotein E (Apoe)- או קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (Ldlr)-עכברים היפרליפידמיים לקויים הם שני המודלים הנפוצים ביותר למחקר טרשת עורקים. הם משמשים כדי לחקור את ההשפעה של גורמים גנטיים שונים וסוגי תאים שונים על היווצרות נגע טרשת עורקים, כמו גם לבדוק את הפיתוח של טיפולים חדשים. בידוד, כריתה של אבי העורקים כולו, וכימות של שמן אדום O מוכתם נגעים טרשת עורקים הם שיטות מורפומטריות בסיסיות המשמשות להערכת נטל טרשת עורקים. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה כירורגית ממוטבת, צעד אחר צעד כדי לנתח, perfuse-fix, לבודד, כתם, תמונה ולנתח נגעים טרשת עורקים באב העורקים של העכבר עם שמן אדום O. מכיוון שנגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום בכל עץ אבי העורקים, כל שיטת הכתמת שמן אבי העורקים האדומה O יש את היתרון של הערכת לוחות עמוסי שומנים בדם באבי העורקים כולו וכל הענפים בעכבר אחד. בנוסף להכתמת שמן אדום O, אבי העורקים המלאים המבודדים הטריים יכולים לשמש למגוון של הפריה חוץ גופית וניסויים in vivo ובידודי תאים.

Introduction

מחלת לב כלילית, גורם מוביל לתמותה בארה"ב, נגרמת בדרך כלל על ידי טרשת עורקים, תהליך שמוביל להצטברות של פלאק בתוך קירות ^{עורקים1}. עכברים אפו- ו- Ldlr-נוטים להיפרליפידמיה הם מרכזיים בחקירות של טרשת עורקים וסיבוכיה ופיתוח הטיפולים2,3,4,5. כימות של נגעים טרשת עורקים מאבי העורקים en face הוא ניתוח נקודת קצה חשוב להערכת ההשפעה של מניפולציה גנטית בסוגי תאים שונים. זה גם עוזר ללמוד טיפולים חדשניים שנועדו להשפיע על ייזום מחלות טרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה. נגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום באבי העורקים ובענפיו (כלומר, עורקים ברכיוצפליים, עורקי הראש ותת-סלברי בחזה, כמו גם עורקי כליות, איליאק משותף ועצם הירך מתחת לסרעפת)⁶. הערכה מקיפה של נטל טרשת עורקים וטיפול מתאים דורשת הערכה של נטל המחלה במקומות שונים, אתגר שלעתים קרובות מתעלמים ממנו.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניתוח מקיף של נגעים טרשת עורקים, החל אבי העורקים שלם שלא נפתח וממשיך להכנה פנים, בעכבר אחד. כתמי שמן O אדום של שמן אבי העורקים שלא נפתחו מאפשר הערכה מהירה ואיכותית של לוחות עמוסי שומנים בדם בכל אבי העורקים וענפיו, בעוד הכנה לפנים מספקת הערכה כמותית של התפלגות נגע טרשת עורקים באבי העורקים של העכבר.

הטכניקה משתמשת בעכברים בני 8 שבועות עם מחיקת TGFβR2 ספציפית לתא שריר חלק על הרקע האפו^{-/היפרליפידמי} (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; להלן מכונה ^{עכברי TGFβR2iSMC-Apoe)} ובקרות Apoe^-/- המלטה (MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; להלן מכונה Apoe^-/- עכברים). בעלי החיים נשמרים במשך 16 שבועות על דיאטה עתירת כולסטרול גבוהה שומן (HCHFD) כחומרי ^מחקר7. בסיום המחקר, אבי העורקים המלאים שלא נפתחו מוכתמים ומדומים (כולל כל הענפים העיקריים) עם שמן אדום O להערכה איכותית של לוחות עמוסי שומנים בדם. אבי העורקים נחתכים פתוחים באמצעות הכנה לפנים, וכל הנגעים הטרשת עורקים הם בתמונה ומכמתים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד התפתחות נגע טרשת עורקים ב Apoe^-/- או Ldlr^-/- מודלים עכברים היפרליפידמיה ומורחב ליישומים כלליים הקשורים אבי העורקים ביולוגיה וסקולרית.

Protocol

mT/mG (מלאי מס ' 007676), ו Apoe^-/- (מניות מס '002052) עכברים נרכשו ממעבדת ג'קסון. עכברי Myh11-CreERT2 היו מתנה מסטפן פרובמנס (זמין ממעבדת ג'קסון כמלאי מספר 019079). עכברי Tgfbr2fl^/fl התקבלו מהרולד ל. מוזס (אוניברסיטת ונדרבילט). כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ייל.

1. עכברים

1. לייצר MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/- ו MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- עכברים כפי שתואר ^בעבר7. גזע זנים מוטנטיים לרקע C57BL / 6J במשך יותר מעשרה דורות.
   הערה: קו העכבר Myh11-CreERT2 Cre מספק כלי רב עוצמה לחקר התפקיד של תאי שריר חלקים בהומיאוסטזיס וסקולרי ובפתולוגיה של כלי הדם. אלל Cre מוכנס לתוך כרומוזום Y; לפיכך, עכברות נקבות אינן מבטאות מבנה זה.

2. גנוטיפינג עכבר, אינדוקציה טמוקסיפן, והאכלה דיאטה עתירת כולסטרול עתירת שומן

1. בצע genotyping עכבר באמצעות DNA אוזן העכבר וניתוח PCR. יש לבודד את ה- DNA של אוזן העכבר באמצעות ערכת בידוד ה- DNA של הדם והרקמות (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. פריימרים של PCR מפורטים בטבלה 1.
2. לגרום רקומבינציה Cre-Lox על ידי הזרקת טמוקסיפן ב 1 מ"ג ליום i.p. במשך 5 ימים ב 6 שבועות MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/- ו MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- עכברים זכרים.
3. לגרום טרשת עורקים על ידי הצבת עכברים זכרים בני 8 שבועות (שבועיים לאחר טיפול טמוקסיפן) על דיאטה HCHF (40% שומן קק"ל, 1.25% כולסטרול, 0% חומצה כולית) במשך 16 שבועות.

3. ריאגנטים והכנת כלי ניתוח

1. הכנת פתרון שמן אדום O: להמיס 1 גרם של שמן אדום O ב 100 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל.
2. הכנת פתרון שמן אדום O: לערבב 24 מ"ל של מלאי שמן אדום O פתרון עם 16 מ"ל של _dH2O. לסנן את שמן אדום O מדולל עם מסנני מזרק סטרילי 0.45 מיקרומטר (הפתרון הוא טוב רק עבור 1-2 שעות).
3. 60% הכנת אלכוהול איזופרופיל: לערבב 60 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל עם 40 מ"ל של _dH2O.
4. 4% פורמלדהיד בהכנה DPBS 1x: לדלל 10 מ"ל של 16% פורמלדהיד ב 30 מ"ל של 1x DPBS.
5. נקו את כל כלי הניתוח עם 70% אתנול (איור 1).

4. המתת חסד (איור 2א)

1. מדוד את משקל העכבר לפני המתת חסד.
2. המתת חסד לעכבר על ידי הזרקה תוך-פריטונית של קטמין וקסילזין (כל מיליליטר מכיל 10 מ"ג / מ"ל קטמין ו 2 מ"ג / מ"ל xylazine).
3. מניחים את העכבר בתנוחה עלובה (צד הבטן עם הפנים כלפי מעלה).

5. פתיחת חלל החזה והבטן וזלוף הלב (איור 2B)

1. הכן מזרק 10 מ"ל עם 10 מ"ל של 1x DPBS. כובע עם מחט 25 גרם. המזרק ישמש כדי לשטוף את הלב.
2. החזק את העור עם פינצטה (סגנון 5) וחתוך עם מספריים עדינים מבסיס הבטן לחלק העליון של הצוואר.
3. פתח את דופן הבטן מתחת לבית החזה.
4. הרימו את עצם החזה עם פינצטה (סגנון 5) וחתכו את הסרעפת, ואז חתכו את בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה.
5. לעשות חתך קטן באטריום הימני של הלב.
6. יש לעיין דרך ניקוב החדר השמאלי האפילי על ידי הזרקה איטית של 10 מ"ל של 1x DPBS. לאחר perfused ביסודיות, הכבד והכליות להיות חום בהיר בצבע.
7. נקו את חלל החזה של דם ונוזלים זרים באמצעות ספוג לא ארוג כדי לספוג את החומר.

6. בידוד אבי העורקים והענפים (איור 2C)

1. הסר איברים (כלומר, ריאות, כבד, טחול, ואיברי מערכת העיכול והרבייה) וחתוך את עצם הבריח באמצעות פינצטה (סגנון 5) ומספריים עדינים תוך השארת הלב, הכליות ואבי העורקים שלמים במקום.
   הערה: הקפד לא לחתוך את הלב או כל כלי דם גדולים.
2. מקם את העכבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
3. נתח ענפי אבי העורקים ואבי העורקים כולל עורק ברכיוסקופלי, עורקי עורקים ראשיים, עורקים תת-בריחיים, עורקי כליות, עורקי איליאק נפוצים ועורקים הירך באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים קפיציות.
   הערה: לכסות את אבי העורקים עם ספוג רטוב, לא ארוג, כדי למנוע התייבשות בעת ניתוח ענפי אבי העורקים.
4. לנתח ולהסיר בזהירות שומן הרפתקני ורקמת חיבור סביב ענפי אבי העורקים ואבי העורקים באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים קפיץ.
   הערה: מאז דלקת בולטת בעכבר היפרליפידמיה מפרצת, קשה להסיר אדונטיציה. היזהרו לא לקרוע או לחתוך את ענפי אבי העורקים ואבי העורקים. צעד זה דורש תרגול וסבלנות.

7. תיקון הלב ואבי העורקים (איור 2D,ה)

1. הכן מזרק 10 מ"ל עם 10 מ"ל של 4% פורמלדהיד ב 1x של DPBS. כובע עם מחט 25 גרם.
   זהירות: פורמלדהיד מסוכן. קרא את ה- MSDS לפני שתעבוד עם הכימיקל הזה. יש ללבוש כפפות ומשקפי בטיחות ולייצר את פתרונות הדילול בתוך מכסה המנוע של האדים.
   הערה: פתרון פורמלדהיד של 4% מתפרק עם הזמן. חשוב להשתמש 4% פורמלדהיד טרי עבור קיבעון.
2. לתקן את עץ כלי הדם באמצעות ניקוב חדר שמאלי apical על ידי הזרקה איטית 10 מ"ל של 4% פורמלדהיד.
   הערה: קיבעון פורמלדהיד מפריע למספר יישומים במורד הזרם, כגון תרבית תאים, ניתוח FACS וניתוח ריצוף RNA חד-תאי. דלג על שלב זה אם אבי העורקים ישמש עבור כל אחד מיישומים אלה.
3. נקו את חלל החזה של כל נוזל חיצוני עם ספוג לא ארוג כדי לספוג את החומר.
4. הפרד את הלב מאבי העורקים על ידי החזקת הלב עם פינצטה (סגנון 4) ושימוש במספריים קפיץ מיקרו-לנתח.
   הערה: כדי לבצע en face שמן אדום O כתמים לאחר שלב זה, מומלץ לחתוך את אבי העורקים פתוח במקום ex vivo ולהמשיך לסעיף 8. זה מקל על אבי העורקים en face לשכב שטוח.
5. לבודד ולחתוך את אבי העורקים ואת הראשי שלה מ 1 מ"מ מעל העורק הראשי עד סוף עורק הירך באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים באביב.
6. מעבירים את הכלי לצלחת פטרי שעווה או צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וממלאים ב- DPBS 1x עד שהוא מכסה את אבי העורקים.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

8. כתמי שמן אדום O והדמיה של אבי העורקים שלם שלא נפתח (איור 3)

1. הצמידו את הכלי לצלחת פטרי שעווה באמצעות סיכות מינוטין (איור 3A).
2. לשטוף את הכלי פעם אחת עם 1x DPBS.
3. יוצקים 25 מ"ל של תמיסת שמן אדום O טרייה לצלחת הפטרי (איור 3B).
   הערה: (1) איזופרופנול מסוכן ונוזל דליק. השתמש בציוד מגן אישי מתאים. (2) פתרון שמן אדום O יכול בקלות לזרז. החלקיקים המואצים עלולים להפריע לכתמים הבאים. חשוב להסיר את המשקעים על ידי סינון פתרון שמן אדום O באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר לפני השימוש. (3) עדיף להכין פתרון שמן אדום O טרי להשליך כל פתרון שאינו בשימוש. (4) בנוסף שמן אדום O, סודאן הרביעי הוא תרכובת כימית נוספת המשמשת להכתמת שומנים, טריגליצרידים, ליפופרוטאינים. עם זאת, שמן אדום O החליף בהדרגה סודאן הרביעית כי הצבע האדום המיוצר על ידי שמן אדום O הוא אינטנסיבי יותר ובכך יכול לעשות שומן הרבה יותר קל לראות.
4. מכתימים את אבי העורקים במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שמן אדום O יהיה להכתים פלאק עשיר בשומנים אדום, משאיר אחרים שאינם פלאק המכיל אזורים חיוורים בצבע.
5. לשטוף פעם אחת במשך 20 דקות עם 60% איזופרופנול ב RT.
   הערה: שטיפה יתר יכולה לבטל את הטיית הלוח.
6. לשטוף את אבי העורקים 3x עם _dH2O במשך 5 דקות כדי להסיר איזופרופנול.
7. תחת סטריאומיקרוסקופ, נקו בעדינות את כל רקמת השומן הפרי-וסקולרית סביב אבי העורקים באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים קפיציות (איור 3C,D).
   הערה: חשוב לנקות את כל רקמת השומן הפרי-וסקולרית סביב אבי העורקים וענפיו לאחר הכתמה, מכיוון שרקמת שומן פרי וסקולרית מוכתמת בשמן אדום O יכולה להניב רקע כוזב ולהפריע למורפומטריה פלאק וכימות אזור פלאק. הקפידו לא להסיר חלק מקיר אבי העורקים. ממלאים את צלחת השעווה ב- _dH2O עד שהיא מכסה את אבי העורקים המוכתם במהלך הניקוי. צעד זה דורש תרגול וסבלנות.
8. מעבירים את הכלי למגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה.
9. השג מיקרוגרפים דיגיטליים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ אור. שמור תמונות ברזולוציה גבוהה, רצוי בתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIFF) (איור 3E).
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כדי למנוע את אב העורקים להתייבש, להעביר את הכלי לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולמלא עם 1x DPBS עד שהוא מכסה את אבי העורקים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F).

9. הרכבה של אבי העורקים (איור 4, איור 5)

1. מעבירים את כלי הדם לצלחת פטרי שעווה וממלאים ב- DPBS 1x עד שהוא מכסה את אבי העורקים.
2. חתוך את עורקי הראש, העורקים התת-בריחיים של קשת אבי העורקים ועורקי איליאק באבי העורקים בבטן 1-2 מ"מ לאחר bifurcations. תנתק את עורקי הכליות. (איור 4A)
3. חיתוך אורך של הכנת אבי העורקים לאורך העקמומיות הפנימית (איור 4B1) ועורקי איליאק לבדם (איור 4B2) עם מספריים קפיציים זעירים.
4. חותכים את שלושת הענפים של קשת אבי העורקים (כלומר, innominate, עורק ראשי משותף שמאל, עורק תת-בריחי שמאל) לאורך העקמומיות הגדולה יותר עד לרמת הבסיס של העקמומיות הפנימית (סימן x) (איור 4B3–B8) עם מספריים קפיץ מיקרו-ניתוח.
5. הצמידו את אבי העורקים השטוח (לומן בצד עם הפנים כלפי מעלה) בצלחת שעווה עם סיכות מינוטין והחלו 1x DPBS עד שהוא מכסה את אבי העורקים כדי למנוע ממנו להתייבש (איור 4C).
   הערה: (1) חשוב להפוך את אבי העורקים המגולגל שטוח ולהצמיד אותו לפנים מבלי למתוח. צעד זה ייקח כמה ימים בהתאם לחומרת טרשת עורקים. (2) עבור אבי העורקים מ Apoe^-/- או Ldlr^-/- בעלי חיים, מומלץ להצמיד את אבי העורקים שטוח במשך 24 שעות. (3) הפרוטוקול ניתן להשהות כאן.
6. נקו את מגלשות המיקרוסקופ מזכוכית עם 70% אתנול ומגבי משימות עדינים (איור 5A).
7. העבירו את אבי העורקים למגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה והניחו 15 טיפות של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה נוספת (איור 5B).
8. הניחו בזהירות את שקופית מיקרוסקופ הזכוכית עם תרכובת OCT מעל אבי העורקים והימנעו מלתפוס בועות אוויר בשקופית (איור 5C).
9. תייג/י את השקופיות בשמות לדוגמה (איור 5D).
   הערה: ניתן לאחסן את מגלשות אבי העורקים המותקנות בתא הלחות בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך מספר חודשים.

10. כימות הדמיה ונגע של אבי העורקים en face (איור 6)

1. השג מיקרוגרפים דיגיטליים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ אור. שמור תמונות ברזולוציה גבוהה, רצוי בתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIFF) (איור 6A).
2. העבר תמונות של אבי העורקים המוכתם בפנים למחשב המצויד בתוכנת ImageJ.
3. ב- ImageJ, בחר בכלי "בחירה חופשית" וסובב את כל הלוח המוכתם בשמן אדום O באופן ידני (כתמים אדומים עזים) בעת הקשה על מקש "Alt" (עבור Windows PC) או על מקש "Shift" (עבור Mac). לאחר מכן, לחצו על "מדידה" בתפריט "נתח" כדי להציג אזורי נגע בחלון התוצאה (איור 6B משמאל).
   הערה: ישנן מספר מלכודות של כימות של נגעים טרשת עורקים: (1) כל חתיכות קטנות של שומן הרפתקני מוכתם שנותר מחובר לאבי העורקים משלב 8.7 יכול להניב רקע כוזב ולהפריע לכימות פלאק; (2) הסרת חלק מקיר אבי העורקים או פגיעה באבי העורקים משלבים 6.4 ו-8.7 עלולים להפריע לכימות הפלאק; (3) בועות וקפלים שנוצרו באבי העורקים לאחר ההרכבה (שלב 9.8) יכולים להפריע לכימות פלאק; ו-(4) פלאק טרשת עורקים הוא תופעה תלת-ממדית, ומדידות המבוצעות במישור דו-ממדי עשויות שלא לשקף את ההיקף האמיתי של הלוח. בנוסף לניתוח של אזור פלאק אבי העורקים en face, מומלץ לנתח את גודל הפלאק בשורש אבי העורקים, בעורק brachiocephalic, אבי העורקים העולה ואבי העורקים בבטן ^בנפרד8.
4. הקיפו את קו הגבול החיצוני של אבי העורקים ולחצו על "מדידה" בתפריט "נתח" כדי להציג את אזור אבי העורקים בחלון התוצאה (איור 6B מימין).
5. יצא את כל המידות לקובץ Excel.
6. חשב את היחס בין שטח הפלאק מאזור אבי העורקים הכולל ונורמל את הערך כאחוז משטח השטח הכולל של שמן אדום O.
7. חשב את היחס של שטח פלאק ב 8-10 Apoe^-/- ו 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe עכברים. הצג את הנתונים כממוצע ± SEM (איור 6C).
8. בצע בדיקת t של סטודנט שלא תוקן לניתוח סטטיסטי של היחס בין נתוני אזור פלאק בהשוואה לקבוצת עכברים אחרת. שקול את ההבדלים בערכים ממוצעים כמשמעותיים ב- p < 0.05.

תוצאות

בפרוטוקול זה, נגעים טרשת עורקים בעכברים TGFβR2iSMC-Apoe נותחו לאחר 4 חודשים בדיאטת HCHF7. בנוסף לטרשת עורקים נרחבת, עכברים אלה פיתחו מפרצות אבי העורקים בבית החזה ובבטן, כפי שדווח בעבר. בהשוואה לעכברים אפו^-/- עכברים, קירות אבי העורקים של עכברי TGFβR2iSMC-Apoe הראו טרשת עורקים חמורה, ?...

Discussion

Apolipoprotein E (Apoe) ו צפיפות נמוכה ליפופרוטאין קולטן (Ldlr) עכברים לקויים שימושיים לחקר פיתוח וטיפול של טרשת עורקים. חוקרים יכולים להעריך את ההשפעה של גנטיקה ומניפולציות טיפוליות על ייזום מחלות הקשורות לטרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה באמצעות מכתם שמן אדום O של אבי העורקים ^כולו

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta