Imagerie et analyse de lésions de l’aorte entière o-colorée à l’huile dans un modèle murin d’hyperlipidémie d’anévrisme

Résumé

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour analyser la charge athéroscléreuse chez la souris. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour comparer l’abondance, l’emplacement et la taille des lésions athérosclérotiques chez différents animaux.

Résumé

Les souris hyperlipidémiques déficientes en apolipoprotéines E (Apoe) ou en récepteurs de lipoprotéines de basse densité (Ldlr) sont les deux modèles les plus couramment utilisés pour la recherche sur l’athérosclérose. Ils sont utilisés pour étudier l’impact de divers facteurs génétiques et de différents types de cellules sur la formation de lésions athérosclérotiques et pour tester le développement de nouvelles thérapies. L’isolement, l’excision de l’aorte entière et la quantification des lésions athérosclérotiques colorées en O rouge huile sont des méthodes morphométriques de base utilisées pour évaluer la charge athéroscléreuse. L’objectif de ce protocole est de décrire une méthode chirurgicale optimisée, étape par étape, pour disséquer, perfuser-fixer, isoler, colorier, imager et analyser les lésions athérosclérotiques dans les aortes de souris avec de l’huile rouge O. Parce que les lésions athérosclérotiques peuvent se former n’importe où dans tout l’arbre aortique, toute cette méthode de coloration à l’huile d’aorte Red O a l’avantage d’évaluer les plaques chargées de lipides dans toute l’aorte et toutes les branches d’une seule souris. En plus de la coloration Oil Red O, des aortes entières isolées fraîches peuvent être utilisées pour une variété d’expériences in vitro et in vivo et d’isolements cellulaires.

Introduction

La maladie coronarienne, l’une des principales causes de mortalité aux États-Unis, est généralement causée par l’athérosclérose, un processus qui conduit à l’accumulation de plaque à l’intérieur des parois ^{artérielles1}. Les souris déficientes en Apoe et en Ldlr sujettes à l’hyperlipidémie sont au cœur des investigations sur l’athérosclérose et ses complications et le développement de thérapies2,3,4,5. La quantification des lésions athérosclérotiques d’une aorte en face est une analyse de critère importante pour évaluer l’impact de la manipulation génétique dans différents types de cellules. Il aide également à étudier de nouvelles thérapies conçues pour affecter l’initiation, la progression et la régression de la maladie athéroscléreuse. Des lésions athérosclérotiques peuvent se former n’importe où dans l’aorte et ses branches (c.-à-d. les artères brachiocéphales, carotides et sous-clavières dans la poitrine, ainsi que les artères rénales, iliaques et fémorales communes sous le diaphragme)⁶. Une évaluation complète du fardeau de l’athérosclérose et un traitement approprié nécessitent une évaluation du fardeau de la maladie dans différents endroits, un défi qui est souvent négligé.

Ce protocole décrit comment effectuer une analyse complète des lésions athérosclérotiques, en commençant par une aorte entière non ouverte et en procédant à la préparation du visage, chez une seule souris. La coloration à l’huile d’aorte rouge rouge non ouverte permet une évaluation qualitative rapide des plaques chargées de lipides dans l’ensemble de l’aorte et de ses branches, tandis que la préparation du visage fournit une évaluation quantitative de la distribution des lésions athérosclérotiques dans l’aorte de la souris.

La technique utilise des souris âgées de 8 semaines avec une délétion TGFβR2 spécifique aux cellules musculaires lisses sur le fond hyperlipidémique Apoe^-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; ci-après dénommées souris TGFβR2iSMC-Apoe) et témoins Apoe^-/- de litière (MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; ci-après dénommées souris Apoe^-/- ). Les animaux sont gardés pendant 16 semaines dans un régime riche en cholestérol et en graisses (HCHFD) comme matériel d’étude7. À la fin de l’étude, les aortes entières non ouvertes sont colorées et imagées (y compris toutes les branches principales) avec de l’O rouge huileux pour une évaluation qualitative des plaques chargées de lipides. Les aortes sont ouvertes par préparation du visage et toutes les lésions athérosclérotiques sont imagées et quantifiées. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le développement de lésions athérosclérotiques dans des modèles de souris hyperlipidémiques Apoe^-/- ou Ldlr^-/- et étendu aux applications générales de biologie vasculaire liées à l’aorte.

Protocole

Les souris mT/mG (n° de stock 007676) et Apoe^-/- (n° de stock 002052) ont été achetées au Jackson Laboratory. Les souris Myh11-CreERT2 étaient un cadeau de Stefan Offermanns (disponible auprès du Jackson Laboratory sous le numéro de stock 019079). Les souris Tgfbr2fl^/fl ont été obtenues auprès de Harold L. Moses (Université Vanderbilt). Toutes les procédures animales ont été effectuées à l’aide de protocoles approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Yale.

1. Souris

1. Produire MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/- et MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- souris comme décrit ^{précédemment7}. Élevez des souches mutantes à l’arrière-plan C57BL / 6J depuis plus de dix générations.
   REMARQUE: La gamme de souris Myh11-CreERT2 Cre fournit un outil puissant pour étudier le rôle des cellules musculaires lisses dans l’homéostasie vasculaire et la pathologie vasculaire. L’allèle Cre est inséré dans le chromosome Y; ainsi, les souris femelles n’expriment pas cette construction.

2. Génotypage de la souris, induction du tamoxifène et alimentation riche en cholestérol et riche en graisses

1. Effectuer le génotypage de la souris à l’aide de l’analyse de l’ADN de l’oreille de la souris et de la PCR. L’ADN de l’oreille de la souris doit être isolé à l’aide du kit d’isolement de l’ADN sanguin et tissulaire (Table des matériaux) conformément aux instructions du fabricant. Les amorces de PCR sont énumérées dans le tableau 1.
2. Induire la recombinaison cre-lox par injection de tamoxifène à 1 mg/jour d’i.p. pendant 5 jours dans myH11-CreERT2;mT/mGf/^f; Apoe^-/- et MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- souris mâles.
3. Induire l’athérosclérose en plaçant des souris mâles de 8 semaines (2 semaines après le traitement au tamoxifène) sur un régime HCHF (40% de graisse kcal, 1,25% de cholestérol, 0% d’acide cholique) pendant 16 semaines.

3. Réactifs et préparation des outils de dissection

1. Préparation de la solution d’huile de bouillon Red O: dissoudre 1 g d’huile rouge O dans 100 mL d’alcool isopropylique.
2. Préparation de la solution d’huile rouge O de travail: mélanger 24 mL de solution d’huile rouge O avec 16 mL de _dH2O. Filtrer l’huile diluée Red O avec des filtres à seringue stériles de 0,45 μm (la solution n’est bonne que pendant 1 à 2 h).
3. Préparation d’alcool isopropylique à 60 % : mélanger 60 mL d’alcool isopropylique avec 40 mL de _dH2O.
4. Formaldéhyde à 4 % dans 1x préparation de DPBS : diluer 10 mL de formaldéhyde à 16 % dans 30 mL de 1x DPBS.
5. Nettoyez tous les outils de dissection avec de l’éthanol à 70 % (Figure 1).

4. Euthanasie (figure 2A)

1. Mesurez le poids de la souris avant l’euthanasie.
2. Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine (chaque millilitre contient 10 mg/mL de kétamine et 2 mg/mL de xylazine).
3. Placez la souris en position couchée (côté ventre vers le haut).

5. Ouverture de la cavité thoracique et abdominale et perfusion cardiaque (Figure 2B)

1. Préparez une seringue de 10 mL avec 10 mL de 1x DPBS. Capuchon avec une aiguille de 25 G. La seringue sera utilisée pour rincer le cœur.
2. Tenez la peau avec une pince à épiler (Style 5) et coupez-la avec de fins ciseaux de la base de l’abdomen jusqu’au haut du cou.
3. Ouvrez la paroi abdominale sous la cage thoracique.
4. Soulevez le sternum avec une pince à épiler (Style 5) et coupez le diaphragme, puis coupez la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique.
5. Faites une petite incision dans l’oreillette droite du cœur.
6. Perfuser à travers la ponction ventriculaire gauche apicale en injectant lentement 10 mL de 1x DPBS. Une fois bien perfusés, le foie et les reins deviennent de couleur brun clair.
7. Nettoyez la cavité thoracique du sang et du liquide étrangers à l’aide d’une éponge non tissée pour absorber le matériau.

6. Isolement de l’aorte et des branches (Figure 2C)

1. Prélever des organes (c.-à-d. les poumons, le foie, la rate et les organes gastro-intestinaux et reproducteurs) et couper la clavicule à l’aide d’une pince à épiler (style 5) et de ciseaux fins tout en laissant le cœur, les reins et l’aorte intacts in situ.
   REMARQUE: Assurez-vous de ne pas lacérer le cœur ou les principaux vaisseaux sanguins.
2. Placez la souris sous un stéréomicroscope.
3. Disséquez les branches de l’aorte et de l’aorte, y compris l’artère brachiocéphale, les artères carotides, les artères sous-clavières, les artères rénales, les artères iliaques communes et les artères fémorales à l’aide d’une pince à épiler (style 4) et de ciseaux à ressort.
   REMARQUE: Couvrez l’aorte avec une éponge humide non tissée pour éviter la déshydratation tout en disséquant les branches de l’aorte.
4. Disséquez et retirez soigneusement l’adipeux adventice et le tissu conjonctif autour des branches de l’aorte et de l’aorte à l’aide d’une pince à épiler (Style 4) et de ciseaux à ressort.
   REMARQUE: Étant donné que l’inflammation est importante chez la souris atteinte d’hyperlipidémie anévrisme, il est difficile d’éliminer l’adventice. Veillez à ne pas déchirer ou entailler les branches de l’aorte et de l’aorte. Cette étape demande de la pratique et de la patience.

7. Fixation du cœur et de l’aorte (Figure 2D,E)

1. Préparez une seringue de 10 mL avec 10 mL de formaldéhyde à 4 % dans 1x de DPBS. Capuchon avec une aiguille de 25 G.
   ATTENTION : Le formaldéhyde est dangereux. Lisez la FS avant de travailler avec ce produit chimique. Portez des gants et des lunettes de sécurité et produisez les solutions de dilution à l’intérieur d’une hotte aspirante.
   REMARQUE: La solution de formaldéhyde à 4% se dégrade avec le temps. Il est important d’utiliser du formaldéhyde à 4% fraîchement préparé pour la fixation.
2. Fixez l’arbre vasculaire par ponction ventriculaire gauche apicale en injectant lentement 10 mL de formaldéhyde à 4%.
   REMARQUE: La fixation du formaldéhyde interfère avec plusieurs applications en aval, telles que la culture cellulaire, l’analyse FACS et l’analyse de séquençage de l’ARN unicellulaire. Ignorez cette étape si l’aorte sera utilisée pour l’une de ces applications.
3. Nettoyez la cavité thoracique de tout liquide étranger avec une éponge non tissée pour absorber le matériau.
4. Séparez le cœur de l’aorte en tenant le cœur avec une pince à épiler (Style 4) et en utilisant des ciseaux à ressort à micro-dissection.
   REMARQUE: Pour effectuer une coloration à l’huile rouge O après cette étape, il est recommandé de couper l’aorte in situ au lieu d’ex vivo et de passer à la section 8. Cela permet à l’aorte en face de se poser facilement à plat.
5. Isolez et excisez l’aorte et sa majeure de 1 mm au-dessus de l’artère carotide jusqu’à l’extrémité de l’artère fémorale à l’aide d’une pince à épiler (Style 4) et de ciseaux à ressort.
6. Transférer le récipient dans une boîte de Petri en cire ou un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et remplir avec 1x DPBS jusqu’à ce qu’il recouvre l’aorte.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

8. Coloration à l’huile Rouge O et imagerie de l’aorte entière non ouverte (Figure 3)

1. Épinglez le récipient sur une boîte de Petri en cire à l’aide d’épingles minutieuses (Figure 3A).
2. Rincez le récipient une fois avec 1x DPBS.
3. Versez 25 mL de solution d’huile rouge O fraîche dans la boîte de Pétri (Figure 3B).
   REMARQUE: (1) L’isopropanol est dangereux et un liquide inflammable. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié. (2) La solution d’huile Red O peut facilement précipiter. Les particules précipitées peuvent interférer avec la coloration ultérieure. Il est important d’éliminer le précipité en filtrant la solution d’huile Red O à travers un filtre de 0,45 μm avant utilisation. (3) Il est préférable de préparer une solution fraîche d’huile Red O et de jeter toute solution inutilisée. (4) En plus de l’huile Rouge O, Sudan IV est un autre composé chimique utilisé pour la coloration des lipides, des triglycérides et des lipoprotéines. Cependant, Oil Red O a progressivement remplacé Sudan IV car la couleur rouge produite par Oil Red O est plus intense et peut donc rendre la graisse beaucoup plus facile à voir.
4. Tacher l’aorte pendant 60 min à température ambiante (RT). Oil Red O tachera la plaque riche en lipides en rouge, laissant d’autres zones ne contenant pas de plaque de couleur pâle.
5. Laver une fois pendant 20 min avec 60% d’isopropanol à RT.
   REMARQUE: Un rinçage excessif peut détacher la plaque.
6. Rincer l’aorte 3x avec du _dH2O pendant 5 min pour éliminer l’isopropanol.
7. Sous un stéréomicroscope, nettoyez délicatement tout le tissu adipeux périvasculaire autour de l’aorte à l’aide d’une pince à épiler (Style 4) et de ciseaux à ressort (Figure 3C,D).
   REMARQUE: Il est important de nettoyer tout le tissu adipeux périvasculaire autour de l’aorte et de ses branches après la coloration, car le tissu adipeux périvasculaire rouge O-coloré à l’huile peut produire un faux fond et interférer avec la morphométrie de la plaque et la quantification de la zone de la plaque. Assurez-vous de ne pas enlever une partie de la paroi aortique. Remplissez le plat de cire avec du _dH2O jusqu’à ce qu’il recouvre l’aorte tachée pendant le nettoyage. Cette étape demande de la pratique et de la patience.
8. Transférez le récipient sur une lame de microscope en verre propre.
9. Acquérir des micrographies numériques à l’aide d’une caméra connectée à un microscope optique. Enregistrez les images haute résolution, de préférence au format TIFF (Tagged Image File Format) (Figure 3E).
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Pour éviter que l’aorte ne sèche, transférer le récipient dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et remplir avec 1x DPBS jusqu’à ce qu’il recouvre l’aorte. Conserver à 4 °C.

9. Montage de l’aorte de la face (Figure 4, Figure 5)

1. Transférer le récipient dans une boîte de Petri en cire et remplir avec 1x DPBS jusqu’à ce qu’il recouvre l’aorte.
2. Couper la carotide, les artères sous-clavières de l’arc aortique et les artères iliaques dans l’aorte abdominale 1–2 mm après les bifurcations. Couper les artères rénales. (Figure 4A)
3. Ouvrir longitudinalement la préparation de l’aorte le long de la courbure interne (figure 4B1) et seule des artères iliaques (figure 4B2) à l’aide de ciseaux à ressort à micro-disséquection.
4. Coupez les trois branches de l’arc aortique (c.-à-d. innominate, carotide commune gauche, artère sous-clavière gauche) le long de la plus grande courbure jusqu’au niveau de base de la courbure interne (marque x) (figure 4B3-B8) avec des ciseaux à ressort à micro-disséquage.
5. Épinglez l’aorte à plat (côté lumière face vers le haut) dans un plat de cire avec des épingles minutieuses et appliquez 1x DPBS jusqu’à ce qu’elle recouvre l’aorte pour l’empêcher de sécher (Figure 4C).
   REMARQUE: (1) Il est important de rendre l’aorte enroulée à plat et de l’épingler en face sans étirement. Cette étape prendra quelques jours en fonction de la gravité de l’athérosclérose. (2) Pour les aortes d’animaux Apoe^-/- ou Ldlr^-/- , il est recommandé d’épingler l’aorte à plat pendant 24 h. (3) Le protocole peut être mis en pause ici.
6. Nettoyez les lames de microscope en verre avec de l’éthanol à 70 % et des essuie-glaces à tâche délicate (Figure 5A).
7. Transférez l’aorte dans une lame de microscope en verre propre et placez 15 gouttes de composé de température de coupe optimale (OCT) sur une autre lame de microscope en verre propre (Figure 5B).
8. Placez soigneusement la lame de microscope en verre avec un composé OCT sur l’aorte et évitez de piéger les bulles d’air sur la lame (Figure 5C).
9. Étiquetez les diapositives avec des exemples de noms (Figure 5D).
   REMARQUE: Les glissières d’aorte en face montées peuvent être stockées dans la chambre d’humidité à 4 ° C pendant plusieurs mois.

10. Imagerie et quantification des lésions de l’aorte face (Figure 6)

1. Acquérir des micrographies numériques à l’aide d’une caméra connectée à un microscope optique. Enregistrez les images haute résolution, de préférence au format TIFF (Tagged Image File Format) (Figure 6A).
2. Transférez des images de l’aorte entière tachée du visage sur un ordinateur équipé du logiciel ImageJ.
3. Dans ImageJ, sélectionnez l’outil « Sélection à main levée » et encerclez manuellement toute la plaque O-tachée de rouge huile (taches rouges intenses) tout en appuyant sur la touche « Alt » (pour PC Windows) ou « Maj » (pour Mac). Cliquez ensuite sur « Mesurer » dans le menu « Analyser » pour afficher les zones de lésion dans la fenêtre de résultats (Figure 6B à gauche).
   NOTE: Il existe plusieurs pièges de la quantification des lésions athérosclérotiques: (1) tout petit morceau de graisse adventice colorée qui est resté attaché à l’aorte à partir de l’étape 8.7 peut donner un faux fond et interférer avec la quantification de la plaque; 2° le retrait d’une partie de la paroi aortique ou l’endommagement de l’aorte aux étapes 6.4 et 8.7 peut interférer avec la quantification de la plaque; (3) les bulles et les plis formés dans l’aorte après le montage (étape 9.8) peuvent interférer avec la quantification de la plaque; et (4) la plaque d’athérosclérose est un phénomène 3D, et les mesures effectuées dans un plan 2D peuvent ne pas refléter l’étendue réelle de la plaque. En plus de l’analyse de la zone de la plaque de l’aorte du visage, il est recommandé d’analyser séparément la taille de la plaque dans la racine aortique, l’artère brachiocéphale, l’aorte ascendante et l’aorte ^abdominale8.
4. Encerclez la ligne de bordure extérieure de l’aorte et cliquez sur « Mesurer » dans le menu « Analyser » pour afficher la zone de l’aorte dans la fenêtre de résultats (Figure 6B à droite).
5. Exportez toutes les mesures dans un fichier Excel.
6. Calculez le rapport entre la surface de la plaque et la surface totale de l’aorte et normalisez la valeur en pourcentage de la surface totale de l’huile Rouge O.
7. Calculer le rapport de la surface de la plaque chez 8 à 10 souris Apoe^-/- et 8 à 10 souris TGFβR2iSMC-Apoe. Présentez les données sous forme de moyenne ± SEM (Figure 6C).
8. Effectuez un test t d’élève non apparié pour l’analyse statistique du rapport des données sur la surface de la plaque par rapport à un autre groupe de souris. Considérez les différences dans les valeurs moyennes comme significatives à p < 0,05.

Résultats

Dans ce protocole, les lésions athérosclérotiques chez des souris TGFβR2iSMC-Apoe ont été analysées après 4 mois de régime ^HCHF7. En plus de l’athérosclérose étendue, ces souris ont développé des anévrismes de l’aorte thoracique et abdominale, comme indiqué précédemment. Par rapport aux souris Apoe^-/-, les parois aortiques des souris TGFβR2iSMC-Apoe présentaient une athérosclérose sévère, ce qui rendait difficile la dissection des lésions (

Discussion

Les souris déficientes en apolipoprotéines E (Apoe) et en récepteurs de lipoprotéines de basse densité (Ldlr) sont utiles pour étudier le développement et le traitement de l’athérosclérose. Les chercheurs peuvent évaluer l’impact de la génétique et des manipulations thérapeutiques sur l’initiation, la progression et la régression des maladies liées à l’athérosclérose en utilisant la coloration à l’huile rouge O de l’ensemble de l’aorte9. La colora...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta