Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Zusammenfassung

Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (>90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.

Zusammenfassung

Nierenerkrankungen betreffen mehr als 10% der Weltbevölkerung und kosten Milliarden von Dollar an Bundesausgaben. Die schwersten Formen der Nierenerkrankung und das eventuelle Nierenversagen im Endstadium werden oft durch die Schädigung der glomerulären Podozyten verursacht, bei denen es sich um die hochspezialisierten Epithelzellen handelt, die zusammen mit Endothelzellen und der glomerulären Basalmembran die Filtrationsbarriere der Niere bilden. Fortschritte in der Nierenmedizin wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Primärgewebe und das Fehlen robuster Methoden zur Ableitung funktioneller menschlicher Nierenzellen wie Podozyten behindert. Die Fähigkeit, Podozyten aus erneuerbaren Quellen wie Stammzellen abzuleiten, könnte dazu beitragen, das aktuelle Verständnis der Mechanismen der menschlichen Nierenentwicklung und -krankheit zu verbessern und neue Werkzeuge für die therapeutische Entdeckung bereitzustellen. Ziel dieses Protokolls war es, eine Methode zu entwickeln, um reife, postmiotische Podozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) mit hoher Effizienz und Spezifität und unter chemisch definierten Bedingungen abzuleiten. Die mit dieser Methode produzierten hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten exprimieren linienspezifische Marker (einschließlich Nephrin, Podocin und Wilm-Tumor 1) und weisen die spezialisierten morphologischen Merkmale (einschließlich primärer und sekundärer Fußprozesse) auf, die mit reifen und funktionellen Podozyten verbunden sind. Interessanterweise fehlen diese spezialisierten Merkmale in der immortalisierten Podozytenzelllinie, die in diesem Bereich weit verbreitet ist, was darauf hindeutet, dass das hier beschriebene Protokoll menschliche Nierenpodozyten produziert, die einen entwicklungsreiferen Phänotyp aufweisen als die bestehenden Podozytenzelllinien, die typischerweise zur Untersuchung der menschlichen Nierenbiologie verwendet werden.

Einleitung

Fortschritte in der humanen pluripotenten Stammzellkultur sind bereit, die regenerative Medizin, die Krankheitsmodellierung und das Drogenscreening zu revolutionieren, indem sie Forschern eine erneuerbare, skalierbare Quelle für biologisches Material zur Verfügung stellen, die entwickelt werden kann, um fast jeden Zelltyp im menschlichen Körper zu erhalten¹. Diese Strategie ist besonders nützlich, um spezialisierte und funktionelle Zelltypen abzuleiten, die sonst schwer zu erhalten wären. Human induced pluripotent stem (hiPS) Zellen^2,3,4,5 sind aufgrund ihrer somatischen Zellursprung und des Potenzials, das sie für die personalisierte Medizin darstellen, besonders attraktiv. Die Entwicklung von Methoden zur Ableitung anderer Zelllinien aus hiPS-Zellen bleibt jedoch aufgrund der häufigen Verwendung schlecht definierter Kulturbedingungen, die zu einer geringen Effizienz und unspezifischen Erzeugung heterogener Zellpopulationen^führen,eine Herausforderung⁶,⁷.

Hier wird eine Methode zur Ableitung reifer Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen mit Spezifität und hoher Effizienz unter chemisch definierten Bedingungen vorgestellt. Unter Berücksichtigung der Rolle mehrerer Faktoren innerhalb der zellulären Mikroumgebung wurde eine Stammzelldifferenzierungsstrategie entwickelt, die die Optimierung löslicher Faktoren im Zellkulturmedium sowie unlöslicher Faktoren wie extrazelluläre Matrixkomponenten oder adhäsive Substrate beinhaltete. Angesichts der Bedeutung der Integrinsignalisierung für die Entwicklung und Funktion von Podozyten wurde zunächst die Expression von Integrinrezeptoren auf der Zelloberfläche untersucht. β1-Integrine wurden nicht nur in hiPS-Zellen, sondern auch in ihren Derivaten einschließlich Mesoderm- und Intermesodermzellen stark exprimiert^8,9,10. Nachfolgende Experimente bestätigten, dass Liganden, die an β1-Integrine binden (einschließlich Laminin 511 oder Laminin 511-E8-Fragment), die Adhäsion und Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten unterstützen, wenn sie in Verbindung mit den unten beschriebenen löslichen induktiven Medien verwendet werden.

Die Induktion der Zelllinienverpflichtung wurde eingeleitet, indem zunächst bestätigt wurde, dass hiPS-Zellen, die zwei Tage lang auf den lamininbeschichteten Oberflächen in Gegenwart eines Mediums kultiviert wurden, das Activin A, CHIR99021 und Y27632 Rock-Inhibitor enthält, sich in Zellen differenzieren können, die die frühen Mesodermmarker HAND1, Goosecoid und Brachyury^8,11exprimieren. Die Behandlung der Mesodermzellen für 14 Tage mit einem Medium, das mit Knochenmorphogenetikprotein 7 (BMP-7) und CHIR99021 ergänzt wurde, ermöglichte die Ableitung von intermediären Mesodermzellen, die die Nephron-Vorläuferzellmarker Wilms Tumor 1 (WT1), odd-skipped related protein 1 (OSR1)^8,11und paired box gene 2 protein (PAX2)¹²exprimierten. Um die reifen glomerulären Nierenpodozyten abzuleiten, wurden die intermediären Mesodermzellen 4–5 Tage lang mit einem neuartigen Medium behandelt, das aus BMP-7, Activin A, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF),All-trans-Retinsäure und CHIR99021 besteht. Durchflusszytometrie und Immunfärbung wurden verwendet, um zu bestätigen, dass >90% der resultierenden Zellen die molekularen, morphologischen und funktionellen Eigenschaften des reifen Nierenpodozyten^{aufwiesen 8,11,13}. Zu diesen Eigenschaften gehören die Entwicklung von primären und sekundären Fußprozessen; die Expression von Podozytenlinien-spezifischen Genen einschließlich SYNPO, PODXL, MAF, EFNB2⁸ und die Expression von Proteinen wie Podocin, Nephrin und WT1^14,15,16. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten bis zu vier Wochen in vitro in Kultur gehalten werden^können,indem ein kommerziell erhältliches Medium⁸,¹¹ verwendet wird, das eine zusätzliche Flexibilität beim Timing nachgeschalteter Experimente bietet. Weitere Informationen zu den Durchflusszytometrie-Panels, die zur Bestimmung der Reinheit der hiPS-Podozyten verwendet werden, finden Sie in unserer vorherigen Publikation¹¹.

Protokoll

1. Herstellung von Reagenzien

1. Verdünnen Sie aufgetaute 5x hiPS Zellkulturmedien (CCM) Ergänzung in hiPS Zellkultur Basalmedium, um eine 1x Lösung von hiPS CCM zu erhalten.
   HINWEIS: Gefrorene 5x hiPS CCM Ergänzung erfordert einen langsamen Auftauprozess, idealerweise bei 4 ° C für über Nacht. Aliquots des 1x hiPS CCM können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
2. Herstellung von Basalmembran (BM) Matrix 1-beschichteten Platten für hiPS Zellkultur: BM Matrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen Aliquoten mit geeigneten Verdünnungsfaktoren vorbereiten, wie vom Hersteller vorgeschlagen.
   HINWEIS: Typischerweise werden Aliquoten für die anschließende Verdünnung in 25 ml kaltem DMEM/F12 in einem konischen 50-ml-Röhrchen vorbereitet, gefolgt von einer gründlichen Mischung, um die BM-Matrix 1 vollständig aufzulösen und die Bildung von Restkristallen zu vermeiden.
3. 1 ml der BM-Matrix-1-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte geben und bei 37 °C für 1-2 h oder bei 4 °C für mindestens 24 h inkubieren, in Paraffinfolie eingewickelt. Die BM matrix 1 -beschichteten Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
4. Herstellung der Basalmembran (BM) Matrix 2 - beschichtete Platten: Verdünnen Sie geeignete Mengen bm matrix 2 in 9 mL sterilem destilliertem Wasser, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml herzustellen. 700 μL der BM-Matrix-2-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte geben und die Platte bei Raumtemperatur für 2 h oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
5. 100 μg/ml Stammlösungen von BMP7, Activin A und VEGF werden wie folgt zubereitet: BMP7 in sterilem destilliertem Wasser mit 0,1 % (Gew./Vol)BSA rekonstituieren und Activin A und VEGF separat in sterilem PBS mit 0,1 % (Gew./Vol) BSA rekonstituieren. Um häufige Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, bereiten Sie 100 μL Aliquoten aus jeder Lagerlösung vor und lagern Sie sie bei -20 °C für bis zu 6 Monate.
6. Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Y27632 vor, indem Sie 10 mg Y27632 in 3,079 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen. Aliquot 100 μL aus dem Lager und lagern Sie bei -20 °C für bis zu 6 Monate.
7. 2 mg CHIR99021 werden in 143,4 μL sterilem DMSO gelöst, um eine 30 mM Stammlösung zu erhalten. 5 μL Aliquoten vorbereiten und bei -20 °C bis zu 1 Monat lagern (oder nach Herstellerempfehlung).
8. 10 mg Trans-Retinsäure in 3,33 ml sterilem DMSO auflösen. 500 μL Aliquoten vorbereiten und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern.

2. Vorbereitung von Kulturmedien

1. Bereiten Sie das Mesodermdifferenzierungsmedium vor, indem Sie entsprechende Stammlösungen zu einer Endkonzentration von 100 ng/ ml Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 und 1x B27 serumfreie Ergänzung in einem geeigneten Volumen von DMEM/12 mit Glutaminpräparat rekonstituieren.
   HINWEIS: Das Mesodermdifferenzierungsmedium sollte vor den Differenzierungsschritten und in einem für den Umfang des Experiments geeigneten Volumen frisch zubereitet werden (typischerweise sind 50 ml Medium für zwei 12-Well-Platten ausreichend).
2. Herstellung eines Intermesodermdifferenzierungsmediums, indem entsprechende Stammlösungen zu einer Endkonzentration von 100 ng/ml BMP7, 3 μM CHIR99021 und 1x B27 serumfreien Ergänzung in DMEM/F12 mit einem Glutaminpräparat rekonstituiert werden.
   HINWEIS: Bei Bedarf kann das Medium mit 1% (vol/vol) Penicillin-Streptomycin ergänzt werden. Stellen Sie die Lautstärke des Mediums ein, indem Sie DMEM / F12 mit Glutaminpräparat verwenden. Dieses Medium kann in großen Chargen hergestellt werden; Es wird jedoch empfohlen, in kleineren Aliquoten (z. B. 45 ml in konischen 50 ml Röhrchen) zu lagern, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Diese Medien können bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert und vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden.
3. Bereiten Sie das Podozyteninduktionsmedium vor, indem Sie es auf eine Endkonzentration von 100 ng / ml BMP7, 100 ng / ml Aktivin A, 50 ng / ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumfreie Ergänzung und 0,1 μM All-trans-Retinsäure in DMEM / F12 mit Glutaminpräparat rekonstituieren. Medium vor Licht schützen (z.B. durch Einwickeln des Behälters mit Folienpapier).
   HINWEIS: Dieses Medium kann in großen Chargen zubereitet und im Dunkeln bei -20 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. Gefrorene Aliquoten sollten vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden.
4. Bereiten Sie 25 ml Trypsin-Neutralisationslösung vor, indem Sie 10% (vol / vol) wärmeinaktiviertes FBS in DMEM / F12 hinzufügen und unter sterilen Bedingungen filtern.
5. Für die Aufrechterhaltung der aus Stammzellen gewonnenen Podozyten nach der Differenzierung bereiten Sie Complete Medium mit Podozyten-Erhaltungsmedien vor, indem Sie das Supplement gemäß den Richtlinien des Herstellers zum Basalmedium hinzufügen und bei 4 °C bis zu zwei Wochen lagern.

3. Feederfreie hiPS-Zellkultur mit hiPS-Zellkulturmedium

1. Die Restlösung der BM-Matrix 1 von den vorbeschichteten Platten absaugen und die Vertiefungen 3 mal mit 1 bis 2 ml erwärmtem DMEM/F12 waschen.
2. Saugen Sie verbrauchtes hiPS CCM aus den hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 mal mit erwärmtem DMEM / F12. Fügen Sie 1 ml warme Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie sie für 1 minute bei 37 ° C, um die Zellen zu dissoziieren. Führen Sie eine visuelle Inspektion der Zellen unter einem Gewebekulturmikroskop durch und stellen Sie sicher, dass die Ränder der Zellkolonien abgerundet erscheinen, und saugen Sie dann schnell die Zellablösungslösung von den Zellen ab (um sicherzustellen, dass die Zellkolonien immer noch an der Platte befestigt sind, wenn auch locker). Spülen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit DMEM/F12 ab, um die Zellablösungslösung zu entfernen.
3. Fügen Sie 3 ml hiPS CCM zu den hiPS-Zellen (in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte) hinzu, die mit der Zellablösungslösung behandelt wurden. Kratzen Sie Kolonien mit einem Zelllifter und pipetetten Sie die Zellsuspension vorsichtig nach oben und unten, um die lose anhaftenden Zellen zu lösen. Waschen Sie den Teller gründlich, um sicherzustellen, dass alle Zellen geerntet werden.
   HINWEIS: Die Verwendung einer 5-ml-Pipette wird empfohlen, um eine übermäßige Scherung der Zellen zu vermeiden.
4. 0,5 ml der Zellsuspension werden in jede Vertiefung einer neuen BM-Matrix-1-beschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml hiPS-CCM pro Vertiefung übertragen. Bewegen Sie die Platte in Figur-Acht-Manier, um Zellkolonien in Vertiefungen zu verteilen und bei 37 °C in einem 5 % CO 2-Inkubator_zu inkubieren. Das Medium täglich auffrischen, bis die Zellen bereit sind, durchzufahren oder für das Differenzierungsexperiment verwendet zu werden (ca. 70 % Konfluenz).
   HINWEIS: Die ideale Koloniegröße für das routinemäßige Passieren von iPSCs liegt zwischen 200-500 μm unter feederfreien Bedingungen mit hiPS CCM (ohne ROCK-Inhibitor). Werden Zellen während der Behandlung mit Dissoziationsenzymen oder Puffern individualisiert, kann das hiPS CCM mit ROCK-Inhibitor (z.B. 10 μM Y27632) ergänzt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern.

4. Differenzierung von hiPS-Zellen in Mesodermzellen (Tage 0-2)

1. Während sich die hiPS-Zellkulturen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden (etwa innerhalb von 4 Tagen nach der Kultur nach dem Passaging und etwa 70% Konfluenz), untersuchen Sie visuell auf das Vorhandensein spontan differenzierter Zellen innerhalb und um die Ränder der Kolonien. Bei Bedarf Differenzierungsbereiche aseptisch abkratzen.
2. Saugen Sie hiPS CCM aus hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 mal mit warmem DMEM/F12. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml enzymfreiem Zelldissoziationspuffer für 10 min bei 37 °C und überprüfen Sie die Dissoziation unter einem Mikroskop. Aufgrund inhärenter Unterschiede zwischen verschiedenen hiPS-Zelllinien muss die tatsächliche Inkubationszeit für den Zelldissoziationspuffer für eine bestimmte Zelllinie bestimmt werden.
3. Kratzen Sie den Brunnen vorsichtig mit einem Zelllifter ab, um lose anhaftende Zellen zu lösen, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 mL konisches Rohr, gefolgt von mehrmaligem Pipettieren auf und ab, um die hiPS-Zellen zu individualisieren.
   1. Zellsuspension mit warmem DMEM/F12 und Zentrifuge für 5 min bei 290 x g bei Raumtemperatur auf das 15 mL Volumen bringen.
   2. Saugen Sie vorsichtig den Überstand an und reanimieren Sie die Zellen mit warmem DMEM / F12 für eine weitere Runde der Zentrifugation, um restierende BM-Matrix 1- und Dissoziationspufferkomponenten zu entfernen.
4. Saugen Sie die überstandenden und resuspendierten Zellen in 1 ml Mesoderm-Induktionsmedium ab, wie oben beschrieben. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zähler, um das geeignete Volumen des Mesodermdifferenzierungsmediums zu bestimmen, das erforderlich ist, um eine Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen / ml zu erreichen.
5. Saugen Sie ECM-Lösung aus den BM matrix 2-beschichteten Platten an und spülen Sie die Platten zweimal mit warmem DMEM/F12 ab. Mischen Sie die hiPS-Zellsuspension vorsichtig durch einige Male pipettieren. 1 ml der Zellsuspension auf jede Vertiefung der BM-Matrix 2-beschichteten 12-Well-Platten geben und dann die Platten vorsichtig schütteln, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.
6. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5% CO₂ Inkubator. Erfrischen Sie das Mesoderm-Induktionsmedium am nächsten Tag.
   HINWEIS: Nach 2 Tagen wären hiPS-Zell-abgeleitete Mesodermzellen bereit für die intermediäre Mesoderminduktion.

5. Differenzierung von hiPS-Zell-abgeleiteten Mesodermzellen in intermediäre Mesodermzellen (Tage 2-16)

1. Am Tag 2 des Differenzierungsprotokolls mesoderm-Induktionsmedium absaugen und mit 1 ml pro Vertiefung intermediäres Mesoderm-Induktionsmedium auffüllen.
2. Aktualisieren Sie das Medium jeden Tag, um eine genaue Schwelle von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen für die metabolisch aktiven Zellen aufrechtzuerhalten. Bei erheblichem Zellwachstum und rascher Erschöpfung der Mediennährstoffe (angezeigt durch die Gelbfärbung des Mediums) kann das Volumen des zwischengeschalteten Mesodermdifferenzierungsmediums auf 1,3 ml pro Vertiefung der 12 Wellplatten erhöht werden.
3. Kulturzellen für weitere 14 Tage, um intermediäre Mesodermzellen zu erhalten. Bis zum 16. Tag können diese Zellen für die spätere Verwendung kryokonserviert werden.

6. Differenzierung von hiPS-Zell-abgeleiteten zwischenmesodermzellen in Podozyten (Tage 16 bis 21)

1. Spülen Sie die zwischengeschalteten Mesodermzellen mit warmem DMEM/F12, gefolgt von einer Inkubation der Zellen mit 0,5 ml pro Vertiefung von 0,05 % Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 °C. Führen Sie eine visuelle Inspektion durch, um sicherzustellen, dass die Zellen beginnen, sich zu dissoziieren.
2. Kratzen Sie Zellen mit einem Zelllifter und pipetieren Sie die Zellsuspension mehrmals mit einer 1.000 μL Pipettenspitze, um individualisierte (oder kleine Klumpen von) Zellen zu erhalten.
   HINWEIS: Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass die Zellen vollständig dissoziiert sind, da aggregierte Zellen möglicherweise keinen terminal differenzierten Phänotyp innerhalb der Zeitleiste des Protokolls erwerben.
3. Fügen Sie etwa 2 ml pro Vertiefung Trypsin neutralisierende Lösung hinzu, um die Aktivität von Trypsin zu stoppen.
4. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Rohr und bringen Sie das Volumen mit DMEM/ F12 auf 50 ml und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension für 5 min bei 201 x g bei Raumtemperatur.
5. Saugen Sie die überstandenden und resuspendierten Zellen im Podozyteninduktionsmedium ab. Für optimale Ergebnisse stellen Sie eine endgültige Aussaatdichte von etwa 100.000 Zellen / Vertiefung einer 12-Well-Platte sicher. Fügen Sie die Zellsuspension zu den 2-beschichteten BM-Matrix-Platten hinzu und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.
6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO₂ und erfrischen Sie das Medium täglich für bis zu 5 Tage, um bis zum 21. Tag Podozyten zu erhalten.
   HINWEIS: Die resultierenden hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten können für 2-4 zusätzliche Wochen in Kultur gehalten werden, indem ein vollständiges Medium mit Podozyten-Erhaltungsmedien verwendet wird. Einmal in Podozyten-Erhaltungsmedien, können die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert werden und können für nachfolgende Studien oder nachgeschaltete Analysen verwendet werden.

Ergebnisse

Ziel dieses Protokolls war es zu zeigen, dass reife menschliche Podozyten unter chemisch definierten Bedingungen aus hiPS-Zellen gewonnen werden können. Die in diesem Manuskript vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der DU11 hiPS-Zelllinie¹⁷generiert, die zuerst getestet wurde und sich als frei von Mykoplasmen erwiesen hat. Es wurde auch eine Chromosomenanalyse durchgeführt, und die Zellen erwiesen sich als karyotypisch normal. Ausgehend von den undifferenzierten DU11 hiPS-Zellen wurde die...

Diskussion

In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von glomerulären Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen. Die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten weisen morphologische und molekulare Merkmale auf, die mit dem reifen Nierenpodozytenphänotyp¹³assoziiert sind. In früheren Veröffentlichungen haben wir gezeigt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten die Struktur und selektive Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmen können, wenn sie mit glomerulären mikrovaskulären En...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)	72262	Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement	17504044	Thermo/Life Technologies
CHIR99021	04-0004	Stemgent	May show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R	4Z0-500-R	Cell Systems	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	12634028	Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	10565042	Thermo/Life Technologies	DMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	10082147	Thermo/Life Technologies
Human activin A	PHC9564	Thermo/Life Technologies
Human BMP7	PHC9544	Thermo/Life Technologies
Human VEGF	PHC9394	Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium	05850	Stem Cell Technologies	hiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)	15140-163	Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor	1254	Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies	A32744; A32754; A-11076; A32790	Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)	ab20680	Abcam
Nephrin	GP-N2	Progen
OCT4	AF1759	R&D Systems
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	N-892012	Iwai North America	Basement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	354277	BD Biosciences	Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
Accutase	A1110501	Thermo/Life Technologies	Cell detachment solution
BSA	A9418	Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D2438	Sigma-Aldrich	DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt	13150016	Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	97065-058	VWR	Ethanol is flammable and toxic
FBS	431097	Corning
Paraformaldehyde (PFA)	28906	Thermo/Life Technologies	PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)	14190-250	Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water	15230162	Thermo/Life Technologies
Triton X-100	97062-208	VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%	25300-120	Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped	29442-462	Corning
Avanti J-15R Centrifuge	B99516	Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL	352097	Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL	352098	Corning
Cryoboxes	3395465	Thermo/Life Technologies	For storing frozen aliquots
EVOS M7000	AMF7000	Thermo/Life Technologies	Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer	100503-092	VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	51030403	Thermo/Life Technologies	For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)	Carl Zeiss Microscopy	Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves	40101-346	VWR
Kimwipes, large	21905-049	VWR
Kimwipes, small	21905-026	VWR
P10 precision barrier pipette tips	P1096-FR	Denville Scientific
P100 barrier pipette tips	P1125	Denville Scientific
P1000 barrier pipette tips	P1126	Denville Scientific
P20 barrier pipette tips	P1121	Denville Scientific
P200 barrier pipette tips	P1122	Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped	356551	Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped	356525	Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped	356543	Corning
Steriflip, 0.22 μm, PES	SCGP00525	EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes	1138W14	Thomas Scientific	For aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates	353043	Corning
Tissue culture–treated six-well plates	353046	Corning
VWR white techuni lab coat	10141-342	VWR
Wide-beveled cell lifter	3008	Corning