JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo quimicamente definido para a derivação de podocitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas com alta eficiência (>90%) e independente de manipulações genéticas ou seleção de subpopulação. Este protocolo produz o tipo de célula desejada dentro de 26 dias e pode ser útil para testes de nefrocoxicidade e modelagem de doenças.

Resumo

A doença renal afeta mais de 10% da população global e custa bilhões de dólares em gastos federais. As formas mais graves de doença renal e eventual insuficiência renal em estágio terminal são frequentemente causadas pelo dano aos podocitos glomerulares, que são as células epiteliais altamente especializadas que funcionam junto com células endoteliais e a membrana do porão glomerular para formar a barreira de filtragem do rim. Os avanços na medicina renal têm sido dificultados pela limitada disponibilidade de tecidos primários e pela falta de métodos robustos para a derivação de células renais humanas funcionais, como os podocitos. A capacidade de derivar podocitos de fontes renováveis, como células-tronco, poderia ajudar a avançar a compreensão atual dos mecanismos de desenvolvimento renal humano e doenças, bem como fornecer novas ferramentas para a descoberta terapêutica. O objetivo deste protocolo foi desenvolver um método para derivar podocitos maduros e pós-mitóticos de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS) com alta eficiência e especificidade, e sob condições quimicamente definidas. Os podócitos derivados de células hiPS produzidos por este método expressam marcadores específicos de linhagem (incluindo nefrina, podocina e tumor 1 de Wilm) e exibem as características morfológicas especializadas (incluindo processos de pé primário e secundário) associadas a podocitos maduros e funcionais. Curiosamente, essas características especializadas estão notavelmente ausentes na linha celular podocito imortalizada amplamente utilizada no campo, o que sugere que o protocolo descrito aqui produz podocitos renais humanos que têm um fenótipo de desenvolvimento mais maduro do que as linhas celulares podocyte existentes normalmente usadas para estudar biologia renal humana.

Introdução

Os avanços na cultura das células-tronco pluripotentes humanas estão prontos para revolucionar a medicina regenerativa, a modelagem de doenças e o rastreamento de medicamentos, fornecendo aos pesquisadores uma fonte renovável e escalável de material biológico que pode ser projetado para obter quase qualquer tipo de célula dentro do corpo humano1. Essa estratégia é especialmente útil para o derivado de tipos de células especializadas e funcionais que, de outra forma, seriam difíceis de obter. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS)células 2,3,4,5 são particularmente atraentes devido à sua origem celular somática e ao potencial que representam para a medicina personalizada. No entanto, o desenvolvimento de métodos para derivar outras linhagens celulares de células hiPS permanece desafiador devido ao uso frequente de condições culturais mal definidas que levam à baixa eficiência e geração não específica de populações de células heterogênios6,7.

Apresentado aqui é um método para a derivação de podocitos renais maduros de células hiPS com especificidade e alta eficiência em condições quimicamente definidas. Ao considerar os papéis de múltiplos fatores dentro do microambiente celular, desenvolveu-se uma estratégia de diferenciação de células-tronco que envolveu a otimização de fatores solúveis apresentados no meio da cultura celular, bem como fatores insolúveis, como componentes da matriz extracelular ou substratos adesivos. Dada a importância da sinalização integrin no desenvolvimento e função podocyte, a expressão de receptores integrin na superfície celular foi inicialmente examinada. β1 integrins foram altamente expressos não apenas em células hiPS, mas também em seus derivados, incluindo mesoderme e células intermediárias de mesoderme8,9,10. Experimentos subsequentes confirmaram que ligantes que se ligam a β1 integrinos (incluindo laminina 511 ou fragmento de laminina 511-E8) suportam a adesão e diferenciação das células hiPS em podocitos quando usados em conjunto com a mídia indutiva solúvel descrita abaixo.

A indução do compromisso de linhagem celular foi iniciada pela primeira vez confirmando que as células hiPS cultivadas nas superfícies revestidas de laminina por dois dias na presença de um meio contendo Activin A, CHIR99021 e Y27632 O inibidor de rocha pode se diferenciar em células que expressam os primeiros marcadores de mesoderme HAND1, goosecoid e brachyury8,11. O tratamento das células de mesoderme por 14 dias com um meio suplementado com proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) e CHIR99021 possibilitou a derivação de células intermediárias de mesoderme que expressavam os marcadores celulares nefrão-progenitor do Tumor 1 (WT1), proteína relacionada 1 (OSR1)8,11, e gene de caixa emparelhada 2 proteína (PAX2)12. Para derivar os podocitos glomerulares renais maduros, as células mesoderm intermediárias foram tratadas por 4-5 dias com um novo meio composto por BMP-7, Activin A, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ácido retinóicototalmente trans e CHIR99021. A citometria de fluxo e a imunossuagem foram utilizadas para confirmar que >90% das células resultantes apresentavam as características moleculares, morfológicas e funcionais do podocito renal maduro8,11,13. Essas características incluem o desenvolvimento de processos de pé primário e secundário; a expressão de genes específicos de linhagem podocyte, incluindo SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 e a expressão de proteínas incluindo podocina, nefrina e WT114,15,16. Além disso, verificou-se que os podocitos derivados de células hiPS podem ser mantidos na cultura por até quatro semanas in vitro usando um meiocomercialmentedisponível 8,11 que fornece uma flexibilidade adicional no tempo de experimentos a jusante. Para obter mais informações sobre os painéis de citometria de fluxo utilizados para determinar a pureza dos hiPS-podocytes, consulte nossa publicação anterior11.

Protocolo

1. Preparação de reagentes

  1. Diluir o suplemento de mídia de cultura celular hiPS (CCM) descontou em meio basal de cultura celular hiPS para obter uma solução 1x de hiPS CCM.
    NOTA: O suplemento CCM de 5x congelado requer um processo de descongelamento lento, idealmente em 4 °C durante a noite. As alíquotas do CCM 1x hiPS podem ser armazenadas por até 6 meses a -20 °C.
  2. Preparação da matriz de membrana de porão (BM) placas revestidas de 1 para a cultura celular hiPS: Descongelar matriz BM 1 durante a noite no gelo a 4 °C. Uma vez descongelado, prepare alíquotas com fatores de diluição adequados, conforme sugerido pelo fabricante.
    NOTA: Normalmente, as alíquotas são preparadas para diluição subsequente em 25 mL de DMEM/F12 frio em um tubo cônico de 50 mL seguido de mistura completa para dissolver completamente a matriz BM 1 e evitar a formação de cristais residuais.
  3. Transfira 1 mL da solução BM matrix 1 para cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por 1-2 h ou a 4 °C pelo mínimo de 24h, envolto em filme de parafina. As placas revestidas da matriz BM 1 podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.
  4. Preparação da matriz de membrana de porão (BM) 2 - placas revestidas: Diluir quantidades apropriadas de matriz BM 2 em 9 mL destilada estéril para preparar uma concentração final de 5 μg/mL. Adicione 700 μL da solução BM matrix 2 a cada poço de uma placa de 12 poços e incubar a placa em temperatura ambiente por 2h ou durante a noite a 4 °C.
  5. Prepare 100 soluções de estoque μg/mL cada uma de BMP7, Activin A e VEGF da seguinte forma: reconstitua bmp7 em água destilada estéril contendo 0,1% (wt/vol) BSA e reconstituir Activin A e VEGF separadamente em PBS estéril contendo 0,1% (wt/vol) BSA. Para evitar ciclos frequentes de congelamento, prepare 100 alíquotas de μL de cada solução de estoque e armazene a -20 °C por até 6 meses.
  6. Prepare uma solução de estoque de 10 mM de Y27632 dissolvendo 10 mg de Y27632 em 3,079 mL de água destilada estéril. Alíquota de 100 μL do estoque e loja a -20 °C por até 6 meses.
  7. Dissolver 2 mg de CHIR99021 em 143,4 μL de DMSO estéril para preparar uma solução de estoque de 30 mM. Prepare 5 alíquotas de μL e armazene a -20 °C por até 1 mês (ou de acordo com a recomendação do fabricante).
  8. Dissolva 10 mg de ácido retinóicotrans em DMSO estéril de 3,33 mL. Prepare 500 alíquotas de μL e armazene a -20 °C por até 6 meses.

2. Preparação de meios de comunicação culturais

  1. Prepare o meio de diferenciação de mesoderm reconstituindo soluções de estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 e 1x suplemento sem soro B27 em um volume apropriado de DMEM/12 com suplemento de glutamina.
    NOTA: O meio de diferenciação de mesoderm deve ser recém-preparado antes das etapas de diferenciação e em um volume apropriado para a escala do experimento (normalmente, 50 mL de meio é adequado para duas placas de 12 poços).
  2. Prepare o meio de diferenciação de mesoderme intermediário, reconstituindo soluções de estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 e 1x suplemento sem soro B27 no DMEM/F12 com suplemento de glutamina.
    NOTA: Se necessário, o meio pode ser suplementado com penicilina-estreptomicina de 1% (vol/vol). Ajuste o volume do meio usando DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Este meio pode ser preparado em grandes lotes; no entanto, recomenda-se armazenar em alíquotas menores (por exemplo, 45 mL em tubos cônicos de 50 mL) para evitar ciclos repetidos de congelamento. Esta mídia pode ser armazenada a -20 °C por até 3 meses e pode ser descongelada a 4 °C durante a noite antes de ser usada.
  3. Prepare o meio de indução de podocito reconstituindo-se a uma concentração final de 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL activin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento sem soro B27 e 0,1 μM de ácido retinóico totalmente trans em DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Proteger o meio da luz (por exemplo, embrulhando recipiente com papel alumínio).
    NOTA: Este meio pode ser preparado em lotes grandes e armazenado no escuro a -20 °C por até 3 meses. As alíquotas congeladas devem ser descongeladas durante a noite a 4 °C antes de serem usada.
  4. Prepare 25 mL de solução neutralizante de trippsina adicionando FBS inativados de calor de 10% (vol/vol) em DMEM/F12 e filtro em condições estéreis.
  5. Para manutenção pós-diferenciação dos podocitos derivados de células-tronco, prepare o Meio Completo com mídia de manutenção de podocyte adicionando o suplemento ao meio basal de acordo com as diretrizes do fabricante e armazene a 4 °C por até duas semanas.

3. Cultura celular hiPS livre de alimentadores usando meio de cultura de células hiPS

  1. Aspire a solução residual da matriz BM 1 das placas pré-revestidas e lave os poços 3 vezes com 1 a 2 mL de DMEM/F12 aquecidos.
  2. Aspirado passou hiPS CCM das células hiPS e enxaguar as células 3 vezes com DMEM/F12 aquecido. Adicione 1 mL de solução de descolamento de células quentes e incubar por 1 min a 37 °C para ajudar a dissociar as células. Realizar a inspeção visual das células sob um microscópio de cultura tecidual e garantir que as bordas das colônias celulares apareçam arredondadas, em seguida, aspire rapidamente a solução de descolamento celular das células (garantindo que as colônias celulares ainda estejam presas à placa, embora vagamente). Enxágue suavemente as células uma vez com DMEM/F12 para remover a solução de descolamento celular.
  3. Adicione 3 mL de hiPS CCM às células hiPS (em cada poço de uma placa de 6 poços) que foram tratadas com a solução de desapego celular. Raspe colônias usando um levantador de células, e suavemente suspensão de células pipetas para cima e para baixo para desalojar as células frouxamente aderidas. Lave bem a placa para garantir que todas as células sejam colhidas.
    NOTA: Recomenda-se o uso de uma pipeta de 5 mL para evitar o excesso de tesoura nas células.
  4. Transfira 0,5 mL da suspensão da célula para cada poço de uma nova placa de 6 poços revestidos de matriz BM com 1 poço contendo 2 mL de ccm hips por poço. Mova a placa na forma de figura oito para distribuir colônias de células dentro de poços e incubar a 37 °C em uma incubadora de 5 % de CO2. Atualize o meio diariamente até que as células estejam prontas para serem passagem ou usadas para o experimento de diferenciação (aproximadamente 70 % de confluência).
    NOTA: O tamanho ideal da colônia para a passagem de rotina de iPSCs é entre 200-500 μm em condições livres de alimentador usando hiPS CCM (sem inibidor de ROCHA). Se as células forem individualizadas durante o tratamento com enzimas ou tampões de dissociação, o hiPS CCM pode ser suplementado com inibidor de ROCHA (por exemplo, 10 μM Y27632) para melhorar a viabilidade celular.

4. Diferenciação de células hiPS em células de mesoderme (dias 0-2)

  1. Enquanto as culturas celulares hiPS estão em fase de crescimento exponencial (aproximadamente dentro de 4 dias de cultura após a passagem, e cerca de 70% de confluência), inspecionam visualmente a presença de células espontaneamente diferenciadas dentro e ao redor das bordas das colônias. Se necessário, assepticamente raspar áreas de diferenciação.
  2. Aspirar hiPS CCM a partir de células hiPS e enxaguar as células 3 vezes com DMEM/F12 quente. Incubar as células com 1 mL de tampão de dissociação celular livre de enzimas por 10 min a 37 °C e verificar a dissociação sob um microscópio. Devido a diferenças inerentes entre diferentes linhas de células hiPS, o tempo real de incubação para o buffer de dissociação celular deve ser determinado para uma determinada linha celular.
  3. Raspe suavemente o poço com um levantador de células para desalojar células frouxamente aderidas e transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, seguido de tubulação para cima e para baixo várias vezes para individualizar as células hiPS.
    1. Leve a suspensão celular para o volume de 15 mL com DMEM/F12 quente e centrífuga por 5 min a 290 x g em temperatura ambiente.
    2. Aspire suavemente o supernasciente e resuspenque as células com DMEM/F12 quente para mais uma rodada de centrifugação para remover os componentes residuais da matriz BM 1 e tampão de dissociação.
  4. Aspire as células supernascidas e resuspendas em 1 mL de meio de indução de mesoderme, conforme descrito acima. Conte o número total de células usando um hemocítômetro ou contador de coulter para determinar o volume apropriado do meio de diferenciação de mesoderme necessário para alcançar uma concentração de 1 x 105 células/mL.
  5. Aspirar a solução ECM a partir da matriz BM placas revestidas de 2 e enxaguar as placas duas vezes com DMEM/F12 quente. Misture a suspensão da célula hiPS suavemente por pipetar algumas vezes. Transfira 1 mL da suspensão celular para cada poço da matriz BM de 2 placas revestidas de 2 poços e, em seguida, agite suavemente as placas para distribuir as células de forma mais uniforme.
  6. Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%. Refrescar o meio de indução de mesoderm no dia seguinte.
    NOTA: Após 2 dias, as células de mesoderme derivadas de células hiPS estariam prontas para indução intermediária de mesoderme.

5. Diferenciação das células de mesoderme derivadas de células hiPS em mesoderme intermediário (dias 2-16)

  1. No dia 2 do protocolo de diferenciação, aspirar meio de indução de mesoderm e reabastecer com 1 mL por meio de indução de mesoderm bem intermediário.
  2. Atualizar o meio todos os dias para manter um limiar preciso de fatores de crescimento e pequenas moléculas para as células metabolicamente ativas. Se houver crescimento celular substancial e rápido esgotamento dos nutrientes da mídia (indicado pelo amarelamento da mídia), o volume do meio intermediário de diferenciação de mesoderme pode ser aumentado para 1,3 mL por poço das 12 placas do poço.
  3. Células de cultura por mais 14 dias para obter células intermediárias de mesoderme. Até o dia 16, essas células podem ser criopreservadas para uso posterior.

6. Diferenciação de células mesoderm intermediárias derivadas de células hiPS em podocitos (dias 16 a 21)

  1. Enxágüe as células intermediárias de mesoderme com DMEM/F12 quente seguido de incubação das células com 0,5 mL por poço de 0,05 % trypsin-EDTA por 3 min a 37 °C. Faça inspeção visual para garantir que as células estejam começando a se dissociar.
  2. Raspar células usando um levantador de células e pipeta a suspensão celular várias vezes usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL para obter células individualizadas (ou pequenas moitas de) células.
    NOTA: Nesta fase, certifique-se de que as células estão totalmente dissociadas, pois as células agregadas podem não adquirir um fenótipo terminalmente diferenciado dentro da linha do tempo do protocolo.
  3. Adicione cerca de 2 mL por poço de solução neutralizante de trippsina para parar a atividade de trippsina.
  4. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL e leve o volume até 50 mL usando DMEM/F12 e, em seguida, centrifugar a suspensão celular por 5 min a 201 x g à temperatura ambiente.
  5. Aspire as células supernascidas e resuspendas no meio de indução de podocito. Para obter resultados ideais, garanta uma densidade final de semeadura de aproximadamente 100.000 células/poço de uma placa de 12 poços. Adicione a suspensão da célula à matriz BM de placas revestidas de 2 e agite suavemente a placa para ajudar a distribuir as células de forma mais uniforme.
  6. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 e atualizar o meio diariamente por até 5 dias para obter podocytes até o dia 21.
    NOTA: Os podócitos derivados de células hiPS resultantes podem ser mantidos na cultura por 2-4 semanas adicionais usando meio completo com mídia de manutenção de podocyte. Uma vez em mídia de manutenção podocyte, as células podem ser alimentadas a cada dois dias e podem ser usadas para estudos subsequentes ou análises a jusante.

Resultados

O objetivo deste protocolo foi demonstrar que podocitos humanos maduros podem ser derivados de células hiPS em condições quimicamente definidas. Os dados apresentados neste manuscrito foram gerados por meio da linha de células DU11 hiPS17, que foram testadas pela primeira vez, e constataram estar livres de mycoplasma. A análise cromossômica também foi realizada, e as células foram encontradas karyotipicamente normais. Começando com as células hiPS DU11 indiferenciadas, a estratégia de d...

Discussão

Neste relatório, descrevemos um protocolo para a geração de podocitos glomerulares renais a partir de células hiPS. Os podocitos derivados de células hiPS apresentam características morfológicas e moleculares associadas ao fenótipo de podocito renal maduro13. Em publicações anteriores, mostramos que os podocitos derivados de células hiPS podem imitar a estrutura e a função de filtragem seletiva do glomerulus renal quando co-cultivado com células endoteliais microvasculares glomerular...

Divulgações

S.M. é um autor de uma patente pendente para métodos para a geração de podocitos renais a partir de células-tronco pluripotentes (pedido de patente dos EUA 14/950859). Os demais autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Escola Pratt de Engenharia da Duke University, a Divisão de Nefrologia da Duke Medical School, um Prêmio de Pesquisa de Uma Cadeira do Departamento de Medicina da Duke University, e um Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award to S.M.. M.B foi apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência. Agradecemos ao Laboratório Bursac por nos fornecer generosamente a linha de células-tronco DU11, e o Laboratório Varghese da Universidade duke por compartilhar temporariamente suas instalações de cultura de tecidos com nosso grupo. Esta publicação é dedicada à Profª Laura L. Kiessling, Novartis Professora de Química do Instituto de Tecnologia de Massachusetts, em comemoração aos seus 60anos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
DU11 human iPS cellsThe DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)72262Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004StemgentMay show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R4Z0-500-RCell SystemsPodocyte maintenance media
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS10082147Thermo/Life Technologies
Human activin APHC9564Thermo/Life Technologies
Human BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
Human VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium05850Stem Cell TechnologieshiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor1254Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodiesA32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R&D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentN-892012Iwai North AmericaBasement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial354277BD BiosciencesBasement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
AccutaseA1110501Thermo/Life TechnologiesCell detachment solution
BSAA9418Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)D2438Sigma-AldrichDMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt13150016Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade97065-058VWREthanol is flammable and toxic
FBS431097Corning
Paraformaldehyde (PFA)28906Thermo/Life TechnologiesPFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%25300-120Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped29442-462Corning
Avanti J-15R CentrifugeB99516Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL352097Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL352098Corning
Cryoboxes3395465Thermo/Life TechnologiesFor storing frozen aliquots
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life TechnologiesFlourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator51030403Thermo/Life TechnologiesFor the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)Carl Zeiss MicroscopyUsed to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves40101-346VWR
Kimwipes, large21905-049VWR
Kimwipes, small21905-026VWR
P10 precision barrier pipette tipsP1096-FRDenville Scientific
P100 barrier pipette tipsP1125Denville Scientific
P1000 barrier pipette tipsP1126Denville Scientific
P20 barrier pipette tipsP1121Denville Scientific
P200 barrier pipette tipsP1122Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped356551Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped356525Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped356543Corning
Steriflip, 0.22 μm, PESSCGP00525EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes1138W14Thomas ScientificFor aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates353043Corning
Tissue culture–treated six-well plates353046Corning
VWR white techuni lab coat10141-342VWR
Wide-beveled cell lifter3008Corning

Referências

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

BioengenhariaEdi o 161c lulas iPS humanasdiferencia o de c lulas troncopodocitos derivados de c lulas troncoprocessos de p podocitomodelagem de doen as renaisc lulas renais humanas funcionaisnefrotoxicidadec lulas troncomatriz extracelular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados