Imágenes y análisis de lesiones de aorta entera teñidas de O de color rojo aceite en un modelo de ratón con hiperlipidemia por aneurisma

Resumen

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para analizar la carga aterosclerótica en ratones. Los investigadores pueden usar este protocolo para comparar la abundancia, la ubicación y el tamaño de las lesiones ateroscleróticas en diferentes animales.

Resumen

Los ratones hiperlipidémicos deficientes en apolipoproteína E (Apoe) o receptores de lipoproteínas de baja densidad (Ldlr) son los dos modelos más utilizados para la investigación de la aterosclerosis. Se utilizan para estudiar el impacto de varios factores genéticos y diferentes tipos de células en la formación de lesiones ateroscleróticas y también para probar el desarrollo de nuevas terapias. El aislamiento, la escisión de toda la aorta y la cuantificación de las lesiones ateroscleróticas teñidas de O rojo aceite son métodos morfométricos básicos utilizados para evaluar la carga aterosclerótica. El objetivo de este protocolo es describir un método quirúrgico optimizado y paso a paso para diseccionar, perfusar-fijar, aislar, teñir, visualizar y analizar lesiones ateroscleróticas en aortas de ratón con Oil Red O. Debido a que las lesiones ateroscleróticas pueden formarse en cualquier parte de todo el árbol aórtico, este método de tinción de aceite de aorta roja O tiene la ventaja de evaluar las placas cargadas de lípidos en toda la aorta y todas las ramas en un solo ratón. Además de la tinción Oil Red O, se pueden utilizar aortas enteras frescas aisladas para una variedad de experimentos in vitro e in vivo y aislamientos celulares.

Introducción

La enfermedad de las arterias coronarias, una de las principales causas de mortalidad en los Estados Unidos, generalmente es causada por la aterosclerosis, un proceso que conduce a la acumulación de placa dentro de las paredes ^arteriales1. Los ratones con deficiencia de Apoe y Ldlr propensos a la hiperlipidemia son fundamentales para las investigaciones de la aterosclerosis y sus complicaciones y el desarrollo de terapias2,3,4,5. La cuantificación de las lesiones ateroscleróticas de una aorta en la cara es un análisis de punto final importante para evaluar el impacto de la manipulación genética en diferentes tipos de células. También ayuda a estudiar nuevas terapias diseñadas para afectar el inicio, la progresión y la regresión de la enfermedad aterosclerótica. Las lesiones ateroscleróticas pueden formarse en cualquier parte de la aorta y sus ramas (es decir, arterias braquiocefálicas, carótidas y subclavias en el tórax, así como arterias renales, ilíacas comunes y femorales debajo del diafragma)⁶. Una evaluación integral de la carga de aterosclerosis y la terapia adecuada requieren una evaluación de la carga de enfermedad en diferentes lugares, un desafío que a menudo se pasa por alto.

Este protocolo describe cómo realizar un análisis exhaustivo de las lesiones ateroscleróticas, comenzando con una aorta entera sin abrir y procediendo a la preparación de la cara, en un solo ratón. La tinción de aceite de aorta entera sin abrir Red O permite una evaluación rápida y cualitativa de las placas cargadas de lípidos en toda la aorta y sus ramas, mientras que la preparación facial proporciona una evaluación cuantitativa de la distribución de la lesión aterosclerótica en la aorta de ratón.

La técnica utiliza ratones de 8 semanas de edad con una deleción TGFβR2 específica de células musculares lisas en el fondo hiperlipidémico Apoe^-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; en lo sucesivo denominados ratones TGFβR2iSMC-Apoe) y controles Apoe^-/- de camada (MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; en lo sucesivo denominados ratones Apoe^-/-). Los animales se mantienen durante 16 semanas en una dieta alta en colesterol y alta en grasas (HCHFD) como materiales de ^estudio7. Al finalizar el estudio, las aortas enteras no abiertas se tiñen y se toman imágenes (incluidas todas las ramas principales) con Oil Red O para la evaluación cualitativa de las placas cargadas de lípidos. Las aortas se abren a través de la preparación facial, y todas las lesiones ateroscleróticas se visualizan y cuantifican. Este protocolo se puede utilizar para estudiar el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en modelos de ratones con hiperlipidemia Apoe^-/- o Ldlr^-/- y extenderse a aplicaciones generales de biología vascular relacionada con la aorta.

Protocolo

Los ratones mT/mG (stock no. 007676) y Apoe^-/- (stock no. 002052) fueron comprados en el Laboratorio Jackson. Los ratones Myh11-CreERT2 fueron un regalo de Stefan Offermanns (disponible en el Laboratorio Jackson como stock no. 019079). Los ratones Tgfbr2fl^/fl se obtuvieron de Harold L. Moses (Universidad de Vanderbilt). Todos los procedimientos con animales se realizaron utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale.

1. Ratones

1. Producir MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/- y MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Ratones Apoe^-/- como se describió ^{anteriormente7}. Cría cepas mutantes al fondo C57BL/6J durante más de diez generaciones.
   NOTA: La línea de ratón Myh11-CreERT2 Cre proporciona una poderosa herramienta para estudiar el papel de las células del músculo liso en la homeostasis vascular y la patología vascular. El alelo Cre se inserta en el cromosoma Y; por lo tanto, los ratones hembra no expresan esta construcción.

2. Genotipado de ratón, inducción de tamoxifeno y alimentación con dieta alta en grasas y colesterol alto

1. Realizar genotipado de ratón utilizando análisis de ADN de oído de ratón y PCR. El ADN del oído de ratón debe aislarse utilizando el kit de aislamiento de ADN de sangre y tejido (Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 1.
2. Inducir la recombinación de Cre-Lox mediante inyección de tamoxifeno a 1 mg/día i.p. durante 5 días en MYH11-CreERT2 de 6 ^semanas de edad;mT/mGf^/f; Apoe^-/- y MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Ratones machos Apoe^-/-
3. Inducir aterosclerosis colocando ratones machos de 8 semanas de edad (2 semanas después del tratamiento con tamoxifeno) en una dieta HCHF (40% de grasa kcal, 1.25% de colesterol, 0% de ácido cólico) durante 16 semanas.

3. Reactivos y preparación de herramientas de disección

1. Preparación de la solución de Aceite Rojo O: disolver 1 g de Aceite Rojo O en 100 ml de alcohol isopropílico.
2. Preparación de la solución de Aceite Rojo O de trabajo: mezcle 24 ml de solución de aceite rojo O con 16 ml de _dH2O. Filtre el aceite diluido Red O con filtros de jeringa estéril de 0,45 μm (la solución solo es buena para 1-2 h).
3. Preparación de alcohol isopropílico al 60%: mezclar 60 ml de alcohol isopropílico con 40 ml de _dH2O.
4. Formaldehído al 4% en 1x preparación dpbs: diluir 10 mL de formaldehído al 16% en 30 mL de 1x DPBS.
5. Limpie todas las herramientas de disección con etanol al 70% (Figura 1).

4. Eutanasia (Figura 2A)

1. Mida el peso del ratón antes de la eutanasia.
2. Eutanasiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina (cada mililitro contiene 10 mg/ml de ketamina y 2 mg/ml de xilazina).
3. Coloque el ratón en posición supina (lado del vientre boca arriba).

5. Apertura de la cavidad torácica y abdominal y perfusión cardíaca (Figura 2B)

1. Prepare una jeringa de 10 ml con 10 ml de 1x DPBS. Tapa con aguja de 25 G. La jeringa se usará para enjuagar el corazón.
2. Sostenga la piel con pinzas (Estilo 5) y corte con tijeras finas desde la base del abdomen hasta la parte superior del cuello.
3. Abra la pared abdominal debajo de la caja torácica.
4. Levante el esternón con pinzas (Estilo 5) y corte el diafragma, luego corte la caja torácica para exponer la cavidad torácica.
5. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón.
6. Perfuse a través de la punción ventricular izquierda apical inyectando lentamente 10 ml de 1x DPBS. Una vez completamente perfundidos, el hígado y el riñón se vuelven de color marrón claro.
7. Limpie la cavidad torácica de sangre y líquido extraños usando una esponja no tejida para absorber el material.

6. Aislamiento de aorta y ramas (Figura 2C)

1. Extraiga órganos (es decir, pulmón, hígado, bazo y órganos gastrointestinales y reproductivos) y corte la clavícula con pinzas (Estilo 5) y tijeras finas mientras deja el corazón, el riñón y la aorta intactos in situ.
   NOTA: Asegúrese de no lacerar el corazón ni ningún vaso sanguíneo importante.
2. Coloque el ratón debajo de un estereomicroscopio.
3. Diseccionar las ramas de la aorta y la aorta, incluidas la arteria braquiocefálica, las arterias carótidas, las arterias subclavias, las arterias renales, las arterias ilíacas comunes y las arterias femorales con pinzas (Estilo 4) y tijeras de resorte.
   NOTA: Cubra la aorta con una esponja húmeda y no tejida para evitar la deshidratación mientras disecciona las ramas de la aorta.
4. Diseccione y elimine cuidadosamente el tejido adiposo y conectivo adventicio alrededor de las ramas de la aorta y la aorta con pinzas (Estilo 4) y tijeras de resorte.
   NOTA: Dado que la inflamación es prominente en el ratón con hiperlipidemia por aneurisma, es difícil eliminar la adventicia. Tenga cuidado de no rasgar o cortar las ramas de la aorta y la aorta. Este paso requiere práctica y paciencia.

7. Fijación del corazón y la aorta (Figura 2D, E)

1. Prepare una jeringa de 10 ml con 10 ml de formaldehído al 4% en 1x de DPBS. Tapa con aguja de 25 G.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es peligroso. Lea la MSDS antes de trabajar con este producto químico. Use guantes y gafas de seguridad y produzca las soluciones de dilución dentro de una campana extractora de humos.
   NOTA: La solución de formaldehído al 4% se degrada con el tiempo. Es importante utilizar formaldehído al 4% recién hecho para la fijación.
2. Fije el árbol vascular a través de la punción ventricular izquierda apical inyectando lentamente 10 ml de formaldehído al 4%.
   NOTA: La fijación de formaldehído interfiere con varias aplicaciones posteriores, como el cultivo celular, el análisis FACS y el análisis de secuenciación de ARN unicelular. Omita este paso si la aorta se utilizará para cualquiera de estas aplicaciones.
3. Limpie la cavidad torácica de cualquier líquido extraño con una esponja no tejida para absorber el material.
4. Separe el corazón de la aorta sosteniendo el corazón con pinzas (Estilo 4) y usando tijeras de resorte microdisecantes.
   NOTA: Para realizar la tinción en cara Oil Red O después de este paso, se recomienda cortar la aorta abierta in situ en lugar de ex vivo y proceder a la sección 8. Esto hace que sea fácil para la aorta en la cara para acostarse plana.
5. Aislar e extirpar la aorta y su mayor desde 1 mm por encima de la arteria carótida hasta el final de la arteria femoral usando pinzas (Estilo 4) y tijeras de resorte.
6. Transfiera el recipiente a una placa de Petri de cera o a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y llénelo con 1x DPBS hasta que cubra la aorta.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

8. Tinción de aceite Rojo O e imágenes de aorta entera sin abrir (Figura 3)

1. Fije el recipiente en una placa de Petri de cera con pasadores minutien (Figura 3A).
2. Enjuague el recipiente una vez con 1x DPBS.
3. Vierta 25 ml de solución fresca de aceite rojo O en la placa de Petri (Figura 3B).
   NOTA: (1) El isopropanol es peligroso y un líquido inflamable. Use el equipo de protección personal adecuado. (2) La solución de aceite Red O puede precipitar fácilmente. Las partículas precipitadas pueden interferir con la tinción posterior. Es importante eliminar el precipitado filtrando la solución oil red O a través de un filtro de 0,45 μm antes de su uso. (3) Es mejor preparar una solución fresca de Oil Red O y desechar cualquier solución no utilizada. (4) Además de Oil Red O, Sudan IV es otro compuesto químico utilizado para la tinción de lípidos, triglicéridos y lipoproteínas. Sin embargo, Oil Red O ha reemplazado gradualmente a Sudan IV porque el color rojo producido por Oil Red O es más intenso y, por lo tanto, puede hacer que la grasa sea mucho más fácil de ver.
4. Manche la aorta durante 60 minutos a temperatura ambiente (RT). Oil Red O teñirá la placa rica en lípidos de rojo, dejando otras áreas que no contienen placa de color pálido.
5. Lavar una vez durante 20 min con isopropanol al 60% en RT.
   NOTA: El enjuague excesivo puede detener la placa.
6. Enjuague la aorta 3x con _dH2O durante 5 min para eliminar el isopropanol.
7. Debajo de un estereomicroscopio, limpie suavemente todo el tejido adiposo perivascular alrededor de la aorta con pinzas (Estilo 4) y tijeras de resorte (Figura 3C, D).
   NOTA: Es importante limpiar todo el tejido adiposo perivascular alrededor de la aorta y sus ramas después de la tinción, porque el tejido adiposo perivascular teñido con O de color rojo aceite puede producir un fondo falso e interferir con la morfometría de la placa y la cuantificación del área de la placa. Asegúrese de no quitar una parte de la pared aórtica. Llene el plato de cera con _dH2O hasta que cubra la aorta manchada durante la limpieza. Este paso requiere práctica y paciencia.
8. Transfiera el recipiente a un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio.
9. Adquiera micrografías digitales utilizando una cámara conectada a un microscopio de luz. Guarde imágenes de alta resolución, preferiblemente en formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF) (Figura 3E).
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Para evitar que la aorta se seque, transfiera el recipiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y llénelo con 1x DPBS hasta que cubra la aorta. Conservar a 4 °C.

9. Montaje en aorta frontal (Figura 4, Figura 5)

1. Transfiera el recipiente a una placa de Petri de cera y llénelo con 1x DPBS hasta que cubra la aorta.
2. Cortar las arterias carótidas, subclavias del arco aórtico y las arterias ilíacas en la aorta abdominal 1-2 mm después de las bifurcaciones. Cortar las arterias renales. (Figura 4A)
3. Cortar longitudinalmente la preparación de la aorta a lo largo de la curvatura interna (Figura 4B1) y las arterias ilíacas solas (Figura 4B2) con tijeras de resorte microdisecantes.
4. Abra las tres ramas del arco aórtico (es decir, innominado, carótida común izquierda, arteria subclavia izquierda) a lo largo de la curvatura mayor hasta el nivel base de la curvatura interna (marca x) (Figura 4B3-B8) con tijeras de resorte microdisecantes.
5. Fije la aorta plana (lumen lateral hacia arriba) en un plato de cera con pasadores minutien y aplique 1x DPBS hasta que cubra la aorta para evitar que se seque (Figura 4C).
   NOTA: (1) Es importante hacer la aorta enrollada plana y fijarla en la cara sin estirarse. Este paso tomará unos días dependiendo de la gravedad de la aterosclerosis. (2) Para las aortas de animales Apoe^-/- o Ldlr^-/- , se recomienda fijar la aorta plana durante 24 h. (3) El protocolo se puede pausar aquí.
6. Limpie los portaobjetos de microscopio de vidrio con etanol al 70% y limpiaparabrisas de tareas delicadas (Figura 5A).
7. Transfiera la aorta a un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio y coloque 15 gotas de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en otro portaobjetos de microscopio de vidrio limpio (Figura 5B).
8. Coloque cuidadosamente el portaobjetos de microscopio de vidrio con compuesto oct sobre la aorta y evite atrapar burbujas de aire en el portaobjetos (Figura 5C).
9. Etiquete las diapositivas con nombres de ejemplo (Figura 5D).
   NOTA: Los portaobjetos de aorta montados en la cara se pueden almacenar en la cámara de humedad a 4 °C durante varios meses.

10. Obtención de imágenes y cuantificación de lesiones de la aorta en cara (Figura 6)

1. Adquiera micrografías digitales utilizando una cámara conectada a un microscopio de luz. Guarde imágenes de alta resolución, preferiblemente en formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF) (Figura 6A).
2. Transfiera imágenes de la aorta entera manchada en la cara a una computadora equipada con el software ImageJ.
3. En ImageJ, seleccione la herramienta "Selección a mano alzada" y rodee manualmente toda la placa teñida de O rojo aceite (manchas rojas intensas) mientras presiona la tecla "Alt" (para PC con Windows) o la tecla "Shift" (para Mac). Luego, haga clic en "Medir" en el menú "Analizar" para mostrar las áreas de la lesión en la ventana de resultados (Figura 6B a la izquierda).
   NOTA: Hay varias trampas de la cuantificación de las lesiones ateroscleróticas: (1) cualquier pequeño trozo de grasa adventicia teñida que permanezca adherida a la aorta desde el paso 8.7 puede producir un fondo falso e interferir con la cuantificación de la placa; (2) eliminar una porción de la pared aórtica o dañar la aorta de los pasos 6.4 y 8.7 puede interferir con la cuantificación de la placa; (3) las burbujas y pliegues formados en la aorta después del montaje (paso 9.8) pueden interferir con la cuantificación de la placa; y (4) la placa aterosclerótica es un fenómeno 3D, y las mediciones realizadas en un plano 2D pueden no reflejar la verdadera extensión de la placa. Además del análisis de la zona de la placa de aorta en la cara, se recomienda analizar por separado el tamaño de la placa en la raíz aórtica, la arteria braquiocefálica, la aorta ascendente y la aorta ^abdominal8.
4. Rodee la línea del borde exterior de la aorta y haga clic en "Medir" en el menú "Analizar" para mostrar el área de la aorta en la ventana de resultados (Figura 6B a la derecha).
5. Exporte todas las medidas a un archivo de Excel.
6. Calcule la relación entre el área de placa y el área total de la aorta y normalice el valor como el porcentaje del área total de superficie de Oil Red O.
7. Calcule la relación del área de placa en ratones 8–10 Apoe^-/- y 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe. Presentar los datos como media ± SEM (Figura 6C).
8. Realice una prueba t de Student no emparejada para el análisis estadístico de la proporción de datos del área de placa en comparación con otro grupo de ratones. Considere las diferencias en los valores medios como significativas a p < 0,05.

Resultados

En este protocolo, se analizaron lesiones ateroscleróticas en ratones TGFβR2iSMC-Apoe después de 4 meses con una dieta ^HCHF7. Además de la aterosclerosis extensa, estos ratones desarrollaron aneurismas aórticos torácicos y abdominales, como se informó anteriormente. En comparación con los ratones Apoe^-/-, las paredes aórticas de los ratones TGFβR2iSMC-Apoe mostraron aterosclerosis severa, lo que dificulta la disección de las lesiones (Figura 2C...

Discusión

Los ratones deficientes en apolipoproteína E (Apoe) y receptor de lipoproteínas de baja densidad (Ldlr) son útiles para estudiar el desarrollo y el tratamiento de la aterosclerosis. Los investigadores pueden evaluar el impacto de las manipulaciones genéticas y terapéuticas en la iniciación, progresión y regresión de enfermedades relacionadas con la aterosclerosis utilizando la tinción Oil Red O de toda la aorta9. La tinción y cuantificación de lesiones con aceite de ao...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta