このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。
Method Article
化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化
要約
ここで提示されるのは、高効率(>90%)を有する誘導多能性幹細胞からのヒト腎臓ポドサイトの誘導のための化学的に定義されたプロトコルであり、遺伝子操作または亜集団選択とは無関係である。このプロトコルは、26日以内に望ましい細胞タイプを生成し、腎毒性試験および疾患モデリングに有用であり得る。
要約
腎臓病は世界人口の10%以上に影響を及ぼし、連邦支出に数十億ドルの費用がかかります。腎臓病の最も重篤な形態および最終的な末期腎不全は、しばしば、内皮細胞および糸球体地下膜と一緒に機能する高度に特殊化された上皮細胞である糸球体ポドサイトの損傷によって引き起こされ、腎臓の濾過障壁を形成する。腎医学の進歩は、一次組織の利用が限られており、ポドサイトなどの機能性ヒト腎臓細胞の誘導のための堅牢な方法の欠如によって妨げられてきた。幹細胞などの再生可能な供給源からポドサイトを導き出す能力は、ヒト腎臓の発達と病気のメカニズムに関する現在の理解を進めるだけでなく、治療的発見のための新しいツールを提供するのに役立つ可能性があります。このプロトコルの目的は、高効率かつ特異性のヒト誘導多能性幹細胞(hiPS)細胞から、化学的に定義された条件下で成熟した、後の有糸球体を導き出す方法を開発することであった。この方法で生成されたhiPS細胞由来ポドサイトは、系統特異的マーカー(ネフリン、ポドシン、ウィルム腫瘍1を含む)を発現し、成熟した機能的ポドサイトに関連する特殊な形態学的特徴(一次および二次足プロセスを含む)を示す。興味深いことに、これらの特殊な特徴は、この分野で広く使用されている不死化ポドサイト細胞株には特に存在せず、本明細書に記載されているプロトコルは、ヒト腎臓生物学を研究するために典型的に使用される既存のポドサイト細胞株よりも発達的により成熟した表現型を有するヒト腎臓ポドサイトを産生することを示唆している。
概要
ヒト多能性幹細胞培養の進歩は、再生医療、疾患モデリング、および薬物スクリーニングに革命をもたらす準備ができているので、研究者は、人体内のほぼすべての細胞型を得るように設計することができる再生可能でスケーラブルな生物学的材料の供給源を提供する1。この方法は、他の方法では入手が困難な特殊な機能型のセル型を派生する場合に特に役立ちます。ヒト人工多能性幹細胞(hiPS)細胞2、3、4、5は、体細胞起源と個別化医療の可能性から特に魅力的です。しかし、hiPS細胞から他の細胞系統を導き出す方法の開発は、不十分に定義された培養条件を頻繁に使用し、不十分な培養条件を使用し、6,7の異種細胞集団の低効率および非特異的生成を招くため、依然として困難である。
ここで提示される、化学的に定義された条件下で特異性および高効率のhiPS細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの導出のための方法である。細胞微小環境内での複数因子の役割を考慮することにより、細胞培養培地に示される可溶性因子の最適化や、細胞外マトリックス成分や接着基材などの不溶性因子の最適化を含む幹細胞分化戦略が開発されました。ポドサイトの発達と機能におけるインテグリンシグナル伝達の重要性を考えると、細胞表面上のインテグリン受容体の発現を最初に検討した。β1インテグリンはhiPS細胞のみならず、中皮細胞及び中間中皮細胞8、9、10を含む誘導体においても高発現した。その後の実験では、β1インテグリン(ラミニン511またはラミニン511-E8フラグメントを含む)に結合するリガンドが、以下に記載の可溶性誘導体と組み合わせて使用した場合に、hiPS細胞のポドサイトへの接着および分化を支持することが確認された。
細胞系統の誘導は、アクチビンA、CHIR99021、およびY27632ロック阻害剤を含む培地の存在下で2日間ラミニンコーティングされた表面上で培養されたhiPS細胞が、初期のメソダームマーカーHAND1、グースコイド、および小頭体8,11を発現する細胞に分化できることを最初に確認することによって開始された。骨形態形成タンパク質7(BMP-7)およびCHIR99021を添加した培地を用いた14日間の中皮細胞の治療は、ニーフロン前駆細胞マーカーウィルム腫瘍1(WT1)を発現する中間中足細胞の誘導を可能にし、奇数スキップ関連タンパク質1(OSR1)8、11、およびペア化したタンパク質22(PAX)を用いた。成熟した腎臓糸球体の細胞を導出するために、中間中期細胞をBMP-7、アクチビンA、血管内皮増殖因子(VEGF)、全トランスレチノイン酸、およびCHIR99021からなる新規培地で4〜5日間処理した。フローサイトメトリーおよび免疫染色は、得られた細胞の90%> が成熟した腎臓ポドサイト8、11、13の分子、形態学的、および機能的特徴を示すことを確認するために使用した。これらの特性には、一次および二次的な足のプロセスの開発が含まれます。SYNPO、PODXL、MAF、EFNB28を含むポドサイト系統特異的遺伝子の発現と、ポドシン、ネフリン、およびWT114、15、16を含むタンパク質の発現。さらに、hiPS細胞由来ポドサイトは、下流実験のタイミングにさらなる柔軟性を提供する市販の培地8、11を用いることによって、最大4週間の培養液中で維持できることが分かった。hiPS-podocytesの純度を決定するために使用されるフローサイトメトリーパネルの詳細については、当社の前の出版物11を参照してください。
プロトコル
1. 試薬の調製
- HiPS細胞培養基底培地で解凍した5x hiPS細胞培養培地(CCM)サプリメントを希釈し、hiPS CCMの1x溶液を得た。
注:冷凍5x hiPS CCMサプリメントは、理想的には一晩4°Cで、ゆっくりと解凍プロセスを必要とします。1x hiPS CCMのアリコートは-20°Cで6ヶ月まで保存することができます。 - hiPS細胞培養用基膜(BM)マトリックス1コーティングプレートの調製:4°Cで氷上でBMマトリックス1を一晩解凍する。解凍したら、メーカーが提案した適切な希釈因子を持つアリコートを準備します。
注:通常、アリコートは、50 mL円錐管内の冷たいDMEM/F12の25 mLで、BMマトリックス1を完全に溶解し、残留結晶の形成を避けるために完全に混合して、その後の希釈のために準備されます。 - BMマトリックス1溶液の1mLを6ウェルプレートのウェルに移し、37°Cで1〜2時間、または4°Cで最低24時間インキュベートし、パラフィンフィルムで包みます。BMマトリックス1-被覆されたプレートは、4°Cで最大2週間保存することができます。
- 基質膜(BM)マトリックス2の調製-コーティングされた版:9 mLの無菌蒸留水のBMマトリックス2の適切な量を希釈して5μg/mLの最終濃度を作製する。BMマトリックス2溶液700μLを12ウェルプレートのウェルに加え、室温でプレートを2時間または4°Cで一晩インキュベートします。
- BMP7、アクティビンA、VEGFの各100 μg/mLストック溶液を次のように準備します:0.1%(wt/vol)BSAを含む無菌蒸留水でBMP7を再構成し、アクチビンAとVEGFを0.1%(wt/vol)BSAを含む無菌PBSで別々に再構成します。頻繁な凍結融解サイクルを避けるために、各ストック溶液から100 μLのアリコートを準備し、-20°Cで最大6ヶ月間保管します。
- 3.079 mLの無菌蒸留水に10mgのY27632を溶解して、Y27632の10mMストック溶液を調製します。アリコート100 μLは、在庫から-20°Cで6ヶ月間保管します。
- 滅菌DMSOの143.4 μLにCHIR99021の2mgを溶解し、30mMストック溶液を調製します。5 μLのアリコートを準備し、-20°Cで最大1ヶ月間保管してください(またはメーカーの推奨に従ってください)。
- 3.33 mL滅菌DMSOでオールトランス レチノイン酸の10mgを溶解する。500 μL アリコートを準備し、-20 °Cで6ヶ月間保管します。
2. 文化メディアの作成
- グルタミンサプリメントを含むDMEM/12の適切な容積で、対応するストック溶液を最終濃度100 ng/mL ActR99021、10 μM Y27632、および1x B27無血清サプリメントに再構成して中皮分化培地を調製します。
注:中皮分化培地は、分化ステップの前に、実験の規模に適したボリュームで新たに調製する必要があります(通常、50 mLの培地は2つの12ウェルプレートに適しています)。 - グルタミンサプリメントを用いて、DMEM/F12の最終濃度100 ng/mL BMP7、3 μM CHIR99021、および1x B27のB27血清フリーサプリメントに対応するストック溶液を再構成することにより、中間中皮分化培地を調製します。
注:必要に応じて、培地は1%(vol/vol)ペニシリンストレプトマイシンで補うことができます。グルタミンサプリメントで DMEM/F12 を使用して、媒体の量を調整します。.この媒体は大きいバッチで準備することができる。しかし、凍結融解サイクルを繰り返さないように、小さなアリコート(例えば、50 mL円錐管で45 mL)に保存することをお勧めします。この培地は-20°Cで3ヶ月間保存でき、使用前に一晩4°Cで解凍することができます。 - 最終濃度100 ng/mL BMP7、100 ng/mLアクチビンA、50 ng/mL VEGF、3 μM CHIR99021、1x B27血清無血清サプリメント、および0.1 μM全トランスレチノイン酸をDMEM/F12型食品で補間して再コンセプトして、ポドサイト誘導培地を調製します。媒体を光から守る(例えば、ホイル紙で容器を包むことで)。
注:この培地は、大きなバッチで調製し、3ヶ月まで-20°Cで暗闇の中に保存することができます。冷凍アリコートは、使用前に4°Cで一晩解凍する必要があります。 - DMEM/F12に10%(vol/vol)熱不活化FBSを加え、滅菌条件下でフィルターを加えて25 mLのトリプシン中和溶液を調製します。
- 幹細胞由来ポドサイトの分化後のメンテナンスのために、製造者のガイドラインに従って基礎培地にサプリメントを添加してポドサイト維持培地でコンプリート培地を準備し、4°Cで最大2週間保存します。
3. ハイプス細胞培養培地を用いたフィーダーフリーHiPS細胞培養
- BMマトリックス1の残留溶液をプレコートされたプレートから吸引し、1〜2mLの加温DMEM/F12でウェルを3回洗浄した。
- 吸引はhiPS細胞からhiPS CCMを使用し、温められたDMEM/F12で細胞を3回すすいでください。1 mLの温細胞剥離液を加え、37°Cで1分間インキュベートして細胞の解離を助けます。組織培養顕微鏡で細胞を目視検査し、細胞コロニーの縁部が丸みを帯びているように見えるようにし、細胞外着液を細胞から素早く吸引する(細胞コロニーがプレートに付着していることを確認する( ゆるやかに見えるが、細胞コロニーがプレートに付着していることを確認する)。DMEM/F12で細胞を1回緩やかにすすいで、細胞剥離液を除去します。
- 3 mLのhiPS CCMを、細胞剥離液で処理したhiPS細胞(6ウェルプレートの各ウェル)に加えます。セルリフターを使用してコロニーを擦り、ピペット細胞懸濁液を上下に静かにして緩やかに接着した細胞を取り除きます。プレートを十分に洗い、すべての細胞が収穫されるようにします。
注:細胞に余分なせん断を避けるために5 mLピペットの使用をお勧めします。 - 1ウェルあたり2 mLのhiPS CCMを含む新しいBMマトリックス1コーティング6ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液の0.5 mLを移します。ウェル内の細胞コロニーを分配し、5%CO2インキュベーターで37 °Cでインキュベートするために、図8の方法でプレートを移動します。細胞が分化実験に通過または使用される準備ができるまで、毎日培地をリフレッシュします(約70%の合流率)。
注:iPSCのルーチンパスエージングのための理想的なコロニーサイズはhiPS CCM(ROCK阻害剤なし)を使用してフィーダーフリー条件下で200-500 μmの間です。解離酵素またはバッファーを使用した処理中に細胞を個別化した場合、hiPS CCMをROCK阻害剤(例えば、10 μM Y27632)で補い、細胞の生存率を向上させることができます。
4. 中皮細胞へのhiPS細胞の分化(0-2日目)
- HiPS細胞培養は指数成長段階にあるが(通過後約4日以内、約70%の合流率)、コロニーの縁の内側および周囲に自発的に分化した細胞の存在を視覚的に検査する。必要に応じて、分化の無菌的に擦り落ち領域。
- hiPS細胞からHIPS CCMを吸引し、温かいDMEM/F12で細胞を3回すすます。37°Cで10分間酵素フリー細胞解離バッファーを1 mLで培養し、顕微鏡下で解離を確認します。異なるhiPS細胞株間の固有の違いのために、細胞解離バッファーの実際のインキュベーション時間は、所定の細胞株について決定されなければならない。
- セルリフターでウェルを静かにこすり取り、ゆるやかに接着した細胞を取り除き、細胞懸濁液を15 mL円錐形チューブに移し、続いて数回上下にピペットを作ってHiPS細胞を個体化します。
- セル懸濁液を、温かいDMEM/F12で15mLの体積に、遠心分離機を室温で290 x g で5分間持ちます。
- 優しく上清を吸引し、残存BMマトリックス1および解離緩衝成分を除去するために遠心分離の別のラウンドのために暖かいDMEM / F12で細胞を再懸濁します。
- 上清を吸引し、上述のように中皮誘導培地の1mLで細胞を再懸濁する。1 x 105 細胞/mLの濃度を達成するために必要な中皮分化培地の適切な体積を決定するために、ヘモサイトメーターまたはコールターカウンターを使用して細胞の総数を数えます。
- BMマトリックス2コーティングプレートからのECM溶液を吸引し、温かいDMEM/F12でプレートを2回リンスします。数回ピペットを使用して、hiPS細胞の懸濁液を軽く混ぜます。セル懸濁液1mLをBMマトリックス2コーティング12ウェルプレートのウェルそれぞれに移し、プレートを穏やかに振って細胞をより均等に分配します。
- プレートを37°Cで5%CO2インキュベーターでインキュベートします。翌日中皮誘導培地をリフレッシュします。
注:2日後、hiPS細胞由来の中皮細胞は中間中皮誘導の準備が整いました。
5. 中間中半分へのhiPS細胞由来中皮細胞の分化(2-16日目)
- 分化プロトコルの2日目には、中皮誘導媒体を吸引し、1 mL当たり1mLの中間中期中期誘導媒体で補充する。
- 代謝活性細胞の成長因子と小分子の正確な閾値を維持するために、毎日培地をリフレッシュします。実質的な細胞増殖およびメディア栄養素の急速な枯渇(メディアの黄変によって示される)がある場合、中間中皮分化培地の体積は、12ウェルプレートのウェル当たり1.3mLに増加させることができる。
- 培養細胞は、中間中皮細胞を得るためにさらに14日間を行った。16日目までに、これらの細胞は後で使用するために凍結保存することができる。
6. hiPS細胞由来中間中中軟体細胞のポドサイトへの分化(16日~21日目)
- 中間中皮細胞を温かいDMEM/F12でリンスし、37°Cで3分間0.05%トリプシン-EDTAのウェル当たり0.5 mLで細胞をインキュベートします。細胞の解教が始まっていることを確認するために目視検査を行います。
- 細胞リフターを使用して細胞をスクレープし、1,000 μLピペットチップを使用して細胞懸濁液を数回使用して、個別化された(または小さな塊の)細胞を得る。
注: この段階では、集約されたセルがプロトコルのタイムライン内で末端に分化された表現型を取得できない可能性があるため、セルが完全に解約されていることを確認してください。 - トリプシン中和溶液のウェルあたり約2 mLを加えてトリプシンの活性を停止する。
- 細胞を50 mL円錐形チューブに移し、DMEM/F12を使用して体積を最大50 mLにし、室温で201 x g で5分間細胞懸濁液を遠心分離します。
- 上清を吸引し、ポドサイト誘導培地中の細胞を再懸濁する。最適な結果を得るには、12ウェルプレートの約100,000個の細胞/ウェルの最終播種密度を確保してください。セル懸濁液をBMマトリックス2コーティングプレートに加え、プレートを穏やかに振って細胞をより均等に分配します。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、培地を毎日5日間までリフレッシュし、21日目までにポドサイトを得た。
注:得られたhiPS細胞由来ポドサイトは、ポドサイト維持培地を含む完全な培地を使用することにより、培養で2〜4週間維持することができます。一度ポドサイト維持培地に入ると、細胞は1日おきに供給することができ、その後の研究や下流の分析に使用することができます。
結果
このプロトコルの目的は、成熟したヒトポドサイトが化学的に定義された条件下でhiPS細胞から誘導できることを実証することであった。この原稿に記載されたデータは、DU11 hiPS細胞株17を用いて生成され、最初に試験され、マイコプラズマが含まれなかったことが判明した。染色体分析も行われ、細胞はカルヨタイプ正常であることが判明した。未分化DU11 hiPS細胞から、こ?...
ディスカッション
本報告では、hiPS細胞からの腎臓糸球体ポドサイトの生成プロトコルについて述べている。hiPS細胞由来ポドサイトは、成熟した腎臓ポドサイト表現型13に関連する形態学的および分子的特徴を示す。これまでの刊行物では、hiPS細胞由来ポドサイトが、透過性マイクロ流体臓器オンチップ装置8,11で糸球体微小血管内皮細胞と共培養?...
開示事項
S.Mは、多能性幹細胞からの腎臓ポドサイトの生成方法の特許出願中の著者です(米国特許出願14/950859)。残りの著者は、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。
謝辞
この研究は、デューク大学のプラット工学部、デューク医科大学腎臓学科、デューク大学医学部の椅子研究賞、バロウズウェルカム基金PDEPキャリア移行 アドホック 賞によって支援されました.M。M.Bは、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムの支援を受けています。DU11幹細胞ラインを寛大に提供してくれたBursac Labと、デューク大学のヴァルゲーゼラボが組織培養施設を一時的に共有してくれたことに感謝します。この出版物は、60歳の誕生日 を祝って、マサチューセッツ工科大学のノバルティス化学教授ローラ・L・キースリング教授に捧げられています。
資料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
参考文献
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
転載および許可
このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します
許可を申請さらに記事を探す
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved