在化学定义条件下，成熟肾细胞与人类诱导多能干细胞的引导分化

摘要

这里介绍了一个化学定义的协议，用于从诱导多能干细胞中提取具有高效率（>90%）的人类肾细胞，并且独立于遗传操作或亚人口选择。此协议在 26 天内生成所需的细胞类型，可用于肾毒性测试和疾病建模。

摘要

肾脏疾病影响全球10%以上的人口，并花费数十亿美元的联邦开支。最严重的肾脏疾病和最终的末期肾衰竭通常是由球状细胞的损伤引起的，球状细胞是高度专业化的上皮细胞，与内皮细胞和球状基底膜一起发挥作用，形成肾脏的过滤屏障。肾医学的进步因初级组织供应有限和缺乏强大的人类功能性肾细胞（如足细胞）的衍生方法而受到阻碍。从干细胞等可再生能源中提取足细胞的能力有助于增进目前对人类肾脏发育和疾病机制的理解，并为治疗发现提供新的工具。本协议的目标是开发一种方法，从具有高效率和特异性的人类诱导多能茎（hiPS）细胞中提取成熟、后粒细胞，并在化学定义条件下。这种方法产生的HIPS细胞衍生的足细胞表达血统特异性标记（包括肾上腺素、波多辛和威尔姆肿瘤1），并表现出与成熟和功能性足细胞相关的特殊形态特征（包括初级和二次足部过程）。有趣的是，这些特殊特征在该领域广泛使用的不朽的足细胞系中明显缺乏，这表明此处描述的协议产生的人类肾细胞比通常用于研究人类肾脏生物学的现有足细胞系具有更成熟的表型。

引言

人类多能干细胞培养的进步，准备通过为研究人员提供可再生的、可扩展的生物材料来源，从而彻底改变再生医学、疾病建模和药物^筛选。此策略对于衍生出专业和功能性细胞类型特别有用，否则将难以获得。人类诱导的多能干细胞（hiPS）^细胞2，3，4，5特别有吸引力，因为它们的体细胞起源和它们代表个性化医学的潜力。然而，由于频繁使用定义不明确的培养条件，导致效率低下，非特定生成异质细胞群^6，7，开发方法从HIPS细胞中获取其他细胞血统仍然具有挑战性。

这里介绍的是一种在化学定义条件下从具有特异性和高效率的HIPS细胞中提取成熟肾细胞的方法。通过考虑细胞微环境中多种因素的作用，制定了干细胞分化策略，包括优化细胞培养介质中呈现的可溶性因子以及不溶性因素，如细胞外基质组件或粘合基板。鉴于特格林信号在细胞发育和功能中的重要性，初步检查了细胞表面的特格林受体的表达。β1集成物不仅在hiPS细胞中，而且在它们的衍生物中，包括中皮细胞^8，9，10中表达。随后的实验证实，与 β1 集成物（包括层压素 511 或层压素 511-E8 片段）结合使用时，与下面描述的可溶性感应介质结合使用时，支持 hiPS 细胞的粘附和分化到 podocyt 中。

细胞谱系承诺的诱导首先确认，在具有Activin A、CHIR99021和Y27632岩石抑制剂的介质存在的情况下，在层压涂层表面培养了两天的HIPS细胞可以分化成表达早期间皮标记HAND1、鹅科和胸针^8、11的细胞。用骨形态遗传蛋白7（BMP-7）和CHIR99021补充的中等体质细胞治疗14天，使表达肾病的中间间皮细胞得以衍生 原体细胞标记威尔姆的肿瘤1（WT1），奇跳过相关蛋白质1（OSR1）8，11，和配对盒基因2蛋白质（PAX2）12。为了获得成熟的肾球状细胞，中间间皮细胞经过45天的治疗，其新介质包括BMP-7、Activin A、血管内皮生长因子（VEGF）、全跨视网膜酸和CHIR99021。流细胞学和免疫染色用于确认>90%的细胞表现出成熟肾细胞^8、11、13的分子、形态和功能特征。这些特点包括发展初级和二级足部工艺:足细胞谱系特异性基因的表达，包括SYNPO、PODXL、MAF、EFNB2⁸和蛋白质的表达，包括波多辛、肾素和WT1 14、15、16。此外，还发现，通过使用商用介质^8，11，在培养中可保持长达四周的体外培养物^，从而在下游实验的时机上提供额外的灵活性。有关用于确定 hiPS-podo 细胞纯度的流细胞学面板的更多信息，请参阅我们之前的出版物^11。

研究方案

1. 试剂的制备

1. 稀释解冻5倍高PS细胞培养介质（CCM）补充在HIPS细胞培养基质介质获得1倍溶液的HIPS CCM。
   注: 冷冻 5 倍高音响 CCM 补充剂需要一个缓慢的解冻过程， 理想情况下在 4 °C 过夜.1x hiPS CCM 的 Aliquot 可在 -20 °C 下存储长达 6 个月。
2. 准备地下室膜 （BM） 矩阵 1 涂层板用于 hiPS 细胞培养:解冻 BM 矩阵 1 在 4 °C 的冰上过夜。解冻后，根据制造商的建议，准备具有适当稀释因子的阿利报价。
   注:通常，在 50 mL 圆锥管中，在 25 mL 的冷 DMEM/F12 中，然后进行彻底混合，以完全溶解 BM 矩阵 1 并避免形成残晶。
3. 将 BM 矩阵 1 溶液的 1 mL 转移到 6 井板的每个井中，并在 37 °C 下以 1-2 h 或 4 °C 孵育，至少 24 小时，用石蜡薄膜包裹。BM 矩阵 1 涂层板可在 4 °C 下存储长达 2 周。
4. 制备地下室膜 （BM） 基质 2 - 涂层板:在 9 mL 无菌蒸馏水中稀释适量的 BM 基质 2，以准备 5 μg/mL 的最终浓度。在 12 井板的每个井中加入 700 μL 的 BM 矩阵 2 溶液，并在室温下孵育板 2 小时或在 4 °C 下过夜。
5. 准备 100 μg/mL 库存解决方案，BMP7、Activin A 和 VEGF 各如下:在含有 0.1% （wt/vol） BSA 的无菌蒸馏水中重组 BMP7，并在含有 0.1% （wt/vol） BSA 的无菌 PBS 中分别重组 Activin A 和 VEGF。为了避免频繁的冻结-解冻周期，从每个库存溶液中准备 100 μL 的 aliquot，并在 -20 °C 下存储长达 6 个月。
6. 在 3.079 mL 的无菌蒸馏水中溶解 10 毫克 Y27632，准备 10 mM 库存溶液 27632 日元。Aliquot 100 μL 从股票和存储在 -20 °C 长达 6 个月。
7. 溶解 2 毫克的 CHIR99021 在 143.4 μL 的无菌 DMSO 中，以准备 30 mM 库存溶液。准备 5 μL 的 aliquot，并在 -20 °C 下存放长达 1 个月（或根据制造商的建议）。
8. 溶解10毫克全跨 视网膜酸在3.33 mL无菌DMSO。准备 500 μL 的 aliquot，并在 -20 °C 下存储长达 6 个月。

2. 文化媒体的准备

1. 准备中皮分化介质，通过重组相应的库存解决方案，最终浓度为 100 ng/mL Activin A、3 μM CHIR99021、10 μM Y27632 和 1x B27 无血清补充剂，在适当的 DMEM/12 卷中加入谷氨酰胺补充剂。
   注:介质分化介质应在分化步骤之前以适合实验规模的体积（通常，50 mL 的介质足以满足两个 12 井板）进行新准备。
2. 准备中间中皮分化介质，通过重组相应的库存解决方案，最终浓度为 100 ng/mL BMP7、3 μM CHIR99021 和 1x B27 无血清补充剂，在 DMEM/F12 中加入谷氨酰胺补充剂。
   注:如果需要，介质可以补充1%（vol/vol）青霉素-链霉素。使用DMEM/F12与谷氨酰胺补充剂调整介质的体积。这种介质可以大批量准备:但是，建议存储在较小的小孔（例如，50 mL 圆锥管中的 45 mL）中，以避免重复冻结- thaw 循环。此介质可在 -20 °C 下存储长达 3 个月，并在使用前在 4 °C 过夜解冻。
3. 通过重组到最终浓度 100 ng/mL BMP7 来准备囊细胞感应介质， 100 ng/mL 活性素 A， 50 ng/mL VEGF， 3 μM CHIR99021， 1x B27 无血清补充剂， 和 0.1 μM 全跨视网膜酸在 DMEM/F12 与谷氨酰胺补充剂.保护介质免受光线照射（例如，用铝箔纸包装容器）。
   注:此介质可大批量准备，并在-20 °C的黑暗中储存长达3个月。冷冻的阿利库特应在使用前在 4 °C 下解冻过夜。
4. 在 DMEM/F12 中加入 10% （vol/vol） 热灭活 FBS 并在无菌条件下过滤，准备 25 mL 的试用素中和解决方案。
5. 对于干细胞衍生的足细胞的分化后维护，根据制造商的指南，通过在基础介质中添加补充剂，准备完整的介质，并在 4 °C 下存储长达两周。

3. 使用 hiPS 细胞培养介质的无喂食高音细胞培养

1. 从预涂层板中吸出BM矩阵1的剩余溶液，用1至2mL的加热DMEM/F12清洗油井3次。
2. 从 hiPS 细胞中吸气用 HIPS CCM，用加热的 DMEM/F12 冲洗细胞 3 次。加入1mL的热细胞分离溶液，在37°C下孵育1分钟，帮助分离细胞。在组织培养显微镜下对细胞进行目视检查，确保细胞群落的边缘出现圆润，然后快速将细胞分离溶液从细胞中吸气（确保细胞群落仍然附着在板上，尽管松散）。用 DMEM/F12 轻轻冲洗细胞一次，以去除细胞分离溶液。
3. 将 3 mL 的 HIPS CCM 添加到使用细胞分离溶液处理的 hiPS 细胞（在 6 井板的每个井中）。使用细胞提升器刮菌落，并轻轻地将移液器细胞悬架向上和向下移出松散粘附的细胞。彻底清洗板，以确保所有细胞都收获。
   注意:建议使用 5 mL 移液器以避免细胞上出现过量的剪切。
4. 将 0.5 mL 的电池悬架转移到每口新 BM 矩阵 1 涂层 6 井板的每个井中，每口井含有 2 mL 的 HIPS CCM。以图八的方式移动板，在井内分配细胞群落，并在 5% CO₂ 孵化器中以 37 °C 孵育。每天刷新介质，直到细胞准备好通过或用于分化实验（约70%的汇流）。
   注:使用 hiPS CCM（无 ROCK 抑制剂）在无馈线条件下，iPSC 常规传递的理想菌落大小在 200-500 μm 之间。如果细胞在治疗过程中与分离酶或缓冲器个性化，hiPS CCM 可以补充 ROCK 抑制剂（例如 10 μM Y27632），以提高细胞的生存能力。

4. 将 HIPS 细胞分化为间皮细胞（天 0-2）

1. 虽然HIPS细胞培养处于指数增长阶段（大约在传递后4天内培养，约70%的汇合），视觉检查在菌落边缘内和周围自发分化细胞的存在。如有必要，不恰当地刮掉区分区域。
2. 从 hiPS 细胞中吸气高音红素 CCM，并用温暖的 DMEM/F12 冲洗细胞 3 次。在 37 °C 下用 1 mL 的无酶细胞分离缓冲器孵育细胞 10 分钟，并在显微镜下检查分离情况。由于不同 HIPS 细胞系之间的固有差异，因此必须确定给定细胞系的细胞分离缓冲器的实际孵化时间。
3. 用细胞升降机轻轻刮打井，以移出松散粘附的细胞，并将细胞悬浮转移到 15 mL 圆锥管中，然后上下多次管道以个性化 HIPS 细胞。
   1. 在室温下，将电池悬架与温暖的 DMEM/F12 和离心机一起将电池悬架带到 15 mL 体积中，在 290 x g 下进行 5 分钟。
   2. 轻轻地吸气超纳特，用温暖的DMEM/F12重新吸纳细胞，进行另一轮离心，以去除残余的BM矩阵1和分离缓冲元件。
4. 如上文所述，在 1 mL 的中皮感应介质中吸气超高分子和再吸血细胞。使用血细胞计或卷子计数器计数器计数细胞总数，以确定实现 1 x 10⁵ 细胞/mL 浓度所需的介质分化介质的适当体积。
5. 从BM矩阵2涂层板中吸气ECM溶液，用温暖的DMEM/F12冲洗盘子两次。通过管道轻轻混合好几下 HIPS 细胞悬架。将 1 mL 的电池悬架转移到 BM 矩阵 2 涂层的 12 井板的每个井，然后轻轻摇动板，以更均匀地分配细胞。
6. 在 5% CO₂ 孵化器中将板孵化在 37 °C 下。第二天刷新介质感应介质。
   注:2天后，HIPS细胞衍生的中皮细胞将准备好进行中间间皮诱导。

5. 将HIPS细胞衍生的中皮细胞分化为中间间皮（第2-16天）

1. 在分化协议的第 2 天，吸气介质感应介质，并补充每井中间介质介质 1 mL。
2. 每天刷新介质，以保持代谢活性细胞的生长因子和小分子的准确阈值。如果细胞大量生长和介质营养物质的快速消耗（通过介质的发黄来表示），中间间皮分化介质的体积可以增加到12井板每井1.3mL。
3. 培养细胞额外的14天，以获得中间中皮细胞。到第16天，这些细胞可以冷冻保存，供以后使用。

6. 将HIPS细胞衍生的中间间皮细胞分化成卵细胞（第16至21天）

1. 用温暖的DMEM/F12冲洗中间中皮细胞，然后以每口0.05mL的0.05%试金-EDTA在37°C下孵育细胞3分钟。进行目视检查，以确保细胞开始分离。
2. 使用细胞提升器刮细胞，并多次使用 1，000 μL 移液器尖端将细胞悬浮液移液器，以获得个性化（或小块）细胞。
   注:在此阶段，确保细胞完全分离，因为聚合的细胞可能无法在协议的时间表内获得最终分化表型。
3. 每口试丁香中和溶液添加约2ml，以阻止试丁石的活动。
4. 使用 DMEM/F12 将细胞转移到 50 mL 圆锥管中，将体积调至 50 mL，然后在室温下在 201 x g 下离心电池悬架 5 分钟。
5. 在细胞诱导介质中吸气超高细胞和再吸血细胞。为了获得最佳结果，请确保最终播种密度约为 100，000 个细胞/井的 12 个井板。将细胞悬浮件添加到BM矩阵2涂层板中，轻轻摇动板，以帮助更均匀地分配细胞。
6. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育细胞，每天刷新介质长达 5 天，以便在第 21 天获得卵细胞。
   注:通过使用完整的带卵细胞维护介质的介质，可在培养中再保持 2-4 周。一旦进入细胞维护介质，细胞可以每隔一天喂一次，可用于后续研究或下游分析。

结果

本协议的目的是证明成熟的人类卵母细胞可以在化学定义的条件下从HIPS细胞中提取。这份手稿中提供的数据是使用DU11 hiPS细胞线¹⁷生成的，该线首先被测试，并发现没有支原体。还进行了染色体分析，发现这些细胞在肌体上是正常的。从未分化的 DU11 HIPS 细胞开始， 本报告概述的分化策略（图1）首先将干细胞（图2A）分化为表达Brachyu...

讨论

在这份报告中，我们描述了从HIPS细胞中生成肾球状细胞的一个协议。HIPS细胞衍生的足细胞表现出形态和分子特征与成熟的肾多细胞表型¹³相关。在以前的出版物中，我们表明，HIPS细胞衍生的足细胞可以模仿肾球菌的结构和选择性过滤功能，当与球状微血管内皮细胞在一个敷衍的微流体器官片上设备^8，11共同培养。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)	72262	Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement	17504044	Thermo/Life Technologies
CHIR99021	04-0004	Stemgent	May show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R	4Z0-500-R	Cell Systems	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	12634028	Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	10565042	Thermo/Life Technologies	DMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	10082147	Thermo/Life Technologies
Human activin A	PHC9564	Thermo/Life Technologies
Human BMP7	PHC9544	Thermo/Life Technologies
Human VEGF	PHC9394	Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium	05850	Stem Cell Technologies	hiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)	15140-163	Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor	1254	Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies	A32744; A32754; A-11076; A32790	Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)	ab20680	Abcam
Nephrin	GP-N2	Progen
OCT4	AF1759	R&D Systems
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	N-892012	Iwai North America	Basement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	354277	BD Biosciences	Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
Accutase	A1110501	Thermo/Life Technologies	Cell detachment solution
BSA	A9418	Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D2438	Sigma-Aldrich	DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt	13150016	Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	97065-058	VWR	Ethanol is flammable and toxic
FBS	431097	Corning
Paraformaldehyde (PFA)	28906	Thermo/Life Technologies	PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)	14190-250	Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water	15230162	Thermo/Life Technologies
Triton X-100	97062-208	VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%	25300-120	Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped	29442-462	Corning
Avanti J-15R Centrifuge	B99516	Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL	352097	Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL	352098	Corning
Cryoboxes	3395465	Thermo/Life Technologies	For storing frozen aliquots
EVOS M7000	AMF7000	Thermo/Life Technologies	Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer	100503-092	VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	51030403	Thermo/Life Technologies	For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)	Carl Zeiss Microscopy	Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves	40101-346	VWR
Kimwipes, large	21905-049	VWR
Kimwipes, small	21905-026	VWR
P10 precision barrier pipette tips	P1096-FR	Denville Scientific
P100 barrier pipette tips	P1125	Denville Scientific
P1000 barrier pipette tips	P1126	Denville Scientific
P20 barrier pipette tips	P1121	Denville Scientific
P200 barrier pipette tips	P1122	Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped	356551	Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped	356525	Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped	356543	Corning
Steriflip, 0.22 μm, PES	SCGP00525	EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes	1138W14	Thomas Scientific	For aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates	353043	Corning
Tissue culture–treated six-well plates	353046	Corning
VWR white techuni lab coat	10141-342	VWR
Wide-beveled cell lifter	3008	Corning