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요약

여기에 제시된 화학적으로 정의된 프로토콜은 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 > 유전 조작 또는 하위 집단 선택과 무관하게 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 유래한다. 이 프로토콜은 26 일 이내에 원하는 세포 유형을 생성하고 신장 독성 검사 및 질병 모델링에 유용 할 수 있습니다.

초록

신장 병은 전 세계 인구의 10% 이상에 영향을 미치고 연방 지출에 수십억 달러의 비용이 듭니다. 신장 질환과 최종 말기 신부전의 가장 심각한 형태는 종종 신장의 여과 장벽을 형성하기 위해 내피 세포 및 구체 지하실 막과 함께 작동하는 고도로 전문화 된 상피 세포인 구체 포도세포의 손상에 의해 발생합니다. 신장 의학의 발전은 1 차 조직의 제한된 가용성과 podocytes와 같은 기능적인 인간 신장 세포의 파생을 위한 강력한 방법의 부족에 의해 방해되었습니다. 줄기 세포와 같은 재생 가능한 소스에서 podocytes를 파생하는 기능은 인간 신장 발달 및 질병의 기계장치의 현재 이해를 발전시키는 것을 도울 뿐만 아니라 치료 발견을 위한 새로운 공구를 제공할 수 있었습니다. 이 프로토콜의 목표는 고효율 및 특이성을 가진 인간 유도만능 줄기 (hiPS) 세포로부터 성숙하고 미토성 후 podocytes를 추출하고 화학적으로 정의된 조건하에서 도출하는 방법을 개발하는 것이었습니다. 이 방법에 의해 생성된 hiPS 세포 유래 podocytes는 혈통 특이적 마커(nephrin, podocin 및 Wilm의 종양 1 포함)를 발현하고 성숙하고 기능적인 podocytes와 관련된 특수형태특성(1차 및 이차 발 프로세스 포함)을 나타낸다. 흥미롭게도, 이러한 특수 특징은 특히 현장에서 널리 사용되는 불멸의 podocyte 세포주에서 결석하며, 이는 본원에 기술된 프로토콜이 기존의 podocyte 세포주보다 발달적으로 더 성숙한 표현형을 갖는 인간 신장 podocytes를 생산한다는 것을 시사한다.

서문

인간 만능 줄기 세포 배양의 발전은 연구자들이인체내거의 모든 세포 유형을 얻기 위해 설계될 수 있는 생물학적 물질의 재생 가능하고 확장 가능한 근원을 제공함으로써 재생 의학, 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 혁명을 일으킬 태세입니다. 이 전략은 그렇지 않으면 얻기 어려울 전문적이고 기능적인 세포 유형을 유도하는 데 특히 유용합니다. 인간 유도만능 줄기(hiPS) 세포2,3,4,5는 그들의 체세포 기원 과 개인화된 의학을 대변하는 잠재력 때문에 특히 매력적이다. 그러나, hiPS 세포로부터 다른 세포 혈통을 유도하는 방법을 개발하는 방법은 낮은 효율과 비특이적 세대의 이종세포 집단을 유도하는 제대로 정의된 배양 조건의 빈번한 사용으로 인해 여전히 어려운 남아 있다6,7.

여기에 제시된 화학적으로 정의된 조건하에서 특이성과 고효율을 가진 hiPS 세포로부터 성숙한 신장 세포세포의 유래를 위한 방법이 있다. 세포 마이크로환경 내의 다중 인자의 역할을 고려하여 세포 배양 배지에 제시된 수용성 인자의 최적화뿐만 아니라 세포외 매트릭스 성분 또는 접착제 기판과 같은 불용성 인자의 최적화를 포함하는 줄기 세포 분화 전략이 개발되었다. 포도세포 발달 및 기능에서 인테그린 신호의 중요성을 감안할 때, 세포 표면에 있는 인테그린 수용체의 발현은 처음에 검토되었다. β1 인테그린은 hiPS 세포뿐만 아니라 중질 및 중간 중질 세포를 포함하는 유도체에서도 높게 발현되었다8,9,10. 후속 실험은 β1 통합에 결합하는 리간드(라미닌 511 또는 라미닌 511-E8 단편 포함)가 아래에 설명된 수용성 유도성 매체와 함께 사용될 때 hiPS 세포의 접착 및 분화를 podocytes로 분리하는 것을 확인하였다.

세포 계보 약정의 유도는 먼저 액티빈 A, CHIR99021 및 Y27632 바위 억제제가 함유된 배지의 존재 속에서 라미닌 코팅 표면에 배양된 hiPS 세포가 초기 메소더름 마커 HAND1, 거스로이드 및 brachry81,brachry81을발현하는 세포로 분화할 수 있음을 확인함으로써 시작되었다. 14일 동안 중피세포를 골형태유전학단백질 7(BMP-7) 및 CHIR99021로 보충한 중간 중질세포를 치료하여 신장-전구 세포 마커 윌름의 종양 1(WT1), 홀수 건너뛰관련 단백질 1(OSR1) 및 12유전자(OSR1) 및 12유전자(OSR1)및12유전자(OSR1) 및12유전자를발간하였다. 성숙한 신장 구체 포도세포를 도출하기 위하여는, 중간 중구 세포는 BMP-7, 액티빈 A, 혈관 내피 성장 인자(VEGF),모든-트랜스 망막산 및 CHIR99021로 구성된 새로운 매체로 4-5 일 동안 처리되었다. 유동 세포및 면역스테인링은 생성된 세포의 >90%가 성숙한 신장 분두세포의 분자, 형태학적 및 기능적 특성을나타낸다는 것을 확인하기 위해 사용되었다8,11,13. 이러한 특성은 기본 및 이차 발 프로세스의 개발을 포함한다; SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28을 포함하는 포도세포 계보 특이적 유전자의 발현및 포도신, 네프린 및 WT114,15,16을포함하는 단백질의 발현. 또한, hiPS 세포 유래 podocytes는 상용 배지8,11을 사용하여 시험관 내에서 최대 4주 동안 배양하여 유지될 수 있어 다운스트림 실험의 타이밍에 추가적인 유연성을 제공한다는 것을 발견하였다. hiPS-podocytes의 순도를 결정하는 데 사용되는 유동 세포측정패널에 대한 자세한 내용은 이전간행물(11)을참조하십시오.

프로토콜

1. 시약 준비

  1. 희석 해동 5x hiPS 세포 배양 매체 (CCM) hiPS 세포 배양 기저 배지에 보충 hiPS CCM의 1 x 용액을 얻을 수 있습니다.
    참고 : 냉동 5x hiPS CCM 보충은 하룻밤 동안 이상적으로 4 ° C에서 느린 해동 과정이 필요합니다. 1x hiPS CCM의 알리쿼트(Aliquots)는 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있다.
  2. hiPS 세포 배양을 위한 지하 막(BM) 매트릭스 1코팅 판의 준비: 4°C에서 얼음에 하룻밤 을 해동 BM 매트릭스 1. 해동되면 제조업체에서 제안한 적절한 희석 요인으로 알리쿼트를 준비하십시오.
    참고: 일반적으로 알리쿼트(aliquots)는 50mL 원추형 튜브에서 25mL의 콜드 DMEM/F12에서 후속 희석을 위해 준비된 다음 BM 매트릭스 1을 완전히 용해하고 잔류 결정의 형성을 피하기 위해 철저한 혼합을 한다.
  3. BM 매트릭스 1용액의 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 전송하고 37°C에서 1-2h 또는 4°C에서 파라핀 필름으로 싸서. BM 매트릭스 1-코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C로 저장할 수 있다.
  4. 지하 멤브레인 (BM) 매트릭스 2 - 코팅 플레이트의 준비 : 5 μg / mL의 최종 농도를 준비하기 위해 9 mL 멸균 증류수에 BM 매트릭스 2의 적절한 양을 희석. BM 매트릭스 2 용액의 700 μL을 12웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
  5. BMP7, 액티빈 A 및 VEGF 각각 100 μg/mL 스톡 솔루션을 준비하십시오: BMP7을 0.1%(wt/vol) BSA를 함유한 멸균 증류수의 BMP7을 재구성하고 0.1%(wt/vol)를 함유한 멸균 PBS에서 별도로 액티빈 A 및 VEGF를 재구성한다. 빈번한 동결 해동 주기를 피하기 위해 각 스톡 솔루션에서 100 μL 알리코트100을 준비하고 -20°C에 최대 6개월 간 보관하십시오.
  6. 멸균 증류수 3.079mL에서 Y27632 10 mg을 용해하여 Y27632의 10m M 스톡 솔루션을 준비한다. 육수에서 100 μL을 알리쿼트하고 -20°C에 보관하여 최대 6개월 동안 보관합니다.
  7. 멸균 DMSO 143.4 μL에 CHIR99021 2 mg을 녹여 30mM 스톡 솔루션을 준비합니다. 5 μL 알리쿼트를 준비하고 최대 1개월 동안 -20°C에 보관하십시오(또는 제조업체의 권장 사항에 따라).
  8. 3.33mL 멸균 DMSO에 10 mg의 올트랜스 망티노산을 녹입니다. 500 μL 알리쿼트를 준비하고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.

2. 문화미디어 준비

  1. 상응하는 스톡 용액을 100 ng/mL 액티빈 A, 3 μM CHIR99021, 10μM Y27632 및 1x B27 혈청 프리 보충제로 보충하여 중피 분화 매체를 대미염 보충제와 함께 준비한다.
    참고: 중피 분화 배지는 분화 단계 전에 실험의 규모에 적합한 부피로 신선하게 준비되어야 합니다(일반적으로 50mL의 배지는 2개의 12웰 플레이트에 적합).
  2. 글루타민 보충제를 사용하여 DMEM/F12의 최종 농도 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 및 1x B27 세럼 프리 보충제로 해당 스톡 솔루션을 재구성하여 중간 중질 균분화 매체를 준비한다.
    참고: 필요한 경우, 배지는 1% (vol/vol) 페니실린-연쇄절제술로 보충될 수 있습니다. 글루타민 보충제로 DMEM/F12를 사용하여 매체의 부피를 조절합니다. 이 매체는 큰 배치로 제조 될 수있다; 그러나, 반복동결 해동 주기를 피하기 위해 작은 알리쿼트(예: 50mL 원판 튜브에 45mL)에 저장하는 것이 좋습니다. 이 매체는 최대 3개월 동안 -20°C에 보관할 수 있으며 사용하기 전에 하룻밤 사이에 4°C에서 해동될 수 있다.
  3. 최종 농도 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL 활성제 A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 혈청 프리 보충제, 및 0.1M μ-트랜스노비드 비약제 및 0.1M μ-트랜스노비드 비약 제비 로 FM2의 비료 를 보충하여 포도시테 유도 매체를 준비한다. 빛으로부터 매체를 보호하십시오(예: 호일 용지로 용기를 래핑하여).
    참고:이 매체는 큰 배치로 제조하고 최대 3 개월 동안 -20 °C에서 어둠 속에서 저장할 수 있습니다. 냉동 알리쿼트사용 전에 4°C에서 하룻밤 동안 해동해야 합니다.
  4. DMEM/F12에 10%(vol/vol) 열 비활성화 FBS를 추가하고 멸균 조건하에서 필터를 추가하여 25mL의 트립신 중화 솔루션을 준비하십시오.
  5. 줄기 세포 유래 podocytes의 후분화 유지를 위해 제조업체의 지침에 따라 기저 배지에 보충제를 추가하여 podocyte 유지 보수 매체로 완전한 매체를 준비하고 최대 2 주 동안 4 °C에 보관하십시오.

3. hiPS 세포 배양 배지를 이용한 피더 프리 hiPS 세포 배양

  1. BM 매트릭스 1의 잔류 용액을 미리 코팅된 플레이트에서 흡기하고 1~2mL의 데운 DMEM/F12로 우물을 3회 세척한다.
  2. 흡인은 hiPS 세포에서 hiPS CCM을 보냈고 데운 DMEM/F12로 세포를 3번 헹구었습니다. 1mL의 웜 셀 분리 용액을 추가하고 37°C에서 1분 동안 배양하여 세포를 해리시화합니다. 조직 배양 현미경하에서 세포의 육안 검사를 수행하고 세포 식민지의 가장자리가 둥글게 나타나는지 확인 한 다음 세포 분리 용액을 신속하게 흡인합니다 (세포 식민지가 여전히 접시에 부착되도록하십시오.하지만 느슨하게). DMEM/F12로 세포를 한 번 부드럽게 헹구어 세포 분리 용액을 제거합니다.
  3. 세포 분리 용액으로 처리된 hiPS 세포(6웰 플레이트의 각 웰)에 hiPS CCM 3mL을 추가합니다. 셀 리프터를 사용하여 콜로니를 긁어 내고, 느슨하게 부착된 세포를 제거하기 위해 부드럽게 피펫 셀 서스펜션을 위아래로 피펫합니다. 모든 세포가 수확되도록 플레이트를 철저히 세척하십시오.
    참고: 셀의 과도한 전단을 피하기 위해 5mL 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다.
  4. 새로운 BM 매트릭스 1-코팅 6웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 0.5 mL을 잘 당 2 mL의 hiPS CCM을 전달한다. 피겨-8 패션으로 플레이트를 이동하여 우물 내의 세포 식민지를 분배하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 세포가 분화 또는 분화 실험 (약 70 % 수렴)에 사용될 준비가 될 때까지 매일 배지를 새로 고칩니다.
    참고: iPSC의 일상적인 패싱을 위한 이상적인 식민지 크기는 hiPS CCM(ROCK 억제제 제외)를 사용하여 피더 없는 조건 하에서 200-500 μm 사이입니다. 세포가 해리 효소 또는 완충제로 치료하는 동안 개별화되는 경우, hiPS CCM은 세포 생존가능성을 향상시키기 위해 ROCK 억제제(예를 들어, 10 μM Y27632)로 보충될 수 있다.

4. hiPS 세포의 분화 는 중피 세포로 분화 (일 0-2)

  1. hiPS 세포 배양은 기하급수적 성장 단계(월화 후 배양 의 약 4 일 이내에 약 70 % 수렴)에 있는 동안, 식민지의 가장자리 안팎에서 자발적으로 분화 된 세포의 존재를 시각적으로 검사합니다. 필요한 경우 차균적으로 차별화 영역을 긁어냅니다.
  2. hiPS 세포에서 흡인 hiPS CCM을 흡인하고 따뜻한 DMEM/F12로 세포를 3번 헹구세요. 37°C에서 10분 동안 효소가 없는 세포 해리 버퍼1mL로 세포를 배양하고 현미경하에서 해리를 확인한다. 상이한 hiPS 세포주 간의 내재된 차이로 인해 세포 해리 버퍼의 실제 잠복기 시간은 지정된 세포주를 위해 결정되어야 합니다.
  3. 느슨하게 부착된 세포를 빼내고 셀 현탁액을 15mL 원추형 튜브로 옮기고, 그 다음에 는 hiPS 세포를 개별화하기 위해 여러 번 피펫팅하여 셀 리프터로 우물을 부드럽게 긁어냅니다.
    1. 실온에서 290 x g에서 5 분 동안 따뜻한 DMEM / F12 및 원심 분리기로 셀 서스펜션을 15 mL 볼륨으로 가져옵니다.
    2. 잔류 BM 매트릭스 1 및 해리 버퍼 구성 요소를 제거하기 위해 상체를 부드럽게 흡인하고 따뜻한 DMEM / F12로 세포를 다시 분리하여 원심 분리의 또 다른 라운드를 제거합니다.
  4. 상술한 바와 같이 중피 유도 배지의 1mL에서 슈퍼네티산을 흡인하고 세포를 재중단한다. 혈류계 또는 쿨터 카운터를 사용하여 세포의 총 수를 계산하여 1 x 105 세포/mL의 농도를 달성하는 데 필요한 중피 분화 배지의 적절한 부피를 결정한다.
  5. BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에서 ECM 용액을 흡입하고 따뜻한 DMEM / F12로 플레이트를 두 번 헹구십시오. 몇 번 피펫팅하여 hiPS 셀 서스펜션을 부드럽게 섞습니다. BM 매트릭스 2 코팅 12웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션의 1mL를 전송한 다음 부드럽게 판을 흔들어 세포를 더 균등하게 분배합니다.
  6. 5% CO2 인큐베이터에서 플레이트를 37°C로 배양합니다. 다음 날 중피 유도 매체를 새로 고칩니다.
    참고: 2일 후에, hiPS 세포 유래 중피 세포는 중간 중증 유도를 위한 준비가 될 것입니다.

5. hiPS 세포 유래 중피 세포의 분화중간경(일 2-16일)

  1. 차별화 프로토콜의 2일째에, 중피 유도 배지를 흡수시키고, 중간 중질도 유도 배지당 1mL로 보충한다.
  2. 신진 대사 활성 세포에 대한 성장 인자와 작은 분자의 정확한 임계 값을 유지하기 위해 매일 매체를 새로 고침. 미디어 영양소의 상당한 세포 성장 및 급속한 고갈이 있는 경우(매체의 황변에 의해 표시), 중간 중구 분화 배지의 부피는 12웰 플레이트의 웰당 1.3mL로 증가될 수 있다.
  3. 중간 중피 세포를 얻기 위해 추가 14 일 동안 배양 세포. 16일째에, 이 세포는 나중에 사용하기 위해 냉동 보존될 수 있습니다.

6. hiPS 세포 유래 중간 중질 세포의 분화(일 16 받는 사람 21)

  1. 37°C에서 3분 동안 0.05% 트립신-EDTA의 웰당 0.5mL의 세포 배양으로 중간 중음근 세포를 헹구는 다. 세포가 해리되기 시작되었는지 확인하기 위해 육안으로 검사를 수행합니다.
  2. 셀 리프터와 파이펫을 사용하여 세포를 긁어 1,000 μL 파이펫 팁을 사용하여 개별화된 (또는 작은 덩어리) 세포를 얻습니다.
    참고: 이 단계에서, 응집된 세포가 프로토콜의 타임라인 내에서 말단분화 표현형을 획득하지 못할 수 있으므로 세포가 완전히 해리되는지 확인합니다.
  3. 트립신의 활동을 중지 트립신 중화 솔루션의 우물 당 약 2 mL을 추가합니다.
  4. 세포를 50mL 원상 튜브로 옮기고 DMEM/F12를 사용하여 최대 50mL의 부피를 가져온 다음 실온에서 201 x g에서 5분 동안 셀 서스펜션을 원심분리합니다.
  5. 초신자를 흡인하고 포도세포 유도 배지에서 세포를 재중단한다. 최적의 결과를 얻으려면 약 100,000개의 세포/웰의 최종 시드 밀도를 12개의 웰 플레이트로 보장하십시오. BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에 셀 서스펜션을 추가하고 부드럽게 세포를 더 균등하게 분배하는 데 도움이 접시를 흔들어.
  6. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양하고 21일까지 세포세포를 얻기 위해 최대 5일 동안 매일 배지를 새로 고칩니다.
    참고: 결과 hiPS 세포 유래 podocytes는 podocyte 유지 보수 매체를 가진 완전한 매체를 사용하여 2-4 추가 주 동안 배양에서 유지될 수 있습니다. 일단 podocyte 유지 보수 매체에 일단, 세포는 격일로 공급될 수 있고 후속 연구 또는 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다.

결과

이 프로토콜의 목표는 성숙한 인간 podocytes가 화학적으로 정의된 조건의 밑에 hiPS 세포에서 파생될 수 있다는 것을 보여주기 위한 것이었습니다. 본 원고에 제시된 데이터는 처음 테스트된 DU11 hiPS세포주(17)를사용하여 생성되었으며, 마이코플라즈마가 없는 것으로 나타났다. 염색체 분석도 수행되었고, 세포는 karyo전상정상인 것으로 나타났다. 미분화 DU11 hiPS 세포를 시작으로, 본...

토론

이 보고에서는, 우리는 hiPS 세포에서 신장 구엽 포도세포의 생성을 위한 프로토콜을 기술합니다. hiPS 세포 유래 podocytes는 성숙한 신장 podocyte 표현형(13)과관련된 형태학적 및 분자 특징을 나타낸다. 이전 간행물에서, 우리는 hiPS 세포 유래 podocytes가 구체 미생물 혈관 내피 세포와 결합할 때 신장 구체 구체세포의 구조 및 선택적 여과 기능을 모방할 수 있음을 보여주었다

공개

S.M. 만능 줄기 세포에서 신장 podocytes의 생성을 위한 방법에 대한 특허 출원에 대한 저자입니다 (미국 특허 출원 14/950859). 나머지 저자는 경쟁 적인 관심사가 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 듀크 대학의 공학의 프랫 학교, 듀크 의과 대학의 신장학 부문, 듀크 대학의 의과 대학에서 의자 연구 상, 그리고 S.M버로우 웰스 웰컴 펀드 PDEP 경력 전환 애드 호크 상에 의해 지원되었다. M.B국립과학재단의 대학원 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 받았습니다. 우리는 DU11 줄기 세포주를 아낌없이 우리에게 제공 버삭 연구소, 일시적으로 우리의 그룹과 자신의 조직 문화 시설을 공유 듀크 대학의 Varghese 연구소에 감사드립니다. 이 출판물은 그녀의 60번째 생일을 축하하기 위해 매사추세츠 공과 대학의 노바티스 화학 교수 인 로라 L. 키슬링 교수에게 헌정되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
DU11 human iPS cellsThe DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)72262Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004StemgentMay show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R4Z0-500-RCell SystemsPodocyte maintenance media
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS10082147Thermo/Life Technologies
Human activin APHC9564Thermo/Life Technologies
Human BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
Human VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium05850Stem Cell TechnologieshiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor1254Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodiesA32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R&D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentN-892012Iwai North AmericaBasement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial354277BD BiosciencesBasement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
AccutaseA1110501Thermo/Life TechnologiesCell detachment solution
BSAA9418Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)D2438Sigma-AldrichDMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt13150016Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade97065-058VWREthanol is flammable and toxic
FBS431097Corning
Paraformaldehyde (PFA)28906Thermo/Life TechnologiesPFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%25300-120Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped29442-462Corning
Avanti J-15R CentrifugeB99516Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL352097Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL352098Corning
Cryoboxes3395465Thermo/Life TechnologiesFor storing frozen aliquots
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life TechnologiesFlourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator51030403Thermo/Life TechnologiesFor the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)Carl Zeiss MicroscopyUsed to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves40101-346VWR
Kimwipes, large21905-049VWR
Kimwipes, small21905-026VWR
P10 precision barrier pipette tipsP1096-FRDenville Scientific
P100 barrier pipette tipsP1125Denville Scientific
P1000 barrier pipette tipsP1126Denville Scientific
P20 barrier pipette tipsP1121Denville Scientific
P200 barrier pipette tipsP1122Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped356551Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped356525Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped356543Corning
Steriflip, 0.22 μm, PESSCGP00525EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes1138W14Thomas ScientificFor aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates353043Corning
Tissue culture–treated six-well plates353046Corning
VWR white techuni lab coat10141-342VWR
Wide-beveled cell lifter3008Corning

참고문헌

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

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