Визуализация и анализ поражений всей аорты с масляным красным O-окрашиванием в мышиной модели гиперлипидемии аневризмы

Резюме

Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру анализа атеросклеротической нагрузки у мышей. Исследователи могут использовать этот протокол для сравнения обилия, местоположения и размера атеросклеротических поражений у разных животных.

Аннотация

Аполипопротеин Е (Apoe) - или низкоплотные липопротеиновые рецепторы (Ldlr) - гиперлипидемические мыши являются двумя наиболее часто используемыми моделями для исследований атеросклероза. Они используются для изучения влияния различных генетических факторов и различных типов клеток на формирование атеросклеротического поражения, а также для проверки разработки новых методов лечения. Выделение, иссечение всей аорты и количественная оценка атеросклеротических поражений, окрашенных Oil Red O, являются основными морфометрическими методами, используемыми для оценки атеросклеротической нагрузки. Целью этого протокола является описание оптимизированного, пошагового хирургического метода рассечения, перфьюзирования-фиксации, выделения, окрашивания, изображения и анализа атеросклеротических поражений у аорты мышей с Oil Red O. Поскольку атеросклеротические поражения могут образовываться в любом месте всего дерева аорты, этот метод окрашивания всей аорты Oil Red O имеет преимущество оценки липидных бляшек во всей аорте и всех ветвях у одной мыши. В дополнение к окрашиванию Oil Red O, свежеизолированная цельная аорта может быть использована для различных экспериментов in vitro и in vivo и изоляции клеток.

Введение

Ишемическая болезнь сердца, ведущая причина смертности в США, обычно вызвана атеросклерозом, процессом, который приводит к накоплению бляшек внутри артериальных ^{стенок1}. Склонные к гиперлипидемии мыши с дефицитом apoe- и Ldlr занимают центральное место в исследованиях атеросклероза и его осложнений и разработке методов лечения2,3,4,5. Количественная оценка атеросклеротических поражений от аорты лица является важным анализом конечных точек для оценки влияния генетических манипуляций на различные типы клеток. Это также помогает изучать новые методы лечения, предназначенные для воздействия на инициацию, прогрессирование и регрессию атеросклеротического заболевания. Атеросклеротические поражения могут образовываться в любом месте аорты и ее ветвей (т.е. брахиоцефальных, сонных и подключичных артерий в грудной клетке, а также почечных, общих подвздошных и бедренных артерий ниже диафрагмы)⁶. Всесторонняя оценка бремени атеросклероза и соответствующая терапия требуют оценки бремени болезней в разных местах, что часто упускается из виду.

Этот протокол описывает, как выполнить комплексный анализ атеросклеротических поражений, начиная с нераскрытой всей аорты и заканчивая подготовкой лица, на одной мыши. Неоткрытое окрашивание всей аорты Oil Red O позволяет быстро и качественно оценить липидные бляшки во всей аорте и ее ветвях, а подготовка лица обеспечивает количественную оценку распространения атеросклеротического поражения в аорте мыши.

Метод использует 8-недельных мышей с гладкомышечной клеточной специфической делецией TGFβR2 на гиперлипидемическом фоне Apoe^-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Апоэ^-/-; далее именуемые TGFβR2iSMC-Apoe mice) и пометные apoe^-/- контрольные элементы (MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Апоэ^-/-; далее именуемые обезьянами Apoe^-/-mice). Животные содержатся в течение 16 недель на диете с высоким содержанием холестерина и высоким содержанием жиров (ГХГФД) в качестве материалов ^{исследования7}. В конце исследования неоткрытые целые аорты окрашиваются и визуализируются (включая все основные ветви) Oil Red O для качественной оценки липидных бляшек. Аорта разрезается с помощью препарата для лица, и все атеросклеротические поражения визуализируются и количественно оцениваются. Этот протокол может быть использован для изучения развития атеросклеротического поражения в моделях мышей с гиперлипидемией Apoe^-/- или Ldlr^-/- и распространен на общие приложения сосудистой биологии, связанные с аортой.

протокол

Мыши mT/mG (инвентарный No 007676) и Apoe^-/- (stock No 002052) были приобретены в лаборатории Джексона. Мыши Myh11-CreERT2 были подарком от Стефана Офферманнса (доступны в лаборатории Джексона в качестве запаса No 019079). Tgfbr2fl^/fl мышей были получены от Гарольда Л. Мозеса (Университет Вандербильта). Все процедуры для животных выполнялись с использованием протоколов, одобренных Комитетом по уходу и использованию животных Йельского университета.

1. Мыши

1. Производят MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/- и MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Мыши Apoe^-/- как описано ^ранее7. Размножайте мутантные штаммы на фоне C57BL/6J на протяжении более десяти поколений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линия мышей Myh11-CreERT2 Cre предоставляет мощный инструмент для изучения роли гладкомышечных клеток в сосудистом гомеостазе и сосудистой патологии. Аллель Cre вставляется в Y-хромосому; таким образом, самки мышей не выражают эту конструкцию.

2. Мышечное генотипирование, индукция тамоксифена и диета с высоким содержанием холестерина и высоким содержанием жиров

1. Выполните генотипирование мыши с использованием ДНК уха мыши и ПЦР-анализа. ДНК уха мыши должна быть выделена с помощью набора для изоляции ДНК крови и тканей (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Праймеры ПЦР перечислены в таблице 1.
2. Индуцировать рекомбинацию Cre-Lox путем инъекции тамоксифена при 1 мг/сут в/п. в течение 5 дней у 6-недельного MYH11-CreERT2;mT/мГф^/ф; Apoe^-/- и MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- самцы мышей.
3. Индуцировать атеросклероз, помещая 8-недельных самцов мышей (через 2 недели после лечения тамоксифеном) на диету ГХГФ (40% ккал жира, 1,25% холестерина, 0% холевой кислоты) в течение 16 недель.

3. Подготовка реагентов и инструмента для рассечения

1. Приготовление раствора Масло Красное О: растворить 1 г Масла Красного О в 100 мл изопропилового спирта.
2. Приготовление рабочего раствора Oil Red O: смешайте 24 мл раствора Oil Red O с 16 мл _dH2O. Фильтруйте разбавленное масло Red O стерильными шприцевыми фильтрами 0,45 мкм (раствор хорош только в течение 1–2 ч).
3. Приготовление 60% изопропилового спирта: смешайте 60 мл изопропилового спирта с 40 мл _dH2O.
4. 4% формальдегид в 1x препарате DPBS: развести 10 мл 16% формальдегида в 30 мл 1x DPBS.
5. Очистите все инструменты для рассечения 70% этанолом (рисунок 1).

4. Эвтаназия (рисунок 2А)

1. Измерьте вес мыши перед эвтаназией.
2. Эвтаназить мышь путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина (каждый миллилитр содержит 10 мг/мл кетамина и 2 мг/мл ксилазина).
3. Поместите мышь в положение лежа на спине (брюшкой лицевой стороной вверх).

5. Вскрытие грудной и брюшной полости и перфузия сердца (рисунок 2В)

1. Приготовьте шприц объемом 10 мл с 10 мл 1x DPBS. Колпачок с иглой 25 г. Шприц будет использоваться для промывания сердца.
2. Поднимите кожу пинцетом (стиль 5) и вырежьте тонкими ножницами от основания живота до верхней части шеи.
3. Откройте брюшную стенку ниже грудной клетки.
4. Поднимите брюшину пинцетом (стиль 5) и отрежьте диафрагму, затем отрежьте грудную клетку, чтобы обнажить грудную полость.
5. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии сердца.
6. Перфьюзировать через апикальную пункцию левого желудочка путем медленного введения 10 мл 1x DPBS. После тщательной перфузии печень и почки приобретают светло-коричневый цвет.
7. Очистите грудную полость от посторонней крови и жидкости с помощью нетканой губки для впитывания материала.

6. Выделение аорты и ветвей (рисунок 2С)

1. Удалите органы (например, легкие, печень, селезенку, желудочно-кишечные и репродуктивные органы) и разрежьте ключицу с помощью пинцета (стиль 5) и тонких ножниц, оставив сердце, почки и аорту нетронутыми in situ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не разрываете сердце или какие-либо крупные кровеносные сосуды.
2. Поместите мышь под стереомикроскоп.
3. Рассекать ветви аорты и аорты, включая брахиоцефальную артерию, сонные артерии, подключичные артерии, почечные артерии, общие подвздошные артерии и бедренные артерии с помощью пинцета (стиль 4) и пружинных ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте аорту влажной нетканой губкой, чтобы избежать обезвоживания при рассечении ветвей аорты.
4. Тщательно рассекните и удалите адвентитную жировую и соединительную ткань вокруг аорты и ветвей аорты с помощью пинцета (стиль 4) и пружинных ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку воспаление заметно у мыши с гиперлипидемией аневризмы, трудно удалить адвентицию. Будьте осторожны, чтобы не порвать и не повредить аорту и ветви аорты. Этот шаг требует практики и терпения.

7. Фиксация сердца и аорты (рисунок 2D,E)

1. Приготовьте шприц объемом 10 мл с 10 мл 4% формальдегида в 1x DPBS. Колпачок с иглой 25 г.
   ВНИМАНИЕ: Формальдегид опасен. Прочитайте MSDS перед работой с этим химическим веществом. Надевайте перчатки и защитные очки и производите растворы для разбавления внутри вытяжного капюшона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 4% раствор формальдегида со временем разлагается. Важно использовать свежеприготовленный 4% формальдегид для фиксации.
2. Зафиксируйте сосудистое дерево через апикальную пункцию левого желудочка путем медленного введения 10 мл 4% формальдегида.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация формальдегида препятствует нескольким последующим приложениям, таким как клеточная культура, анализ FACS и анализ секвенирования одноклеточной РНК. Пропустите этот шаг, если аорта будет использоваться для любого из этих приложений.
3. Очистите грудную полость от любой посторонней жидкости нетканой губкой для впитывания материала.
4. Отделите сердце от аорты, удерживая сердце пинцетом (стиль 4) и используя пружинные ножницы для микропарирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить окрашивание лица маслом Red O после этого этапа, рекомендуется разрезать аорту открытой in situ вместо ex vivo и перейти к разделу 8. Это позволяет легко укладывать анальную аорту.
5. Изолируйте и иссечь аорту и ее большую часть от 1 мм над сонной артерией до конца бедренной артерии с помощью пинцета (стиль 4) и пружинных ножниц.
6. Переложите сосуд в восковую чашку Петри или микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и заполните 1x DPBS до тех пор, пока она не покроет аорту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.

8. Окрашивание маслом Red O и визуализация нераскрытой всей аорты (рисунок 3)

1. Прикрепите сосуд к восковой чашке Петри с помощью миниатюрных булавок (рисунок 3А).
2. Промойте сосуд один раз с помощью 1x DPBS.
3. Налейте 25 мл свежего раствора Oil Red O в чашку Петри (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Изопропанол опасен и является легковоспламеняющейся жидкостью. Используйте надлежащие средства индивидуальной защиты. (2) Раствор Oil Red O может легко выпадать в осадок. Осажденные частицы могут мешать последующему окрашиванию. Важно удалить осадок, отфильтровав раствор Oil Red O через фильтр 0,45 мкм перед использованием. (3) Лучше всего приготовить свежий раствор Oil Red O и отказаться от любого неиспользованного раствора. (4) В дополнение к Oil Red O, Судан IV является еще одним химическим соединением, используемым для окрашивания липидов, триглицеридов и липопротеинов. Тем не менее, Oil Red O постепенно заменил Судан IV, потому что красный цвет, производимый Oil Red O, более интенсивный и, таким образом, может сделать жир намного легче увидеть.
4. Окрашивают аорту в течение 60 мин при комнатной температуре (RT). Масло Red O окрашивает богатый липидами налет в красный цвет, оставляя другие области, не содержащие бляшек, бледными по цвету.
5. Промыть один раз в течение 20 мин с 60% изопропанолом на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное ополаскивание может ослабить зубной налет.
6. Промыть аорту 3x _dH2O в течение 5 мин, чтобы удалить изопропанол.
7. Под стереомикроскопом аккуратно очистите всю периваскулярную жировую ткань вокруг аорты с помощью пинцета (стиль 4) и пружинных ножниц (рисунок 3C, D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно очистить всю периваскулярную жировую ткань вокруг аорты и ее ветвей после окрашивания, потому что периваскулярная жировая ткань, окрашенная Oil Red O, может давать ложный фон и мешать морфометрии бляшек и количественной оценке области бляшек. Убедитесь, что не удаляется часть стенки аорты. Наполните восковую посуду _dH2O до тех пор, пока она не покроет окрашенную аорту во время очистки. Этот шаг требует практики и терпения.
8. Перенесите сосуд на чистый стеклянный слайд микроскопа.
9. Получайте цифровые микроснимки с помощью камеры, подключенной к световому микроскопу. Сохраняйте изображения с высоким разрешением, предпочтительно в формате файла изображения с тегами (TIFF) (рисунок 3E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Чтобы предотвратить высыхание аорты, перенесите сосуд в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и заполните 1x DPBS, пока она не покроет аорту. Хранить при температуре 4 °C.

9. Крепление аорты на лицевой стороне (рисунок 4, рисунок 5)

1. Переложите сосуд в восковую чашку Петри и наполните 1x DPBS, пока он не покроет аорту.
2. Разорвать сонные, подключичные артерии дуги аорты и подвздошные артерии в брюшной аорте на 1–2 мм после бифуркации. Разрыв почечных артерий. (Рисунок 4А)
3. Продольно разрезают препарат аорты по внутренней кривизне (рис. 4В1) и отдельно подвздошные артерии (рис. 4В2) микрорассеченными пружинными ножницами.
4. Разрежьте три ветви дуги аорты (т.е. безымянную, левую общую сонную, левую подключичную артерию) вдоль большей кривизны до базового уровня внутренней кривизны (x-mark) (рисунок 4B3–B8) микропарирующими пружинными ножницами.
5. Закрепите плоскую аорту (просвет стороной вверх) в восковой посуде с помощью миниатюрных булавок и нанесите 1x DPBS до тех пор, пока она не покроет аорту, чтобы предотвратить ее высыхание (рисунок 4C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Важно сделать свернутую аорту плоской и закрепить ее по лицу без растяжения. Этот шаг займет несколько дней в зависимости от тяжести атеросклероза. (2) Для аорт от животных Apoe^-/- или Ldlr^-/- рекомендуется закрепить плоскую аорту на 24 ч. (3) Здесь протокол может быть приостановлен.
6. Очистите стекла микроскопа 70% этанолом и деликатными стеклоочистителями (рисунок 5А).
7. Переместите аорту в прозрачный стеклянный микроскоп и поместите 15 капель соединения оптимальной температуры резания (OCT) на другой прозрачный стеклянный микроскоп (рисунок 5B).
8. Осторожно поместите стеклянный микроскоп с соединением OCT над аортой и избегайте захвата пузырьков воздуха на слайде (рисунок 5C).
9. Пометьте слайды именами образцов (рисунок 5D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установленные на поверхности аорты слайды могут храниться во влагооб камере при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.

10. Визуализация и количественная оценка поражения аорты лица (рисунок 6)

1. Получайте цифровые микроснимки с помощью камеры, подключенной к световому микроскопу. Сохраняйте изображения с высоким разрешением, предпочтительно в формате файла изображения с тегами (TIFF) (рисунок 6A).
2. Перенесите изображения всей аорты, окрашенной в лицо, на компьютер, оснащенный программным обеспечением ImageJ.
3. В ImageJ выберите инструмент «Выделение от руки» и вручную обведите все масляные красные O-окрашенные налеты (интенсивные красные пятна) при нажатии клавиши «Alt» (для ПК с Windows) или «Shift» (для Mac). Затем нажмите «Измерить» в меню «Анализ», чтобы отобразить области поражения в окне результатов (рисунок 6B слева).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько подводных камней количественной оценки атеросклеротических поражений: (1) любые небольшие кусочки окрашенного адвентициального жира, которые остались прикрепленными к аорте со стадии 8.7, могут давать ложный фон и мешать количественной оценке бляшек; (2) удаление части стенки аорты или повреждение аорты со стадий 6.4 и 8.7 может препятствовать количественной оценке зубного налета; (3) пузырьки и складки, образующиеся в аорте после монтажа (этап 9.8), могут препятствовать количественной оценке зубного налета; и (4) атеросклеротическая бляшка является 3D-явлением, и измерения, выполненные в 2D-плоскости, могут не отражать истинную степень бляшки. Помимо анализа области бляшек аорты на лице, рекомендуется отдельно анализировать размер бляшек в корне аорты, брахиоцефальной артерии, восходящей аорте и брюшной ^аорте8.
4. Обведите внешнюю линию границы аорты и нажмите «Измерить» в меню «Анализ», чтобы отобразить область аорты в окне результатов (рисунок 6B справа).
5. Экспортируйте все измерения в файл Excel.
6. Рассчитайте отношение площади бляшек от общей площади аорты и нормализуйте значение в процентах от общей площади поверхности Oil Red O.
7. Рассчитайте соотношение площади бляшек у 8–10 apoe^-/- и 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe мышей. Представьте данные в среднем ± SEM (рисунок 6C).
8. Выполните непарный t-тест Student для статистического анализа соотношения данных о площади бляшек по сравнению с другой группой мышей. Рассмотрим различия в средних значениях как значимые при p < 0,05.

Результаты

В этом протоколе атеросклеротические поражения у мышей TGFβR2iSMC-Apoe анализировали через 4 месяца на диете ГХГФ7. В дополнение к обширному атеросклерозу, у этих мышей развились как грудные, так и брюшные аневризмы аорты, как сообщалось ранее. По сравнению с мышами Apoe^-/-

Обсуждение

Мыши с дефицитом аполипопротеина Е (Apoe) и рецептора липопротеинов низкой плотности (Ldlr) полезны для изучения развития и лечения атеросклероза. Исследователи могут оценить влияние генетики и терапевтических манипуляций на начало, прогрессирование и регрессию заболеваний, свя...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta