Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse der atherosklerotischen Belastung bei Mäusen. Ermittler können dieses Protokoll verwenden, um die Häufigkeit, den Ort und die Größe von atherosklerotischen Läsionen bei verschiedenen Tieren zu vergleichen.

Zusammenfassung

Apolipoprotein E (Apoe)- oder Low Density Lipoprotein Receptor (Ldlr)-defiziente hyperlipidämische Mäuse sind die beiden am häufigsten verwendeten Modelle für die Atheroskleroseforschung. Sie werden verwendet, um den Einfluss verschiedener genetischer Faktoren und verschiedener Zelltypen auf die atherosklerotische Läsionsbildung zu untersuchen und die Entwicklung neuer Therapien zu testen. Isolierung, Exzision der gesamten Aorta und Quantifizierung von Oil Red O-gefärbten atherosklerotischen Läsionen sind grundlegende morphometrische Methoden zur Bewertung der atherosklerotischen Belastung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine optimierte, schrittweise chirurgische Methode zu beschreiben, um atherosklerotische Läsionen in Mausaorten mit Oil Red O zu sezieren, zu fixieren, zu isolieren, zu färben, abzubilden und zu analysieren. Da sich atherosklerotische Läsionen überall im gesamten Aortenbaum bilden können, hat diese gesamte Aorta-Öl-Rot-O-Färbemethode den Vorteil, dass lipidbeladene Plaques in der gesamten Aorta und allen Zweigen in einer einzigen Maus bewertet werden. Zusätzlich zur Öl-Rot-O-Färbung können frisch isolierte ganze Aorten für eine Vielzahl von In-vitro- und In-vivo-Experimenten und Zellisolierungen verwendet werden.

Einleitung

Koronare Herzkrankheit, eine der Haupttodesursachen in den USA, wird in der Regel durch Atherosklerose verursacht, ein Prozess, der zur Bildung von Plaque in den Arterienwänden ^führt1. Hyperlipidämie-anfällige Apoe- und Ldlr-defiziente Mäuse sind von zentraler Bedeutung für die Untersuchung von Atherosklerose und ihren Komplikationen und die Entwicklung von Therapien2,3,4,5. Die Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen aus einer En-face-Aorta ist eine wichtige Endpunktanalyse zur Bewertung der Auswirkungen genetischer Manipulation in verschiedenen Zelltypen. Es hilft auch, neuartige Therapien zu untersuchen, die die Initiierung, Progression und Regression atherosklerotischer Erkrankungen beeinflussen sollen. Atherosklerotische Läsionen können sich überall in der Aorta und ihren Ästen bilden (d. h. brachiozephalis, Halsschlagadern und Subclavia-Arterien in der Brust sowie Nieren-, gemeinsame Becken- und Oberschenkelarterien unterhalb des Zwerchfells)⁶. Eine umfassende Bewertung der Atherosklerosebelastung und eine geeignete Therapie erfordern eine Beurteilung der Krankheitslast an verschiedenen Orten, eine Herausforderung, die oft übersehen wird.

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine umfassende Analyse von atherosklerotischen Läsionen, beginnend mit einer ungeöffneten ganzen Aorta und bis zur Vorbereitung des Gesichts, in einer einzigen Maus durchgeführt wird. Die ungeöffnete Färbung der gesamten Aorta Oil Red O ermöglicht eine schnelle, qualitative Beurteilung von lipidbeladenen Plaques in der gesamten Aorta und ihren Ästen, während die Flächenvorbereitung eine quantitative Beurteilung der atherosklerotischen Läsionsverteilung in der Mausaorta ermöglicht.

Die Technik verwendet 8 Wochen alte Mäuse mit einer glatten Muskelzell-spezifischen TGFβR2-Deletion auf dem Apoe-/- hyperlipidämischen Hintergrund (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf^/f; Apoe-^/-; im Folgenden als TGFβR2iSMC-Apoe-Mäuse bezeichnet) und Littermate ^Apoe-/- Kontrollen (MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe-^/-; im Folgenden als Apoe-^/- Mäuse bezeichnet). Die Tiere werden 16 Wochen lang mit einer cholesterinreichen fettreichen Diät (HCHFD) als Studienmaterial ^gehalten7. Am Ende der Studie werden die ungeöffneten ganzen Aorten gefärbt und (einschließlich aller Hauptzweige) mit Oil Red O zur qualitativen Beurteilung von lipidbeladenen Plaques abgebildet. Die Aorten werden durch En-Face-Vorbereitung aufgeschnitten und alle atherosklerotischen Läsionen werden abgebildet und quantifiziert. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die atherosklerotische Läsionsentwicklung in Apoe-/- oder Ldlr-^{/- Hyperlipidämie-Mäusemodellen} zu untersuchen und auf allgemeine aortabezogene vaskuläre Biologieanwendungen auszudehnen.

Protokoll

mT/mG (Lagernummer 007676) und Apoe-^/- (Lagernummer 002052) Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Myh11-CreERT2-Mäuse waren ein Geschenk von Stefan Offermanns (erhältlich im Jackson Laboratory als Lagernummer 019079). Tgfbr2fl^/fl-Mäuse wurden von Harold L. Moses (Vanderbilt University) gewonnen. Alle Tierverfahren wurden unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.

1. Mäuse

1. Produzieren Sie MYH11-CreERT2;mT/mGf/^f; Apoe-/- und MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf^/f; Apoe-^/- Mäuse wie zuvor ^beschrieben7. Rassemutanten stützen sich seit mehr als zehn Generationen auf den C57BL/6J-Hintergrund.
   HINWEIS: Die Myh11-CreERT2 Cre-Mauslinie bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Rolle glatter Muskelzellen bei der vaskulären Homöostase und Gefäßpathologie. Das Cre-Allel wird in das Y-Chromosom eingefügt; Daher drücken weibliche Mäuse dieses Konstrukt nicht aus.

2. Maus-Genotypisierung, Tamoxifen-Induktion und cholesterinreiche fettreiche Diät Fütterung

1. Führen Sie eine Mausgenotypisierung mit Mausohr-DNA- und PCR-Analysen durch. Mausohr-DNA sollte mit dem DNA-Isolationskit für Blut und Gewebe (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert werden. PCR-Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
2. Induzieren Sie die Cre-Lox-Rekombination durch Tamoxifen-Injektion bei 1 mg / Tag ^i.p. für 5 Tage in 6 Wochen alten MYH11-CreERT2; mT/mGf/^f; Apoe-/- und MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf^/f; Apoe-^/- männliche Mäuse.
3. Induzieren Sie Atherosklerose, indem Sie 8 Wochen alte männliche Mäuse (2 Wochen nach der Tamoxifen-Behandlung) 16 Wochen lang auf eine HCHF-Diät (40% kcal Fett, 1,25% Cholesterin, 0% Cholsäure) setzen.

3. Reagenzien und Vorbereitung von Sezierwerkzeugen

1. Zubereitung der Rot-O-Lösung des Stammöls: 1 g Öl Red O in 100 ml Isopropylalkohol auflösen.
2. Arbeitsöl Red O Lösung Zubereitung: Mischen Sie 24 ml Stammöl Red O Lösung mit 16 ml _dH2O. Filtern Sie das verdünnte Oil Red O mit 0,45 μm sterilen Spritzenfiltern (die Lösung ist nur für 1–2 h gut).
3. 60% Isopropylalkohol-Zubereitung: Mischen Sie 60 ml Isopropylalkohol mit 40 ml _dH2O.
4. 4% Formaldehyd in 1x DPBS-Zubereitung: 10 ml 16% Formaldehyd in 30 ml 1x DPBS verdünnen.
5. Reinigen Sie alle Sezierwerkzeuge mit 70 % Ethanol (Abbildung 1).

4. Euthanasie (Abbildung 2A)

1. Messen Sie das Gewicht der Maus vor der Euthanasie.
2. Euthanasie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin (jeder Milliliter enthält 10 mg / ml Ketamin und 2 mg / ml Xylium).
3. Stellen Sie die Maus in Rückenlage (Bauchseite nach oben).

5. Öffnung der Brust- und Bauchhöhle und Herzperfusion (Abbildung 2B)

1. Bereiten Sie eine 10-ml-Spritze mit 10 ml 1x DPBS vor. Kappe mit einer 25 G Nadel. Die Spritze wird verwendet, um das Herz zu spülen.
2. Die Haut mit einer Pinzette (Style 5) hochhalten und mit einer feinen Schere von der Bauchbasis bis zur Halsoberseite schneiden.
3. Öffnen Sie die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs.
4. Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette an (Stil 5) und schneiden Sie das Zwerchfell ab, schneiden Sie dann den Brustkorb weg, um die Brusthöhle freizulegen.
5. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens.
6. Durchbluten Sie die apikale linksventrikuläre Punktion, indem Sie langsam 10 ml 1x DPBS injizieren. Einmal gründlich durchblutet, werden Leber und Niere hellbraun in der Farbe.
7. Reinigen Sie die Brusthöhle von Fremdblut und Flüssigkeit, indem Sie einen Vliesschwamm verwenden, um das Material zu absorbieren.

6. Isolierung von Aorta und Zweigen (Abbildung 2C)

1. Entfernen Sie Organe (d. H. Lunge, Leber, Milz sowie Magen-Darm- und Fortpflanzungsorgane) und schneiden Sie das Schlüsselbein mit einer Pinzette (Stil 5) und einer feinen Schere, während Herz, Niere und Aorta in situ intakt bleiben.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, das Herz oder größere Blutgefäße nicht zu zerreißen.
2. Legen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop.
3. Sezieren Sie Aorta und Aortazweige einschließlich brachiozephaler Arterie, Halsschlagadern, Hinterhauptverkehrsadern, Nierenarterien, gemeinsame Beckenarterien und Oberschenkelarterien mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere.
   HINWEIS: Bedecken Sie die Aorta mit einem nassen, nicht gewebten Schwamm, um Austrocknung zu vermeiden, während Sie die Aortenzweige sezieren.
4. Sezieren und entfernen Sie vorsichtig zufälliges Fett- und Bindegewebe um die Aorta- und Aortenzweige mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere.
   HINWEIS: Da die Entzündung bei der Aneurysma-Hyperlipidämie-Maus prominent ist, ist es schwierig, Adventitia zu entfernen. Achten Sie darauf, die Aorta- und Aortenzweige nicht zu zerreißen oder zu durchbohren. Dieser Schritt erfordert Übung und Geduld.

7. Fixierung von Herz und Aorta (Abbildung 2D,E)

1. Bereiten Sie eine 10-ml-Spritze mit 10 ml 4% Formaldehyd in 1x DPBS vor. Kappe mit einer 25 G Nadel.
   ACHTUNG: Formaldehyd ist gefährlich. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, bevor Sie mit dieser Chemikalie arbeiten. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrillen und produzieren Sie die Verdünnungslösungen in einem Abzug.
   HINWEIS: 4% Formaldehydlösung wird im Laufe der Zeit abgebaut. Es ist wichtig, frisch hergestelltes 4% Formaldehyd zur Fixierung zu verwenden.
2. Fixieren Sie den Gefäßbaum durch apikale linksventrikuläre Punktion, indem Sie langsam 10 ml 4% Formaldehyd injizieren.
   HINWEIS: Die Formaldehydfixierung stört mehrere nachgelagerte Anwendungen wie Zellkultur, FACS-Analyse und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Aorta für eine dieser Anwendungen verwendet wird.
3. Reinigen Sie die Brusthöhle von Fremdflüssigkeit mit einem Vliesschwamm, um das Material zu absorbieren.
4. Trennen Sie das Herz von der Aorta, indem Sie das Herz mit einer Pinzette (Stil 4) halten und eine Mikrosezierungs-Federschere verwenden.
   HINWEIS: Um nach diesem Schritt eine Oil Red O-Färbung durchzuführen, wird empfohlen, die Aorta an Ort und Stelle statt ex vivo aufzuschneiden und mit Abschnitt 8 fortzufahren. Dies erleichtert es der gegenüberliegenden Aorta, flach zu liegen.
5. Isolieren und entfernen Sie die Aorta und ihren Major von 1 mm über der Halsschlagader bis zum Ende der Oberschenkelarterie mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere.
6. Geben Sie das Gefäß in eine Wachs-Petrischale oder ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie es mit 1x DPBS, bis es die Aorta bedeckt.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

8. Öl-Rot-O-Färbung und Abbildung ungeöffneter ganzer Aorten (Abbildung 3)

1. Heften Sie das Gefäß mit winzigen Stiften auf eine Wachs-Petrischale (Abbildung 3A).
2. Spülen Sie das Gefäß einmal mit 1x DPBS ab.
3. Gießen Sie 25 ml frische Oil Red O-Lösung in die Petrischale (Abbildung 3B).
   HINWEIS: (1) Isopropanol ist gefährlich und eine brennbare Flüssigkeit. Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung. (2) Oil Red O Lösung kann leicht ausfallen. Die ausgefällten Partikel können die nachfolgende Färbung stören. Es ist wichtig, den Niederschlag zu entfernen, indem die Oil Red O-Lösung vor dem Gebrauch durch einen 0,45-μm-Filter filtriert wird. (3) Es ist am besten, frische Oil Red O-Lösung vorzubereiten und jede nicht verwendete Lösung zu entsorgen. (4) Neben Oil Red O ist Sudan IV eine weitere chemische Verbindung, die zur Färbung von Lipiden, Triglyceriden und Lipoproteinen verwendet wird. Oil Red O hat jedoch Sudan IV allmählich ersetzt, da die von Oil Red O erzeugte rote Farbe intensiver ist und somit Fett viel leichter zu sehen machen kann.
4. Färben Sie die Aorta für 60 min bei Raumtemperatur (RT). Oil Red O färbt lipidreiche Plaque rot und hinterlässt andere nicht plaquehaltige Bereiche, die eine blasse Farbe haben.
5. Einmal für 20 min mit 60% Isopropanol bei RT waschen.
   HINWEIS: Übermäßiges Spülen kann die Plakette verschmutzen.
6. Spülen Sie die Aorta 3x mit _dH2O für 5 Minuten, um Isopropanol zu entfernen.
7. Reinigen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig das gesamte perivaskuläre Fettgewebe um die Aorta herum mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere (Abbildung 3C, D).
   HINWEIS: Es ist wichtig, das gesamte perivaskuläre Fettgewebe um die Aorta und ihre Äste nach der Färbung zu reinigen, da ölrotes O-gefärbtes perivaskuläres Fettgewebe einen falschen Hintergrund ergeben und die Plaquemorphometrie und die Plaquebereichsquantifizierung beeinträchtigen kann. Achten Sie darauf, keinen Teil der Aortenwand zu entfernen. Füllen Sie die Wachsschale mit _dH2O, bis sie während der Reinigung die gefärbte Aorta bedeckt. Dieser Schritt erfordert Übung und Geduld.
8. Übertragen Sie das Gefäß auf einen sauberen Objektträger aus Glas.
9. Erfassen Sie digitale Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an ein Lichtmikroskop angeschlossen ist. Speichern Sie hochauflösende Bilder, vorzugsweise im TIFF-Format (Tagged Image File Format) (Abbildung 3E).
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Um ein Austrocknen der Aorta zu verhindern, geben Sie das Gefäß in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie es mit 1x DPBS, bis es die Aorta bedeckt. Bei 4 °C lagern.

9. Stufenlose Aortenmontage (Abbildung 4, Abbildung 5)

1. Das Gefäß in eine Wachs-Petrischale geben und mit 1x DPBS füllen, bis es die Aorta bedeckt.
2. Durchtrennen Sie die Halsschlagadern, die subclaviafarbenen Arterien des Aortenbogens und der Beckenarterien in der Bauchaorta 1–2 mm nach Bifurkationen. Durchtrennen Sie die Nierenarterien. (Abbildung 4A)
3. Längsschnitt die Aortenvorbereitung entlang der inneren Krümmung (Abbildung 4B1) und allein der Beckenarterien (Abbildung 4B2) mit einer mikrodissektierenden Federschere auf.
4. Schneiden Sie die drei Zweige des Aortenbogens (d. h. innominate, linke gemeinsame Halsschlagader, linke Arteria subclavia) entlang der größeren Krümmung bis zum Basisniveau der inneren Krümmung (x-Markierung) (Abbildung 4B3–B8) mit einer mikrodissektierenden Federschere auf.
5. Die Aorta flach (Lumenseite nach oben) in eine Wachsschale mit winzigen Stiften stecken und 1x DPBS auftragen, bis sie die Aorta bedeckt, um ein Austrocknen zu verhindern (Abbildung 4C).
   HINWEIS: (1) Es ist wichtig, die aufgerollte Aorta flach zu machen und sie ohne Dehnung in die Fläche zu stecken. Dieser Schritt dauert je nach Schwere der Atherosklerose einige Tage. (2) Bei Aorten von Apoe-/- oder Ldlr-^/- Tieren wird empfohlen, die Aorta für 24 h flach zu befestigen. (3) Das Protokoll kann hier pausiert werden.
6. Reinigen Sie die Objektträger des Glasmikroskops mit 70% Ethanol und empfindlichen Scheibenwischern (Abbildung 5A).
7. Übertragen Sie die Aorta in einen Objektträger mit Reinglasmikroskop und geben Sie 15 Tropfen OCT-Verbindung (Optimal Cutting Temperature) auf einen anderen Objektträger mit Reinglasmikroskop (Abbildung 5B).
8. Legen Sie den Objektträger des Glasmikroskops mit OCT-Verbindung vorsichtig über die Aorta und vermeiden Sie, dass Luftblasen auf dem Objektträger eingeschlossen werden (Abbildung 5C).
9. Beschriften Sie die Folien mit Beispielnamen (Abbildung 5D).
   HINWEIS: Die montierten En-Face-Aorta-Dias können mehrere Monate in der Feuchtekammer bei 4 °C gelagert werden.

10. Bildgebung und Läsionsquantifizierung der Enface-Aorta (Abbildung 6)

1. Erfassen Sie digitale Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an ein Lichtmikroskop angeschlossen ist. Speichern Sie hochauflösende Bilder, vorzugsweise im Tagged-Image-Dateiformat (TIFF) (Abbildung 6A).
2. Übertragen Sie Bilder der mit dem Gesicht gefärbten ganzen Aorta auf einen Computer, der mit der ImageJ-Software ausgestattet ist.
3. Wählen Sie in ImageJ das Werkzeug "Freihandauswahl" und umkreisen Sie alle Ölrot-O-gefärbten Plaketten manuell (intensive rote Flecken), während Sie die "Alt"-Taste (für Windows-PC) oder die "Shift"-Taste (für Mac) drücken. Klicken Sie dann im Menü "Analysieren" auf "Messen", um Läsionsbereiche im Ergebnisfenster anzuzeigen (Abbildung 6B links).
   HINWEIS: Es gibt mehrere Fallstricke bei der Quantifizierung von atherosklerotischen Läsionen: (1) Alle kleinen Stücke von gefärbtem Adventitialfett, die ab Schritt 8.7 an der Aorta haften, können zu einem falschen Hintergrund führen und die Plaquequantifizierung beeinträchtigen; (2) Das Entfernen eines Teils der Aortenwand oder die Beschädigung der Aorta durch die Schritte 6.4 und 8.7 kann die Plaquequantifizierung beeinträchtigen; (3) Blasen und Falten, die sich nach der Montage in der Aorta bilden (Schritt 9.8), können die Plaquequantifizierung stören; und (4) atherosklerotische Plaque ist ein 3D-Phänomen, und Messungen, die in einer 2D-Ebene durchgeführt werden, spiegeln möglicherweise nicht das wahre Ausmaß der Plaque wider. Zusätzlich zur Analyse des Plaquebereichs der Aorta wird empfohlen, die Plaquegröße in der Aortenwurzel, der Arteria brachiocephalica, der aufsteigenden Aorta und der Bauchaorta separat zu ^{analysieren8.}
4. Kreisen Sie die äußere Randlinie der Aorta ein und klicken Sie im Menü "Analysieren" auf "Messen", um den Aortenbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen (Abbildung 6B rechts).
5. Exportieren Sie alle Messungen in eine Excel-Datei.
6. Berechnen Sie das Verhältnis der Plaquefläche aus der gesamten Aortenfläche und normalisieren Sie den Wert als Prozentsatz der gesamten Oil Red O-Oberfläche.
7. Berechnen Sie das Verhältnis der Plaquefläche in 8–10 Apoe-/- und 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe-Mäusen. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± SEM (Abbildung 6C).
8. Führen Sie einen ungepaarten Student's t-Test zur statistischen Analyse des Verhältnisses von Plaque-Area-Daten im Vergleich zu einer anderen Mausgruppe durch. Betrachten Sie die Unterschiede in den Mittelwerten als signifikant bei p < 0,05.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurden atherosklerotische Läsionen in TGFβR2iSMC-Apoe-Mäusen nach 4 Monaten mit einer ^{HCHF-Diät analysiert7.} Neben einer ausgedehnten Atherosklerose entwickelten diese Mäuse, wie bereits berichtet, sowohl thorakale als auch abdominale Aortenaneurysmen. Im Vergleich zu Apoe-^/- Mäusen zeigten die Aortenwände der TGFβR2iSMC-Apoe-Mäuse eine schwere Atherosklerose, was die Sezierung der Läsionen erschwerte (Abbildung

Diskussion

Apolipoprotein E (Apoe) und Low Density Lipoprotein Rezeptor (Ldlr) defiziente Mäuse sind nützlich für die Untersuchung der Entwicklung und Behandlung von Atherosklerose. Forscher können die Auswirkungen von Genetik und therapeutischen Manipulationen auf die Initiierung, Progression und Regression von Atherosklerose-bedingten Krankheiten unter Verwendung der Öl-Rot-O-Färbung der gesamten Aorta ^bewerten9. Aorta Oil Red O Färbung und Läsionsquantifizierung ist der Goldstand...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta