Imagem e Análise de Lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma

Resumo

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para analisar a carga aterosclerótica em camundongos. Os investigadores podem usar este protocolo para comparar a abundância, localização e tamanho das lesões ateroscleróticas em diferentes animais.

Resumo

Apolipoproteína E (Apoe)- ou receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr)-camundongos hiperlipidêmicos deficientes são os dois modelos mais usados para pesquisa de aterosclerose. Eles são usados para estudar o impacto de vários fatores genéticos e diferentes tipos de células na formação de lesões ateroscleróticas e também testar o desenvolvimento de novas terapias. Isolamento, excisão de toda a aorta e quantificação de lesões ateroscleróticas manchadas de óleo são métodos morfométricos básicos utilizados para avaliar a carga aterosclerótica. O objetivo deste protocolo é descrever um método cirúrgico otimizado, passo a passo para dissecar, perfuse-fix, isolar, manchar, imagem e analisar lesões ateroscleróticas em aortas de camundongos com O Vermelho Óleo. Como lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar em toda a árvore aórtica, todo este método de coloração de aorta- vermelha orta tem a vantagem de avaliar placas carregadas de lipídios em toda a aorta e todos os ramos em um único rato. Além da coloração de Óleo Vermelho O, aortas inteiras isoladas frescas podem ser usadas para variedade de experimentos in vitro e in vivo e isolamentos celulares.

Introdução

A doença arterial coronariana, uma das principais causas de mortalidade nos EUA, é geralmente causada pela aterosclerose, um processo que leva ao acúmulo de placa dentro de paredes ^arteriais1. Camundongos deficientes de hiperlipidemia e ldlr são centrais para as investigações de aterosclerose e suas complicações e desenvolvimento de terapias2,3,4,5. A quantificação de lesões ateroscleróticas a partir de uma aorta en face é uma importante análise de ponto final para avaliar o impacto da manipulação genética em diferentes tipos de células. Também ajuda a estudar novas terapias projetadas para afetar a iniciação, progressão e regressão da doença aterosclerótica. Lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar da aorta e seus ramos (ou seja, braquiocefálicas, carótidas e subclávias no peito, bem como artérias renais, ilíacas comuns e femorais abaixo do diafragma)⁶. Uma avaliação abrangente da carga de aterosclerose e da terapia adequada requer a avaliação da carga da doença em diferentes locais, um desafio que muitas vezes é negligenciado.

Este protocolo descreve como realizar uma análise abrangente das lesões ateroscleróticas, começando com uma aorta inteira não aberta e procedendo para en preparação facial, em um único rato. A coloração inteira de aorta vermelha o óleo não aberto permite uma avaliação rápida e qualitativa de placas carregadas de lipídios em toda a aorta e seus ramos, enquanto a preparação facial fornece uma avaliação quantitativa da distribuição da lesão aterosclerótica na aorta do rato.

A técnica utiliza camundongos de 8 semanas com uma exclusão TGFβR2 específica para células musculares lisas no fundo apoe^/- hiperlipidêmico (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^/-; a partir de agora referido como ratos TGFβR2iSMC-Apoe) e controles de amuleto Apoe^-/- (MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^/-; a partir de agora referido como Apoe^-/- ratos). Os animais são mantidos por 16 semanas em uma dieta rica em colesterol alto (HCHFD) como materiais de ^estudo7. No término do estudo, as aortas inteiras não abertas são manchadas e imagens (incluindo todos os principais ramos) com O Vermelho Óleo para avaliação qualitativa de placas carregadas de lipídios. As aortas são cortadas através da preparação do rosto, e todas as lesões ateroscleróticas são imagens e quantificadas. Este protocolo pode ser usado para estudar o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas nos modelos de camundongos de hiperlipidemia apoe^/ou Ldlr^/- hiperlipidemia e estendido a aplicações gerais de biologia vascular relacionadas à aorta.

Protocolo

mT/mG (estoque nº 007676) e camundongos Apoe^-/- (estoque nº 002052) foram comprados no Laboratório Jackson. Os ratos Myh11-CreERT2 foram um presente de Stefan Offermanns (disponível no Laboratório Jackson como estoque nº 019079). Os ratos Tgfbr2fl^/fl foram obtidos de Harold L. Moses (Universidade Vanderbilt). Todos os procedimentos animais foram realizados por meio de protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale.

1. Ratos

1. Produzir MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- camundongos como descrito ^{anteriormente7}. Criar cepas mutantes para o fundo C57BL/6J por mais de dez gerações.
   NOTA: A linha de camundongos Myh11-CreERT2 cre fornece uma ferramenta poderosa para estudar o papel das células musculares lisas na homeostase vascular e na patologia vascular. O alelo Cre é inserido no cromossomo Y; assim, camundongos fêmeas não expressam essa construção.

2. Genotipagem de camundongos, indução de tamoxifen e alimentação de dieta rica em gordura

1. Realize a genotipagem do mouse usando DNA de orelha do mouse e análise pcr. O DNA da orelha do rato deve ser isolado usando o kit de isolamento de DNA de sangue e tecido (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers do PCR estão listados na Tabela 1.
2. Induzir a recombinação de Cre-Lox por injeção de tamoxifen a 1 mg/dia i.p. por 5 dias em MYH11-CreERT2 de 6 semanas de idade;mT/mGf^/f; Apoe^-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- ratos machos.
3. Induzir aterosclerose colocando camundongos machos de 8 semanas de idade (2 semanas após o tratamento de tamoxifen) em uma dieta HCHF (40% de gordura kcal, 1,25% colesterol, 0% ácido cholic) por 16 semanas.

3. Reagentes e preparação da ferramenta de dissecação

1. Estocagem Red O preparação da solução: dissolver 1 g de Óleo Vermelho O em 100 mL de álcool isopropílico.
2. Preparação da solução De Óleo De Trabalho Vermelho O: misture 24 mL de estoque Solução Oil Red O com 16 mL de _dH2O. Filtrar o óleo diluído Vermelho O com filtros de seringa estéril de 0,45 μm (a solução só é boa para 1-2 h).
3. 60% de preparo isopropílico de álcool: misture 60 mL de álcool isopropílico com 40 mL de _dH2O.
4. 4% de formaldeído em 1x preparação de DPBS: diluir 10 mL de formaldeído de 16% em 30 mL de 1x DPBS.
5. Limpe todas as ferramentas de dissecção com 70% de etanol (Figura 1).

4. Eutanásia (Figura 2A)

1. Meça o peso do rato antes da eutanásia.
2. Eutanize o rato por injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina (cada mililitro contém 10 mg/mL de cetamina e 2 mg/mL de xilazina).
3. Coloque o mouse em posição supina (face-up do lado da barriga).

5. Abertura da cavidade torácica e abdominal e perfusão cardíaca (Figura 2B)

1. Prepare uma seringa de 10 mL com 10 mL de 1x DPBS. Boné com uma agulha de 25 G. A seringa será usada para dar descarga no coração.
2. Segure a pele com pinças (Estilo 5) e corte com uma tesoura fina da base do abdômen até a parte superior do pescoço.
3. Abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica.
4. Levante o esterno com pinças (Estilo 5) e corte o diafragma, depois corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica.
5. Faça uma pequena incisão no átrio direito do coração.
6. Perfuse através da punção ventricular esquerda apical injetando lentamente 10 mL de 1x DPBS. Uma vez completamente perfundido, o fígado e o rim tornam-se castanhos claros na cor.
7. Limpe a cavidade torácica de sangue e fluidos íntegros usando uma esponja não tecida para absorver o material.

6. Isolamento da aorta e dos ramos (Figura 2C)

1. Remova órgãos (ou seja, pulmão, fígado, baço e órgãos gastrointestinais e reprodutivos) e corte a clavícula usando pinças (Estilo 5) e tesoura fina enquanto deixa o coração, rim e aorta intactos in situ.
   NOTA: Certifique-se de não dilacerar o coração ou quaisquer vasos sanguíneos principais.
2. Coloque o mouse sob um estereótipo.
3. Os ramos de aorta e aorta incluem artérias braquiocefálicas, artérias carótidas, artérias subclávias, artérias renais, artérias ilíacas comuns e artérias femorais usando pinças (Estilo 4) e tesouras de mola.
   NOTA: Cubra a aorta com uma esponja molhada e não tecida para evitar a desidratação enquanto disseca os galhos de aorta.
4. Disseque cuidadosamente e remova o adiposo avencionário e o tecido conjuntivo ao redor dos galhos de aorta e aorta usando pinças (Estilo 4) e tesouras de mola.
   NOTA: Como a inflamação é proeminente no aneurisma hiperlipidemia, é difícil remover a adventitia. Tenha cuidado para não rasgar ou cortar os galhos de aorta e aorta. Este passo requer prática e paciência.

7. Fixação de coração e aorta (Figura 2D,E)

1. Prepare uma seringa de 10 mL com 10 mL de 4% de formaldeído em 1x de DPBS. Boné com uma agulha de 25 G.
   ATENÇÃO: O formaldeído é perigoso. Leia o MSDS antes de trabalhar com este produto químico. Use luvas e óculos de segurança e produza as soluções de diluição dentro de um capô de fumaça.
   NOTA: 4% da solução de formaldeído degrada-se ao longo do tempo. É importante usar formaldeído de 4% recém-feito para fixação.
2. Fixar a árvore vascular através de punção ventricular esquerda apical injetando lentamente 10 mL de formaldeído de 4%.
   NOTA: A fixação do formaldeído interfere em várias aplicações a jusante, como cultura celular, análise FACS e análise de sequenciamento de RNA unicelular. Pule esta etapa se a aorta for usada para qualquer uma dessas aplicações.
3. Limpe a cavidade torácica de qualquer fluido íntegro com uma esponja não tecida para absorver o material.
4. Separe o coração da aorta segurando o coração com pinças (Estilo 4) e usando uma tesoura de mola micro-dissecando.
   NOTA: Para realizar en face Oil Red O mancha após esta etapa, recomenda-se cortar a aorta aberta in situ em vez de ex vivo e seguir para a seção 8. Isso torna mais fácil para a aorta en face para deitar plana.
5. Isole e extirpa a aorta e seu major de 1 mm acima da artéria carótida até o final da artéria femoral usando pinças (Estilo 4) e tesoura de mola.
6. Transfira o vaso para uma placa de cera de Petri ou tubo de microcentrifutura de 1,5 mL e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

8. Manchas e imagens de aorta inteira não aberta (Figura 3)

1. Coloque o recipiente em uma placa de cera de Petri usando pinos minutien (Figura 3A).
2. Enxágüe o vaso uma vez com 1x DPBS.
3. Despeje 25 mL de solução fresca de Óleo Vermelho O na placa de Petri (Figura 3B).
   NOTA: (1) Isopropanol é perigoso e um líquido inflamável. Use equipamentos de proteção individual adequados. (2) A solução Oil Red O pode facilmente precipitar. As partículas precipitadas podem interferir com a coloração subsequente. É importante remover o precipitado filtrando a solução Oil Red O através de um filtro de 0,45 μm antes de usar. (3) É melhor preparar a solução de O Vermelho-O fresco e descartar qualquer solução nãousada. (4) Além do Óleo Vermelho O, o Sudão IV é outro composto químico usado para coloração de lipídios, triglicérides e lipoproteínas. No entanto, o O Vermelho Óleo tem gradualmente substituído o Sudão IV porque a cor vermelha produzida pelo Óleo Vermelho O é mais intensa e pode, assim, tornar a gordura muito mais fácil de ver.
4. Manche a aorta por 60 min em temperatura ambiente (RT). Óleo Vermelho O manchará placa rica em lipídios vermelho, deixando outras não-placas contendo áreas pálidas de cor.
5. Lave uma vez por 20 min com isopropanol de 60% na RT.
   NOTA: O excesso de lavagem pode desestabilizar a placa.
6. Enxágüe a aorta 3x com _dH2O por 5 minutos para remover isopropanol.
7. Sob um estereótipo, limpe suavemente todo o tecido adiposo perivascular ao redor da aorta usando pinças (Estilo 4) e tesoura de mola (Figura 3C,D).
   NOTA: É importante limpar todo o tecido adiposo perivascular ao redor da aorta e seus ramos após a coloração, pois o tecido adiposo perivascular manchado de óleo pode produzir fundo falso e interferir na morfometria da placa e quantificação da área da placa. Certifique-se de não remover uma parte da parede aórtica. Encha o prato de cera com _dH2O até cobrir a aorta manchada durante a limpeza. Este passo requer prática e paciência.
8. Transfira a nave para um escorregador de microscópio de vidro limpo.
9. Adquira micrografias digitais usando uma câmera conectada a um microscópio de luz. Salvar imagens de alta resolução, de preferência em formato de arquivo de imagem marcado (TIFF) (Figura 3E).
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Para evitar que a aorta seque, transfira o vaso para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta. Armazenar a 4 °C.

9. En face aorta mounting (Figura 4, Figura 5)

1. Transfira o recipiente para uma placa de cera de Petri e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta.
2. Corte as artérias carótidas, subclávias do arco aórtico e artérias ilíacas na aorta abdominal 1-2 mm após bifurcações. Corte as artérias renais. (Figura 4A)
3. Corte longitudinalmente a preparação da aorta ao longo da curvatura interna (Figura 4B1) e sozinho artérias ilíacas (Figura 4B2) com tesoura de mola micro-dissecando.
4. Abra os três ramos do arco aórtico (ou seja, innominado, carótida comum, artéria subclávia esquerda) ao longo da curvatura maior até o nível base de curvatura interna (x-mark) (Figura 4B3-B8) com tesoura de mola micro-dissecando.
5. Fixar a aorta plana (face-up lado do lúmen) em um prato de cera com pinos de minutien e aplicar 1x DPBS até cobrir a aorta para evitar que ela seque (Figura 4C).
   NOTA: (1) É importante deixar a aorta enrolada e fixá-la no rosto sem esticar. Esta etapa levará alguns dias dependendo da gravidade da aterosclerose. (2) Para aortas de animais Apoe^//- ou Ldlr^{-/- recomenda-se} fixar o plano de aorta por 24 h. (3) O protocolo pode ser pausado aqui.
6. Limpe os slides do microscópio de vidro com 70% de etanol e limpadores de tarefas delicados (Figura 5A).
7. Transfira a aorta para um slide de microscópio de vidro limpo e coloque 15 gotas de composto de temperatura de corte ideal (OCT) em outro slide de microscópio de vidro limpo (Figura 5B).
8. Coloque cuidadosamente o slide do microscópio de vidro com composto OCT sobre a aorta e evite prender bolhas de ar no slide (Figura 5C).
9. Rotule os slides com nomes de amostra (Figura 5D).
   NOTA: Os slides montados na aorta podem ser armazenados na câmara de umidade a 4 °C por vários meses.

10. Imagem e quantificação da lesão da aorta en face (Figura 6)

1. Adquira micrografias digitais usando uma câmera conectada a um microscópio de luz. Salvar imagens de alta resolução, de preferência em formato de arquivo de imagem marcado (TIFF) (Figura 6A).
2. Transfira imagens da aorta en manchada inteira para um computador equipado com software ImageJ.
3. No ImageJ, selecione a ferramenta "Seleção à mão livre" e circule toda a placa manchada de Óleo Vermelho O manualmente (pontos vermelhos intensos) enquanto pressiona a tecla "Alt" (para PC Windows) ou "Shift" (para Mac). Em seguida, clique em "Medir" no menu "Analisar" para exibir áreas de lesão na janela de resultado (Figura 6B à esquerda).
   NOTA: Existem várias armadilhas da quantificação das lesões ateroscleróticas: (1) quaisquer pequenos pedaços de gordura aventurra manchada que permaneceram presos à aorta a partir do passo 8.7 podem produzir fundo falso e interferir na quantificação da placa; (2) remover uma parte da parede aórtica ou danificar a aorta das etapas 6.4 e 8.7 pode interferir na quantificação da placa; (3) bolhas e dobras formadas na aorta após a montagem (etapa 9.8) podem interferir na quantificação da placa; e (4) a placa aterosclerótica é um fenômeno 3D, e medições realizadas em um plano 2D podem não refletir a verdadeira extensão da placa. Além da análise da área da placa en face aorta, recomenda-se analisar o tamanho da placa na raiz aórtica, artéria braquiocefálica, aorta ascendente e aorta abdominal ^{separadamente8}.
4. Circule a linha de borda externa da aorta e clique em "Medir" no menu "Analisar" para exibir a área de aorta na janela de resultado (Figura 6B à direita).
5. Exporte todas as medidas para um arquivo Excel.
6. Calcule a razão da área da placa a partir da área total da aorta e normalize o valor como a porcentagem da área total da superfície de O Vermelho-Óleo.
7. Calcule a razão da área da placa em camundongos Apoe^-//- e 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe. Apresentar os dados como média ± SEM (Figura 6C).
8. Realize um teste t de um aluno não verificado para análise estatística da razão de dados da área da placa em comparação com outro grupo de camundongos. Considere as diferenças nos valores médios como significativas em p < 0,05.

Resultados

Neste protocolo, foram analisadas lesões ateroscleróticas em camundongos TGFβR2iSMC-Apoe após 4 meses em uma dieta HCHF7. Além da aterosclerose extensiva, esses camundongos desenvolveram aneurismas de aoórtica torácica e abdominal, como relatado anteriormente. Em comparação com os camundongos Apoe^-/- camundongos, as paredes aórticas de camundongos TGFβR2iSMC-Apoe apresentaram aterosclerose grave, dificultando a dissecação das lesões (

Discussão

Apolipoproteína E (Apoe) e os camundongos deficientes do receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr) são úteis para estudar o desenvolvimento e o tratamento da aterosclerose. Os pesquisadores podem avaliar o impacto da genética e manipulações terapêuticas na iniciação, progressão e regressão de doenças relacionadas à aterosclerose, progressão e regressão usando a coloração de Óleo Vermelho O de toda a ^aorta9. A coloração de O vermelho e a quantificaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	DENVILLE	C2170
10 mL syringe	BD	302995
16% Formaldehyde	Polysciences	18814-10
70% ethanol	VWR	RC2546.70-5	To clean the dissection tools
Black dissection wax	CR Scientific	C3541
Corn oil	Sigma	C8267	Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit	QIAGEN	69506	To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4	Gibco	14190-144
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
High cholesterol high fat diet	Research Diets	D12108	To induce atherosclerosis
Imaging software	National Institutes of Health	Image J	Aortic lesion quantification
Isopropanol	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	ROBOZ	RS-5602	To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software	Olympus	DP Controller	For aorta imaging
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
Needle-25G	BD	305124
NonWoven Sponge	McKesson	94442000
Oil Red O	Sigma	O-0625	To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane	VWR	28143-312	To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	To dissect and clean the aorta
Statistical software	GraphPad	Prism 8	Statical analysis
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000	For aorta dissection
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	For aorta imaging
Tamoxifen	Sigma	T5648	To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5	Electron Microscopy Sciences	0302-5-PO	To dissect and clean the aorta