Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Résumé

Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (>90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.

Résumé

Les maladies rénales touchent plus de 10 % de la population mondiale et coûtent des milliards de dollars en dépenses fédérales. Les formes les plus graves de maladie rénale et éventuellement d’insuffisance rénale terminale sont souvent causées par les dommages aux podocytes glomérulaires, qui sont les cellules épithéliales hautement spécialisées qui fonctionnent avec les cellules endothéliales et la membrane basale glomérulaire pour former la barrière de filtration du rein. Les progrès de la médecine rénale ont été entravés par la disponibilité limitée de tissus primaires et le manque de méthodes robustes pour la dérivation de cellules rénales humaines fonctionnelles, telles que les podocytes. La capacité de dériver des podocytes à partir de sources renouvelables, telles que les cellules souches, pourrait aider à faire progresser la compréhension actuelle des mécanismes du développement et de la maladie des reins humains, ainsi que fournir de nouveaux outils pour la découverte thérapeutique. L’objectif de ce protocole était de développer une méthode pour dériver des podocytes post-mitotiques matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS) avec une efficacité et une spécificité élevées, et dans des conditions chimiquement définies. Les podocytes dérivés des cellules hiPS produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques à la lignée (y compris la néphrine, la podocine et la tumeur de Wilm 1) et présentent les caractéristiques morphologiques spécialisées (y compris les processus primaires et secondaires du pied) associés aux podocytes matures et fonctionnels. Curieusement, ces caractéristiques spécialisées sont notamment absentes dans la lignée cellulaire podocytaire immortalisée largement utilisée dans le domaine, ce qui suggère que le protocole décrit ici produit des podocytes rénaux humains qui ont un phénotype plus mature sur le plan du développement que les lignées cellulaires podocytaires existantes généralement utilisées pour étudier la biologie rénale humaine.

Introduction

Les progrès de la culture de cellules souches pluripotentes humaines sont sur le point de révolutionner la médecine régénérative, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en fournissant aux chercheurs une source renouvelable et évolutive de matériel biologique qui peut être conçue pour obtenir presque n’importe quel type de cellule dans le corps humain¹. Cette stratégie est particulièrement utile pour dériver des types de cellules spécialisées et fonctionnelles qui seraient autrement difficiles à obtenir. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS)^2,3,4,5 sont particulièrement attrayantes en raison de leur origine cellulaire somatique et du potentiel qu’elles représentent pour la médecine personnalisée. Cependant, le développement de méthodes pour dériver d’autres lignées cellulaires à partir de cellules hiPS reste difficile en raison de l’utilisation fréquente de conditions de culture mal définies, ce qui conduit à une faible efficacité et à une génération non spécifique de populations cellulaires hétérogènes^6,7.

Présenté ici est une méthode pour la dérivation de podocytes rénaux matures à partir de cellules hiPS avec spécificité et haute efficacité dans des conditions chimiquement définies. En tenant compte des rôles de multiples facteurs dans le microenvironnement cellulaire, une stratégie de différenciation des cellules souches a été développée qui impliquait l’optimisation des facteurs solubles présentés dans le milieu de culture cellulaire ainsi que des facteurs insolubles, tels que les composants de la matrice extracellulaire ou les substrats adhésifs. Compte tenu de l’importance de la signalisation de l’intégrine dans le développement et la fonction des podocytes, l’expression des récepteurs de l’intégrine à la surface de la cellule a été initialement examinée. Les intégrines β1 étaient fortement exprimées non seulement dans les cellules hiPS, mais aussi dans leurs dérivés, y compris les cellules mésodermiques et les cellules mésodermiques intermédiaires^8,9,10. Des expériences ultérieures ont confirmé que les ligands qui se lient aux intégrines β1 (y compris la laminine 511 ou le fragment de laminine 511-E8) soutiennent l’adhésion et la différenciation des cellules hiPS en podocytes lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec les milieux inductifs solubles décrits ci-dessous.

L’induction de l’engagement de la lignée cellulaire a été initiée en confirmant d’abord que les cellules hiPS cultivées sur les surfaces recouvertes de laminine pendant deux jours en présence d’un milieu contenant de l’activine A, chir99021 et Y27632 Inhibiteur de roche peuvent se différencier en cellules qui expriment les marqueurs mésodermiques précoces HAND1, goosecoid et brachyury^8,11. Le traitement des cellules du mésoderme pendant 14 jours avec un milieu complété par la protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7) et CHIR99021 a permis la dérivation de cellules mésodermiques intermédiaires qui exprimaient les marqueurs cellulaires néphron-progéniteurs de la tumeur de Wilm 1 (WT1), la protéine apparentée impaire 1 (OSR1)^8,11et la protéine 2 du gène de boîte appariée (PAX2)¹². Pour obtenir les podocytes glomérulaires rénaux matures, les cellules intermédiaires du mésoderme ont été traitées pendant 4 à 5 jours avec un nouveau milieu composé de BMP-7, d’activine A, de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), d’acide rétinoïque touttrans et de CHIR99021. La cytométrie en flux et l’immunocoloration ont été utilisées pour confirmer que >90% des cellules résultantes présentaient les caractéristiques moléculaires, morphologiques et fonctionnelles du podocyte rénal mature^8,11,13. Ces caractéristiques comprennent le développement de processus de pied primaire et secondaire; l’expression de gènes spécifiques à la lignée podocytaire, y compris SYNPO, PODXL, MAF, EFNB2⁸ et l’expression de protéines telles que la podocine, la néphrine et WT1^14,15,16. En outre, il a été constaté que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent être maintenus en culture jusqu’à quatre semaines in vitro en utilisant un milieu^8,11 disponible dans le commerce qui offre une flexibilité supplémentaire dans le calendrier des expériences en aval. Pour plus d’informations concernant les panels de cytométrie en flux utilisés pour déterminer la pureté des podocytes hiPS, veuillez vous référer à notre publication précédente¹¹.

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Diluer le supplément de milieux de culture cellulaire (CCM) 5x hiPS décongelé dans un milieu basal de culture cellulaire hiPS pour obtenir une solution 1x de CCM hiPS.
   REMARQUE: Le supplément de CCM surgelé 5x hiPS nécessite un processus de décongélation lent, idéalement à 4 ° C pour la nuit. Les aliquotes du CCM 1x hiPS peuvent être conservées jusqu’à 6 mois à -20 °C.
2. Préparation de plaques à membrane basale (BM) matricielle 1 pour la culture cellulaire hiPS : Décongeler la matrice BM 1 pendant la nuit sur de la glace à 4 °C. Une fois décongelés, préparer les aliquotes avec les facteurs de dilution appropriés, comme suggéré par le fabricant.
   REMARQUE: En règle générale, les aliquotes sont préparées pour dilution ultérieure dans 25 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL suivi d’un mélange approfondi pour dissoudre complètement la matrice BM 1 et éviter la formation de cristaux résiduels.
3. Transférer 1 mL de la solution BM matrix 1 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 1-2 h ou à 4 °C pendant au moins 24 h, enveloppé dans un film de paraffine. Les plaques revêtues de la matrice BM 1 peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
4. Préparation de la matrice à membrane basale (BM) 2 - plaques revêtues : Diluer des quantités appropriées de matrice BM 2 dans 9 mL d’eau distillée stérile pour préparer une concentration finale de 5 μg/mL. Ajouter 700 μL de la solution BM matrix 2 à chaque puits d’une plaque de 12 puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h ou pendant la nuit à 4 °C.
5. Préparer des solutions sous forme de BMP7, d’Activine A et de VEGF à 100 μg/mL comme suit : reconstituer le BMP7 dans de l’eau distillée stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA et reconstituer séparément l’activine A et le VEGF dans du PBS stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA. Pour éviter les cycles fréquents de congélation-décongélation, préparez des aliquotes de 100 μL à partir de chaque solution d’élevage et conservez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois.
6. Préparer une solution mère de 10 mM de Y27632 en dissolvant 10 mg de Y27632 dans 3,079 mL d’eau distillée stérile. Aliquote 100 μL du stock et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.
7. Dissoudre 2 mg de CHIR99021 dans 143,4 μL de DMSO stérile pour préparer une solution mère de 30 mM. Préparer des aliquotes de 5 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 1 mois (ou selon la recommandation du fabricant).
8. Dissoudre 10 mg d’acide rétinoïque touttrans dans 3,33 mL de DMSO stérile. Préparer des aliquotes de 500 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.

2. Préparation des milieux de culture

1. Préparer le milieu de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL d’Activine A, de 3 μM CHIR99021, de 10 μM Y27632 et de 1x supplément sans sérum B27 dans un volume approprié de DMEM/12 avec un supplément de glutamine.
   REMARQUE: Le milieu de différenciation du mésoderme doit être fraîchement préparé avant les étapes de différenciation et à un volume approprié à l’échelle de l’expérience (généralement, 50 mL de milieu sont suffisants pour deux plaques de 12 puits).
2. Préparer le milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 et 1x supplément sans sérum B27 dans DMEM/F12 avec un supplément de glutamine.
   REMARQUE: Si nécessaire, le milieu peut être complété par 1% (vol / vol) de pénicilline-streptomycine. Réglez le volume du milieu en utilisant DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Ce milieu peut être préparé en grandes quantités; toutefois, il est recommandé de les conserver dans des aliquotes plus petites (p. ex., 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL) pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Ce milieu peut être conservé à -20 °C jusqu’à 3 mois et peut être décongelé à 4 °C pendant la nuit avant utilisation.
3. Préparer le milieu d’induction des podocytes en reconstituant à une concentration finale de 100 ng/mL de BMP7, 100 ng/mL d’activine A, de 50 ng/mL de VEGF, de 3 μM de CHIR99021, de 1x supplément sans sérum B27 et d’acide rétinoïque tout-trans de 0,1 μM dans du DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Protéger le milieu de la lumière (p. ex., en enveloppant le contenant avec du papier d’aluminium).
   REMARQUE: Ce milieu peut être préparé en grandes quantités et stocké dans l’obscurité à -20 ° C pendant 3 mois. Les aliquotes congelées doivent être décongelées pendant la nuit à 4 °C avant utilisation.
4. Préparer 25 mL de solution neutralisante de trypsine en ajoutant 10 % (vol/vol) de FBS inactivé par la chaleur dans le DMEM/F12 et filtrer dans des conditions stériles.
5. Pour le maintien post-différenciation des podocytes dérivés de cellules souches, préparer le milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes en ajoutant le supplément au milieu basal conformément aux directives du fabricant et conserver à 4 ° C jusqu’à deux semaines.

3. Culture cellulaire hiPS sans mangeoire utilisant un milieu de culture cellulaire hiPS

1. Aspirer la solution résiduelle de la matrice BM 1 des plaques pré-enduites et laver les puits 3 fois avec 1 à 2 mL de DMEM/F12 réchauffé.
2. Aspirer le CCM hiPS des cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 réchauffé. Ajouter 1 mL de solution chaude de détachement cellulaire et incuber pendant 1 min à 37 °C pour aider à dissocier les cellules. Effectuez une inspection visuelle des cellules sous un microscope de culture tissulaire et assurez-vous que les bords des colonies cellulaires semblent arrondis, puis aspirez rapidement la solution de détachement cellulaire des cellules (en veillant à ce que les colonies cellulaires soient toujours attachées à la plaque, bien que lâchement). Rincez doucement les cellules une fois avec DMEM/F12 pour éliminer la solution de détachement cellulaire.
3. Ajouter 3 mL de CCM hiPS aux cellules hiPS (dans chaque puits d’une plaque de 6 puits) qui ont été traitées avec la solution de détachement cellulaire. Grattez les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules et pipettez doucement la suspension de cellules de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes. Lavez soigneusement la plaque pour vous assurer que toutes les cellules sont récoltées.
   REMARQUE: L’utilisation d’une pipette de 5 mL est recommandée pour éviter un cisaillement excessif sur les cellules.
4. Transférer 0,5 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 6 puits revêtue de matrice BM 1 contenant 2 mL de CCM hiPS par puits. Déplacez la plaque en figure huit pour répartir les colonies cellulaires dans les puits et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO_2. Rafraîchissez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être passées ou utilisées pour l’expérience de différenciation (environ 70 % de confluence).
   REMARQUE: La taille idéale de la colonie pour le passage de routine des CS IPS se situe entre 200 et 500 μm dans des conditions sans mangeoire en utilisant hiPS CCM (sans inhibiteur de ROCK). Si les cellules sont individualisées pendant le traitement avec des enzymes de dissociation ou des tampons, le CCM hiPS peut être complété par un inhibiteur de ROCK (par exemple, 10 μM Y27632) pour améliorer la viabilité cellulaire.

4. Différenciation des cellules hiPS en cellules mésodermiques (jours 0-2)

1. Alors que les cultures cellulaires hiPS sont en phase de croissance exponentielle (environ dans les 4 jours suivant la culture après le passage, et environ 70% de confluence), inspectez visuellement la présence de cellules spontanément différenciées à l’intérieur et autour des bords des colonies. Si nécessaire, grattez de manière aseptique les zones de différenciation.
2. Aspirer hiPS CCM à partir de cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 chaud. Incuber les cellules avec 1 mL de tampon de dissociation cellulaire sans enzyme pendant 10 min à 37 °C et vérifier la dissociation au microscope. En raison des différences inhérentes entre les différentes lignées cellulaires hiPS, le temps d’incubation réel du tampon de dissociation cellulaire doit être déterminé pour une lignée cellulaire donnée.
3. Grattez doucement le puits avec un élévateur de cellules pour déloger les cellules faiblement adhérentes et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL, puis pipetez plusieurs fois pour individualiser les cellules hiPS.
   1. Porter la suspension cellulaire au volume de 15 mL avec du DMEM/F12 chaud et centrifuger pendant 5 min à 290 x g à température ambiante.
   2. Aspirer doucement le surnageant et resuspendez les cellules avec du DMEM/F12 chaud pour une autre série de centrifugation afin d’éliminer les composants résiduels de la matrice BM 1 et du tampon de dissociation.
4. Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans 1 mL de milieu d’induction du mésoderme comme décrit ci-dessus. Compter le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de coulter pour déterminer le volume approprié de milieu de différenciation du mésoderme nécessaire pour atteindre une concentration de 1 x^{10 5} cellules/mL.
5. Aspirer la solution ECM à partir des plaques enduites de la matrice BM 2 et rincer les plaques deux fois avec du DMEM/F12 chaud. Mélangez doucement la suspension de la cellule hiPS en pipetant plusieurs fois. Transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits des plaques de 12 puits revêtues de la matrice BM à 2, puis secouer doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément.
6. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO_2. Rafraîchissez le milieu d’induction du mésoderme le lendemain.
   REMARQUE: Après 2 jours, les cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS seraient prêtes pour l’induction intermédiaire du mésoderme.

5. Différenciation des cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS en mésoderme intermédiaire (jours 2-16)

1. Au jour 2 du protocole de différenciation, aspirer le milieu d’induction du mésoderme et reconstituer avec 1 mL par milieu d’induction du mésoderme intermédiaire.
2. Rafraîchissez le milieu tous les jours pour maintenir un seuil précis de facteurs de croissance et de petites molécules pour les cellules métaboliquement actives. S’il y a une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments des milieux (indiqué par le jaunissement des milieux), le volume du milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme peut être augmenté à 1,3 mL par puits des 12 plaques de puits.
3. Culturez des cellules pendant 14 jours supplémentaires pour obtenir des cellules de mésoderme intermédiaires. Au jour 16, ces cellules peuvent être cryoconservées pour une utilisation ultérieure.

6. Différenciation des cellules mésodermiques intermédiaires dérivées des cellules hiPS en podocytes (jours 16 à 21)

1. Rincer les cellules du mésoderme intermédiaire avec du DMEM/F12 chaud suivi d’une incubation des cellules avec 0,5 mL par puits de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 3 min à 37 °C. Effectuez une inspection visuelle pour vous assurer que les cellules commencent à se dissocier.
2. Gratter les cellules à l’aide d’un élévateur de cellules et pipeter la suspension cellulaire plusieurs fois à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL pour obtenir des cellules individualisées (ou de petits amas).
   REMARQUE: À ce stade, assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées car les cellules agrégées peuvent ne pas acquérir un phénotype différencié en phase terminale dans la chronologie du protocole.
3. Ajouter environ 2 mL par puits de solution neutralisante de trypsine pour arrêter l’activité de la trypsine.
4. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 mL et porter le volume à 50 mL en utilisant DMEM/F12, puis centrifuger la suspension de la cellule pendant 5 min à 201 x g à température ambiante.
5. Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans le milieu d’induction des podocytes. Pour des résultats optimaux, assurez-vous d’une densité d’ensemencement finale d’environ 100 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits. Ajoutez la suspension cellulaire aux plaques à 2 couches de la matrice BM et secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément.
6. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ et rafraîchir le milieu quotidiennement jusqu’à 5 jours pour obtenir des podocytes au jour 21.
   REMARQUE: Les podocytes dérivés de cellules hiPS résultants peuvent être maintenus en culture pendant 2 à 4 semaines supplémentaires en utilisant un milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes. Une fois dans un milieu d’entretien des podocytes, les cellules peuvent être nourries tous les deux jours et peuvent être utilisées pour des études ultérieures ou des analyses en aval.

Résultats

L’objectif de ce protocole était de démontrer que les podocytes humains matures peuvent être dérivés de cellules hiPS dans des conditions chimiquement définies. Les données présentées dans ce manuscrit ont été générées en utilisant la lignée cellulaire DU11 hiPS¹⁷, qui a d’abord été testée et s’est avérée exempte de mycoplasmes. Une analyse chromosomique a également été effectuée et les cellules se sont avérées normales sur le plan caryotypique. En commençant par l...

Discussion

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour la génération de podocytes glomérulaires rénaux à partir de cellules hiPS. Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires associées au phénotype¹³du podocyte rénal mature. Dans des publications antérieures, nous avons montré que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent imiter la structure et la fonction de filtration sélective du glomérule rénal lorsqu’ils sont co...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)	72262	Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement	17504044	Thermo/Life Technologies
CHIR99021	04-0004	Stemgent	May show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R	4Z0-500-R	Cell Systems	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	12634028	Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	10565042	Thermo/Life Technologies	DMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	10082147	Thermo/Life Technologies
Human activin A	PHC9564	Thermo/Life Technologies
Human BMP7	PHC9544	Thermo/Life Technologies
Human VEGF	PHC9394	Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium	05850	Stem Cell Technologies	hiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)	15140-163	Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor	1254	Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies	A32744; A32754; A-11076; A32790	Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)	ab20680	Abcam
Nephrin	GP-N2	Progen
OCT4	AF1759	R&D Systems
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	N-892012	Iwai North America	Basement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	354277	BD Biosciences	Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
Accutase	A1110501	Thermo/Life Technologies	Cell detachment solution
BSA	A9418	Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D2438	Sigma-Aldrich	DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt	13150016	Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	97065-058	VWR	Ethanol is flammable and toxic
FBS	431097	Corning
Paraformaldehyde (PFA)	28906	Thermo/Life Technologies	PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)	14190-250	Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water	15230162	Thermo/Life Technologies
Triton X-100	97062-208	VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%	25300-120	Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped	29442-462	Corning
Avanti J-15R Centrifuge	B99516	Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL	352097	Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL	352098	Corning
Cryoboxes	3395465	Thermo/Life Technologies	For storing frozen aliquots
EVOS M7000	AMF7000	Thermo/Life Technologies	Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer	100503-092	VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	51030403	Thermo/Life Technologies	For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)	Carl Zeiss Microscopy	Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves	40101-346	VWR
Kimwipes, large	21905-049	VWR
Kimwipes, small	21905-026	VWR
P10 precision barrier pipette tips	P1096-FR	Denville Scientific
P100 barrier pipette tips	P1125	Denville Scientific
P1000 barrier pipette tips	P1126	Denville Scientific
P20 barrier pipette tips	P1121	Denville Scientific
P200 barrier pipette tips	P1122	Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped	356551	Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped	356525	Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped	356543	Corning
Steriflip, 0.22 μm, PES	SCGP00525	EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes	1138W14	Thomas Scientific	For aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates	353043	Corning
Tissue culture–treated six-well plates	353046	Corning
VWR white techuni lab coat	10141-342	VWR
Wide-beveled cell lifter	3008	Corning