JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (>90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.

Resumen

La enfermedad renal afecta a más del 10% de la población mundial y cuesta miles de millones de dólares en gastos federales. Las formas más graves de enfermedad renal y eventual insuficiencia renal en etapa terminal a menudo son causadas por el daño a los podocitos glomerulares, que son las células epiteliales altamente especializadas que funcionan junto con las células endoteliales y la membrana basal glomerular para formar la barrera de filtración del riñón. Los avances en medicina renal se han visto obstaculizados por la limitada disponibilidad de tejidos primarios y la falta de métodos robustos para la derivación de células renales humanas funcionales, como los podocitos. La capacidad de derivar podocitos de fuentes renovables, como las células madre, podría ayudar a avanzar en la comprensión actual de los mecanismos del desarrollo y la enfermedad renal humana, así como proporcionar nuevas herramientas para el descubrimiento terapéutico. El objetivo de este protocolo era desarrollar un método para derivar podocitos maduros postmitóticos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS) con alta eficiencia y especificidad, y en condiciones químicamente definidas. Los podocitos derivados de células hiPS producidos por este método expresan marcadores específicos del linaje (incluyendo nefrina, podocina y tumor de Wilm 1) y exhiben las características morfológicas especializadas (incluidos los procesos primarios y secundarios del pie) asociadas con podocitos maduros y funcionales. Curiosamente, estas características especializadas están notablemente ausentes en la línea celular de podocitos inmortalizados ampliamente utilizada en el campo, lo que sugiere que el protocolo descrito aquí produce podocitos renales humanos que tienen un fenotipo de desarrollo más maduro que las líneas celulares de podocitos existentes típicamente utilizadas para estudiar la biología del riñón humano.

Introducción

Los avances en el cultivo de células madre pluripotentes humanas están a punto de revolucionar la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos al proporcionar a los investigadores una fuente renovable y escalable de material biológico que puede diseñarse para obtener casi cualquier tipo de célula dentro del cuerpo humano1. Esta estrategia es especialmente útil para derivar tipos de células especializadas y funcionales que de otro modo serían difíciles de obtener. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS)2,3,4,5 son particularmente atractivas debido a su origen celular somático y al potencial que representan para la medicina personalizada. Sin embargo, el desarrollo de métodos para derivar otros linajes celulares a partir de células hiPS sigue siendo un desafío debido al uso frecuente de condiciones de cultivo mal definidas que conducen a una baja eficiencia y a la generación inespecífico de poblaciones de células heterogéneas6,7.

Aquí se presenta un método para la derivación de podocitos renales maduros a partir de células hiPS con especificidad y alta eficiencia en condiciones químicamente definidas. Al considerar los roles de múltiples factores dentro del microambiente celular, se desarrolló una estrategia de diferenciación de células madre que implicó la optimización de factores solubles presentados en el medio de cultivo celular, así como factores insolubles, como componentes de matriz extracelular o sustratos adhesivos. Dada la importancia de la señalización de la integrina en el desarrollo y la función de los podocitos, se examinó inicialmente la expresión de los receptores de integrina en la superficie celular. Las integrinas β1 se expresaron altamente no solo en las células hiPS, sino también en sus derivados, incluidas las células mesodermo y mesodermointermedias 8,9,10. Experimentos posteriores confirmaron que los ligandos que se unen a las integrinas β1 (incluyendo laminina 511 o el fragmento de laminina 511-E8) apoyan la adhesión y diferenciación de las células hiPS en podocitos cuando se usan junto con los medios inductivos solubles que se describen a continuación.

La inducción del compromiso de linaje celular se inició confirmando primero que las células hiPS cultivadas en las superficies recubiertas de laminina durante dos días en presencia de un medio que contiene Activina A, CHIR99021 e Y27632 El inhibidor de roca puede diferenciarse en células que expresan los marcadores tempranos del mesodermo HAND1, goosecoid y brachyury8,11. El tratamiento de las células mesodérmicas durante 14 días con un medio suplementado con proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) y CHIR99021 permitió la derivación de células mesodérmicas intermedias que expresaban los marcadores de células progenitoras de nefrona Tumor de Wilm 1 (WT1), proteína relacionada extrañamente omitida 1 (OSR1)8,11y proteína pareada del gen 2 de la caja (PAX2)12. Para derivar los podocitos glomerulares renales maduros, las células mesodérmicas intermedias se trataron durante 4-5 días con un nuevo medio que consiste en BMP-7, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ácido retinoicoall-trans y CHIR99021. Se utilizó la citometría de flujo y la inmunotinción para confirmar que >90% de las células resultantes exhibían las características moleculares, morfológicas y funcionales del podocito renal maduro8,11,13. Estas características incluyen el desarrollo de procesos primarios y secundarios del pie; la expresión de genes específicos del linaje de podocitos, incluidos SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 y la expresión de proteínas como podocina, nefrina y WT114,15,16. Además, se encontró que los podocitos derivados de células hiPS se pueden mantener en cultivo durante un máximo de cuatro semanas in vitromedianteel uso de un medio disponible comercialmente 8,11 que proporciona una flexibilidad adicional en el momento de los experimentos posteriores. Para obtener más información sobre los paneles de citometría de flujo utilizados para determinar la pureza de los hiPS-podocitos, consulte nuestra publicación anterior11.

Protocolo

1. Preparación de reactivos

  1. Suplemento diluido de medios de cultivo celular hiPS (CCM) descongelado en medio basal de cultivo celular hiPS para obtener una solución 1x de hiPS CCM.
    NOTA: El suplemento congelado 5x hiPS CCM requiere un proceso de descongelación lento, idealmente en 4 ° C durante la noche. Las alícuotas del 1x hiPS CCM se pueden almacenar hasta 6 meses a -20 °C.
  2. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal (BM) 1 para cultivo celular hiPS: Descongelar la matriz BM 1 durante la noche sobre hielo a 4 °C. Una vez descongeladas, prepare las alícuotas con los factores de dilución apropiados según lo sugerido por el fabricante.
    NOTA: Por lo general, las alícuotas se preparan para su posterior dilución en 25 ml de DMEM / F12 frío en un tubo cónico de 50 ml seguido de una mezcla completa para disolver completamente la matriz BM 1 y evitar la formación de cristales residuales.
  3. Transfiera 1 ml de la solución de matriz BM 1 a cada pozo de una placa de 6 pozos e incube a 37 °C durante 1-2 h o a 4 °C durante un mínimo de 24 h, envuelto en película de parafina. Las placas recubiertas de matriz BM 1 se pueden almacenar a 4 °C durante un tiempo de hasta 2 semanas.
  4. Preparación de la matriz 2 de la membrana basal (BM) - placas recubiertas: Diluya las cantidades apropiadas de la matriz BM 2 en agua destilada estéril de 9 ml para preparar una concentración final de 5 μg / ml. Añadir 700 μL de la solución de matriz BM 2 a cada pozo de una placa de 12 pozos e incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h o durante la noche a 4 °C.
  5. Preparar soluciones de 100 μg/ml de BSA cada una de BMP7, Activina A y VEGF de la siguiente manera: reconstituir BMP7 en agua destilada estéril que contenga 0,1% (wt/vol) de BSA y reconstituir Activina A y VEGF por separado en PBS estériles que contengan 0,1% (wt/vol) de BSA. Para evitar ciclos frecuentes de congelación-descongelación, prepare alícuotas de 100 μL de cada solución de stock y guárdelo a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.
  6. Preparar una solución de 10 mM de Y27632 disolviendo 10 mg de Y27632 en 3.079 mL de agua destilada estéril. Alícuota 100 μL del stock y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.
  7. Disolver 2 mg de CHIR99021 en 143,4 μL de DMSO estéril para preparar una solución de 30 mM. Preparar alícuotas de 5 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 1 mes (o según la recomendación del fabricante).
  8. Disolver 10 mg de ácidotodo-trans retinoico en 3,33 ml de DMSO estéril. Preparar alícuotas de 500 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.

2. Preparación de medios culturales

  1. Preparar el medio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL de Activina A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 y 1x suplemento libre de suero B27 en un volumen apropiado de DMEM/12 con suplemento de glutamina.
    NOTA: El medio de diferenciación del mesodermo debe estar recién preparado antes de los pasos de diferenciación y a un volumen apropiado para la escala del experimento (típicamente, 50 ml de medio es adecuado para dos placas de 12 pozos).
  2. Preparar el medio intermedio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 y 1x suplemento libre de suero B27 en DMEM/F12 con un suplemento de glutamina.
    NOTA: Si es necesario, el medio se puede complementar con 1% (vol/vol) de penicilina-estreptomicina. Ajuste el volumen del medio usando DMEM / F12 con suplemento de glutamina. Este medio se puede preparar en grandes lotes; sin embargo, se recomienda almacenar en alícuotas más pequeñas (por ejemplo, 45 ml en tubos cónicos de 50 ml) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Este medio se puede almacenar a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses y se puede descongelar a 4 °C durante la noche antes de su uso.
  3. Preparar el medio de inducción de poocitos reconstituyendo a una concentración final 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL de activina A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento libre de suero B27 y 0,1 μM de ácido todo-trans retinoico en DMEM/F12 con suplemento de glutamina. Proteja el medio de la luz (por ejemplo, envolviendo el recipiente con papel de aluminio).
    NOTA: Este medio se puede preparar en grandes lotes y almacenar en la oscuridad a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses. Las alícuotas congeladas deben descongelarse durante la noche a 4 °C antes de su uso.
  4. Preparar 25 ml de solución neutralizante de tripsina añadiendo fbs inactivado por calor al 10% (vol/vol) en DMEM/F12 y filtrar en condiciones estériles.
  5. Para el mantenimiento posterior a la diferenciación de los podocitos derivados de células madre, prepare complete Medium con medios de mantenimiento de podocitos agregando el suplemento al medio basal según las pautas del fabricante y guárdelo a 4 ° C durante un total de dos semanas.

3. Cultivo celular hiPS sin alimentador utilizando medio de cultivo celular hiPS

  1. Aspire la solución residual de la matriz BM 1 de las placas pre-recubiertas y lave los pozos 3 veces con 1 a 2 ml de DMEM/F12 calentado.
  2. Aspire el CCM hiPS gastado de las células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 calentado. Agregue 1 ml de solución de desprendimiento de células calientes e incube durante 1 min a 37 ° C para ayudar a disociar las células. Realice una inspección visual de las células bajo un microscopio de cultivo de tejidos y asegúrese de que los bordes de las colonias celulares parezcan redondeados, luego aspire rápidamente la solución de desprendimiento celular de las células (asegurando que las colonias celulares todavía estén unidas a la placa, aunque sea libremente). Enjuague suavemente las células una vez con DMEM/F12 para eliminar la solución de desprendimiento celular.
  3. Agregue 3 ml de hiPS CCM a las células hiPS (en cada podo de una placa de 6 pomos) que se trataron con la solución de desprendimiento celular. Raspe las colonias usando un elevador de células y pipete suavemente la suspensión de celdas hacia arriba y hacia abajo para desalojar las celdas adheridas. Lave bien el plato para asegurarse de que todas las células se cosechan.
    NOTA: Se recomienda el uso de una pipeta de 5 ml para evitar el exceso de cizalla en las células.
  4. Transfiera 0,5 ml de la suspensión celular a cada pozo de una nueva placa de 6 pomos recubierta de matriz BM de 1 que contiene 2 ml de HIPS CCM por pozo. Mueva la placa de la figura ocho para distribuir colonias celulares dentro de los pozos e incube a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. Refrescar el medio diariamente hasta que las células estén listas para ser pasadas o utilizadas para el experimento de diferenciación (aproximadamente 70 % de confluencia).
    NOTA: El tamaño ideal de la colonia para el paso rutinario de iPSCs es de entre 200-500 μm en condiciones libres de alimentador utilizando hiPS CCM (sin inhibidor de ROCK). Si las células se individualizan durante el tratamiento con enzimas de disociación o tampones, el HIPS CCM se puede complementar con un inhibidor de ROCK (por ejemplo, 10 μM Y27632) para mejorar la viabilidad celular.

4. Diferenciación de células hiPS en células mesodérmicas (días 0-2)

  1. Mientras que los cultivos celulares hiPS se encuentran en la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente dentro de los 4 días posteriores al cultivo después del paso, y alrededor del 70% de confluencia), inspeccione visualmente la presencia de células diferenciadas espontáneamente dentro y alrededor de los bordes de las colonias. Si es necesario, raspe asépticamente las áreas de diferenciación.
  2. Aspire hiPS CCM de células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 caliente. Incubar las células con 1 ml de tampón de disociación celular libre de enzimas durante 10 min a 37 °C y comprobar la disociación bajo un microscopio. Debido a las diferencias inherentes entre las diferentes líneas celulares hiPS, el tiempo de incubación real para el tampón de disociación celular debe determinarse para una línea celular determinada.
  3. Raspe suavemente el pozo con un elevador de células para desalojar las células adheridas y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, seguido de pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para individualizar las células hiPS.
    1. Lleve la suspensión celular al volumen de 15 ml con DMEM/F12 caliente y centrífuga durante 5 min a 290 x g a temperatura ambiente.
    2. Aspire suavemente el sobrenadante y resuspónda las células con DMEM / F12 caliente para otra ronda de centrifugación para eliminar los componentes residuales de la matriz BM 1 y el tampón de disociación.
  4. Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en 1 ml de medio de inducción del mesodermo como se describe anteriormente. Contar el número total de células utilizando un hemocitómetro o un contador de coulter para determinar el volumen apropiado del medio de diferenciación del mesodermo necesario para lograr una concentración de 1 x 105 células/ml.
  5. Aspire la solución de ECM de las placas recubiertas de 2 matrices BM y enjuague las placas dos veces con DMEM / F12 caliente. Mezcle la suspensión de la celda hiPS suavemente pipeteando varias veces. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a cada pozo de las placas de 12 pozos recubiertas de 2 matriz BM y luego agite suavemente las placas para distribuir las células de manera más uniforme.
  6. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2. Refresque el medio de inducción del mesodermo al día siguiente.
    NOTA: Después de 2 días, las células mesodérmicas derivadas de células hiPS estarían listas para la inducción intermedia del mesodermo.

5. Diferenciación de células mesodérmicas derivadas de células hiPS en mesodermo intermedio (días 2-16)

  1. En el día 2 del protocolo de diferenciación, aspirar el medio de inducción del mesodermo y reponer con 1 mL por medio de inducción del mesodermo intermedio del pozo.
  2. Refrescar el medio todos los días para mantener un umbral preciso de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para las células metabólicamente activas. Si hay un crecimiento celular sustancial y un rápido agotamiento de los nutrientes de los medios (indicado por el amarilleo de los medios), el volumen del medio de diferenciación del mesodermo intermedio se puede aumentar a 1,3 ml por podo de las placas de 12 pomos.
  3. Células de cultivo durante 14 días adicionales para obtener células mesodérmicas intermedias. Para el día 16, estas células se pueden criopreservarse para su uso posterior.

6. Diferenciación de células mesodérmicas intermedias derivadas de células hiPS en podocitos (días 16 a 21)

  1. Enjuague las células mesodérmicas intermedias con DMEM/F12 caliente seguido de incubación de las células con 0,5 ml por podo de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 3 min a 37 °C. Realice una inspección visual para asegurarse de que las células están comenzando a disociarse.
  2. Raspar las células usando un elevador celular y pipetear la suspensión celular varias veces usando una punta de pipeta de 1,000 μL para obtener células individualizadas (o pequeños grupos de).
    NOTA: En esta etapa, asegúrese de que las células estén completamente disociadas, ya que las células agregadas pueden no adquirir un fenotipo diferenciado terminalmente dentro de la línea de tiempo del protocolo.
  3. Agregue aproximadamente 2 ml por pozo de solución neutralizante de tripsina para detener la actividad de la tripsina.
  4. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 ml y lleve el volumen hasta 50 ml utilizando DMEM / F12, y luego centrífuga la suspensión de la celda durante 5 minutos a 201 x g a temperatura ambiente.
  5. Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en el medio de inducción de poocitos. Para obtener resultados óptimos, asegure una densidad de siembra final de aproximadamente 100,000 células / pozo de una placa de 12 pozos. Agregue la suspensión celular a las placas recubiertas de 2 matrices BM y agite suavemente la placa para ayudar a distribuir las células de manera más uniforme.
  6. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 y refrescar el medio diariamente durante un total de 5 días para obtener podocitos para el día 21.
    NOTA: Los podocitos derivados de células hiPS resultantes se pueden mantener en cultivo durante 2-4 semanas adicionales mediante el uso de medio completo con medios de mantenimiento de podocitos. Una vez en los medios de mantenimiento de podocitos, las células se pueden alimentar cada dos días y se pueden utilizar para estudios posteriores o análisis posteriores.

Resultados

El objetivo de este protocolo era demostrar que los podocitos humanos maduros pueden derivarse de células hiPS en condiciones químicamente definidas. Los datos presentados en este manuscrito se generaron mediante el uso de la línea celular DU11 hiPS17,que se probó por primera vez y se encontró que estaba libre de micoplasma. También se realizó un análisis cromosómico, y se encontró que las células eran cariotípicamente normales. Comenzando con las células hiPS DU11 indiferenciadas, la...

Discusión

En este informe, describimos un protocolo para la generación de podocitos glomerulares renales a partir de células hiPS. Los podocitos derivados de células hiPS exhiben características morfológicas y moleculares asociadas con el fenotipo13de podocitos renales maduros. En publicaciones anteriores, demostramos que los podocitos derivados de células hiPS pueden imitar la estructura y la función de filtración selectiva del glomérulo renal cuando se cocultivan con células endoteliales microva...

Divulgaciones

S.M. es autor de una patente pendiente para métodos para la generación de podocitos renales a partir de células madre pluripotentes (solicitud de patente estadounidense 14/950859). Los autores restantes declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Escuela de Ingeniería Pratt de la Universidad de Duke, la División de Nefrología de la Escuela de Medicina de Duke, el Premio de Investigación de una Cátedra del Departamento de Medicina de la Universidad de Duke y un Premio Ad Hoc de Transición de Carrera PDEP del Fondo Burroughs Wellcome a S.M. M.B fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Laboratorio Bursac por proporcionarnos generosamente la línea de células madre DU11, y al Laboratorio Varghese de la Universidad de Duke por compartir temporalmente sus instalaciones de cultivo de tejidos con nuestro grupo. Esta publicación está dedicada a la Prof. Laura L. Kiessling, Profesora de Química de Novartis en el Instituto de Tecnología de Massachusetts, en celebración de su 60cumpleaños.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
DU11 human iPS cellsThe DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)72262Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004StemgentMay show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R4Z0-500-RCell SystemsPodocyte maintenance media
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS10082147Thermo/Life Technologies
Human activin APHC9564Thermo/Life Technologies
Human BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
Human VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium05850Stem Cell TechnologieshiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor1254Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodiesA32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R&D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentN-892012Iwai North AmericaBasement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial354277BD BiosciencesBasement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
AccutaseA1110501Thermo/Life TechnologiesCell detachment solution
BSAA9418Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)D2438Sigma-AldrichDMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt13150016Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade97065-058VWREthanol is flammable and toxic
FBS431097Corning
Paraformaldehyde (PFA)28906Thermo/Life TechnologiesPFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%25300-120Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped29442-462Corning
Avanti J-15R CentrifugeB99516Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL352097Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL352098Corning
Cryoboxes3395465Thermo/Life TechnologiesFor storing frozen aliquots
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life TechnologiesFlourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator51030403Thermo/Life TechnologiesFor the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)Carl Zeiss MicroscopyUsed to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves40101-346VWR
Kimwipes, large21905-049VWR
Kimwipes, small21905-026VWR
P10 precision barrier pipette tipsP1096-FRDenville Scientific
P100 barrier pipette tipsP1125Denville Scientific
P1000 barrier pipette tipsP1126Denville Scientific
P20 barrier pipette tipsP1121Denville Scientific
P200 barrier pipette tipsP1122Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped356551Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped356525Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped356543Corning
Steriflip, 0.22 μm, PESSCGP00525EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes1138W14Thomas ScientificFor aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates353043Corning
Tissue culture–treated six-well plates353046Corning
VWR white techuni lab coat10141-342VWR
Wide-beveled cell lifter3008Corning

Referencias

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioingenier aN mero 161c lulas iPS humanasdiferenciaci n de c lulas madrepodocitos derivados de c lulas madreprocesos de pie de podocitosmodelado de enfermedades renalesc lulas renales humanas funcionalesnefrotoxicidadc lulas madrematriz extracelular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados