הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

Summary

מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (>90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.

Abstract

מחלת כליות משפיעה על יותר מ -10% מהאוכלוסייה העולמית ועולה מיליארדי דולרים בהוצאות פדרליות. הצורות החמורות ביותר של מחלת כליות ואי ספיקת כליות סופנית בסופו של דבר נגרמות לעתים קרובות על ידי הנזק לפודוציטים גלומרולריים, שהם תאי האפיתל המיוחדים ביותר המתפקדים יחד עם תאי אנדותל וקרום המרתף הגלומרולרי כדי ליצור את מחסום הסינון של הכליה. ההתקדמות ברפואה הכליתית הופרעה על ידי הזמינות המוגבלת של רקמות ראשוניות והיעדר שיטות חזקות להפקת תאי כליות אנושיים פונקציונליים, כגון פודוקיטים. היכולת להפיק פודוקיטים ממקורות מתחדשים, כגון תאי גזע, יכולה לסייע בקידום ההבנה הנוכחית של מנגנוני התפתחות הכליות והמחלות האנושיות, וכן לספק כלים חדשים לגילוי טיפולי. מטרת פרוטוקול זה הייתה לפתח שיטה להפקת פודוקיטים בוגרים, פוסט-מיטוטיים מתאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם עם יעילות וספציפיות גבוהות, ובתנאים מוגדרים כימית. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS המיוצרים בשיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לשושלת היוחסין (כולל נפרין, פודוקין וגידול 1 של וילם) ומציגים את המאפיינים המורפולוגיים המיוחדים (כולל תהליכי כף הרגל הראשוניים והמשניים) הקשורים לפודוציטים בוגרים ופונקציונליים. באופן מסקרן, תכונות מיוחדות אלה נעדרות באופן בולט בקו התא הפודוקיט המונצח הנמצא בשימוש נרחב בתחום, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המתואר כאן מייצר פודוקיטים של כליות אנושיות שיש להן פנוטיפ בוגר יותר מבחינה התפתחותית מאשר קווי התאים הפודוקיטים הקיימים המשמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה של כליות אנושיות.

Introduction

ההתקדמות בתרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים צפויה לחולל מהפכה ברפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וסינון תרופות על ידי מתן מקור מתחדש ומדרגי של חומר ביולוגי שניתן להנדס כדי להשיג כמעט כל סוג תא בגוף^{האדם 1}. אסטרטגיה זו שימושית במיוחד להפקת סוגי תאים מיוחדים ופונקציונליים שאחרת היה קשה להשיג. תאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם^2,3,4,5 הם אטרקטיביים במיוחד בשל מוצא התא הסומטי שלהם ואת הפוטנציאל שהם מייצגים לרפואה מותאמת אישית. עם זאת, פיתוח שיטות לגזור שושלות תאים אחרות מתאי hiPS נשאר מאתגר בשל השימוש התכוף בתנאי תרבות מוגדרים בצורה גרועה אשר מוביל ליעילות נמוכה ודור לא ספציפי של אוכלוסיות תאים הטרוגניים^6,7.

מוצג כאן היא שיטה לגירוש של podocytes כליות בוגרות מתאי hiPS עם ספציפיות ויעילות גבוהה בתנאים מוגדרים כימית. על ידי בחינת התפקידים של גורמים מרובים בתוך microenvironment התא, אסטרטגיית בידול תאי גזע פותחה כי מעורבים אופטימיזציה של גורמים מסיסים המוצגים במדיום תרבית התא, כמו גם גורמים בלתי מסיסים, כגון רכיבי מטריצה חוץ תאית או מצעים דבק. בהתחשב בחשיבות האיתות האינקגרי בהתפתחות ובתפקוד של הפודוקיטה, הביטוי של קולטנים integrin על פני התא נבדק בתחילה. β1 integrins באו לידי ביטוי מאוד לא רק בתאי hiPS, אלא גם בנגזרותיהם כולל mesoderm ותאי mesoderm ביניים^8,9,10. ניסויים הבאים אישרו כי ליגנדים שנקשרים לאינטגרינים β1 (כולל למינין 511 או למינין 511-E8) תומכים בהידבקות ובידול של תאי hiPS לפודוציטים כאשר נעשה בהם שימוש בשילוב עם המדיה האינדוקטיבית המסיסה המתוארת להלן.

אינדוקציה של מחויבות שושלת התאים יזמה על ידי אישור תחילה כי תאי hiPS בתרבית על המשטחים מצופים למינין במשך יומיים בנוכחות מדיום המכיל Activin A, CHIR99021, ומעכב סלע Y27632 יכול להבדיל לתאים המבטאים את סמני mesoderm מוקדם HAND1, עור ברווז, brachyury^8,11. טיפול בתאי mesoderm במשך 14 ימים עם מדיום בתוספת חלבון מורפוגנטי עצם 7 (BMP-7) ו CHIR99021 אפשר את הנגזרת של תאי mesoderm ביניים שביטא את סמני תא נפרון-אבות גידול 1 (WT1), חלבון קשור דילוג מוזר 1 (OSR1)^8,11, ואת הגן תיבת מזווג 2 חלבון (PAX2)¹². כדי להפיק את הפודוקיטים הגלומרולריים הבוגרים של הכליות, תאי המסודרם הבינוניים טופלו במשך 4-5 ימים במדיום חדשני המורכב מ- BMP-7, Activin A, גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), חומצה ריטינואיתטרנסית ו- CHIR99021. ציטומטריית זרימה וחיסון שימשו כדי לאשר כי >90% מהתאים המתקבלים הציגו את המאפיינים המולקולריים, המורפולוגיים והתפקודיים של פודוקייט הכליות הבוגר^8,11,13. מאפיינים אלה כוללים התפתחות של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל; הביטוי של גנים ספציפיים לשושלת שושלת פודוקיטים כולל SYNPO, PODXL, MAF, EFNB2⁸ וביטוי של חלבונים כולל פודוקין, נפרין, ו WT1^14,15,16. בנוסף, נמצא כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS ניתן לשמור בתרבות עד ארבעה שבועות במבחנה באמצעות בינוני זמין מסחרית 8^,11 אשר מספק^גמישותנוספת בתזמון של ניסויים במורד הזרם. לקבלת מידע נוסף לגבי לוחות ציטומטריית הזרימה המשמשים לקביעת טוהר ה- hiPS-podocytes, עיין בפרסום הקודם שלנו¹¹.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

1. לדלל 5x hiPS תרבית תאים מדיה (CCM) תוספת במדיום בזלת תרבית התא hiPS כדי להשיג פתרון 1x של hiPS CCM.
   הערה: תוספת CCM קפואה של 5x hiPS דורשת תהליך הפשרה איטי, באופן אידיאלי ב-4 °C (70°F) למשך הלילה. Aliquots של 1x hiPS CCM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 °C (70 °F).
2. הכנת מטריצת קרום המרתף (BM) 1 מצופה צלחות עבור תרבית התא hiPS: מטריצת BM להפשיר 1 לילה על קרח ב 4 °C (70 °F). לאחר הפשרה, להכין aliquots עם גורמי דילול מתאימים כפי שהוצע על ידי היצרן.
   הערה: בדרך כלל, aliquots מוכנים לדילול הבא ב 25 מ"ל של DMEM קר / F12 בצינור חרוט 50 מ"ל ואחריו ערבוב יסודי כדי להמיס לחלוטין את מטריצת BM 1 ולהימנע היווצרות של גבישים שיורית.
3. העבר 1 מ"ל של פתרון מטריצת BM 1 לכל באר של צלחת 6 טוב ודגרה ב 37 °C (1-2 שעות) או ב 4 °C (55 °F) לכל הפחות של 24 שעות, עטוף בסרט פרפין. מטריצת BM 1 -מצופה לוחות ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד 2 שבועות.
4. הכנת מטריצת קרום מרתף (BM) 2 - לוחות מצופים: לדלל כמויות מתאימות של מטריצת BM 2 במים מזוקקים סטריליים 9 מ"ל כדי להכין ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף 700 μL של פתרון מטריצת BM 2 לכל באר של צלחת 12 היטב ולדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות או לילה ב 4 °C (7 °F).
5. הכן 100 פתרונות מלאי מיקרוגרם / mL כל BMP7, Activin A, ו VEGF כדלקמן: reconstitute BMP7 במים מזוקקים סטריליים המכילים 0.1% (wt/ vol) BSA ו Activin A ו- VEGF משוחזר בנפרד PBS סטרילי המכיל 0.1% (wt / vol) BSA. כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה תכופים, להכין 100 aliquots μL מכל פתרון מלאי ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.
6. הכן פתרון מלאי 10 mM של Y27632 על ידי המסת 10 מ"ג של Y27632 ב 3.079 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים. Aliquot 100 μL מהמלאי ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.
7. להמיס 2 מ"ג של CHIR99021 ב 143.4 μL של DMSO סטרילי כדי להכין פתרון מלאי 30 mM. הכן 5 עליקוטים μL ולאחסן ב -20 °C (5 °F) עד חודש אחד (או על פי המלצת היצרן).
8. יש להמיס 10 מ"ג של חומצהרטינואית טרנסית ב-DMSO סטרילי 3.33 מ"ל. הכן 500 עליקוטים μL ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.

2. הכנת מדיה תרבותית

1. הכן את מדיום בידול mesoderm על ידי שחזור פתרונות מלאי מתאימים לריכוז סופי של 100 ng / mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632, 1x B27 ללא סרום תוספת בנפח מתאים של DMEM/12 עם תוסף גלוטמין.
   הערה: מדיום בידול mesoderm צריך להיות מוכן טרי לפני צעדי בידול ובנפח המתאים בקנה המידה של הניסוי (בדרך כלל, 50 מ"ל של בינוני מתאים עבור שתי 12 לוחות היטב).
2. הכן בינוני בידול מסודרם ביניים על ידי שחזור פתרונות מלאי מתאימים לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מ"ל BMP7, 3 μM CHIR99021 ותוספת 1x B27 ללא סרום ב- DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין.
   הערה: במידת הצורך, ניתן להשלים את המדיום עם 1% (vol/vol) פניצילין-סטרפטומיצין. כוונן את עוצמת המדיום באמצעות DMEM/F12 עם תוספת גלוטמין. מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות; עם זאת, מומלץ לאחסן aliquots קטן יותר (למשל, 45 מ"ל ב 50 mL צינורות חרוט) כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה חוזרים ונשנים. מדיה זו יכולה להיות מאוחסנת ב -20 °C (50 °F) עד 3 חודשים וניתן להפשיר אותה ב 4 °C (55 °F) לילה לפני השימוש.
3. הכן את מדיום האינדוקציה podocyte על ידי reconstiting לריכוז הסופי 100 ng / mL BMP7, 100 ng / mL activin A, 50 ng / mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 ללא סרום תוספת, ו 0.1 μM כל טרנס חומצה רטינואית DMEM / F12 עם תוספת גלוטמין. להגן על בינוני מפני אור (למשל, על ידי עטיפה מיכל עם נייר כסף).
   הערה: מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות ומאוחסנים בחושך ב -20 °C (50 °F) עד 3 חודשים. עליקוט קפוא יש להפשיר לילה בשעה 4 °C (70 °F) לפני השימוש.
4. הכן 25 מ"ל של פתרון נטרול טריפסין על-ידי הוספת 10% (vol/vol) חום מומת FBS ב- DMEM / F12 ומסנן בתנאים סטריליים.
5. לתחזוקה לאחר בידול של פודוקיטים שמקורם בתאי גזע, הכינו את Complete Medium עם מדיית התחזוקה של הפודוקיטים על ידי הוספת התוספת למדיום הבזל לפי הנחיות היצרן, ואחסנו ב-4 °C (7°F) למשך עד שבועיים.

3. תרבית תאי HIPS ללא מאכיל באמצעות מדיום תרבית תאים hiPS

1. שאפו את התמיסה השיורית של מטריצת BM 1 מהצלחות המצולפות מראש ושטפו את הבארות 3 פעמים עם 1 עד 2 מ"ל של DMEM / F12 מחומם.
2. שאיפה בילה hiPS CCM מתאי hiPS ולשטוף את התאים 3 פעמים עם DMEM / F12 מחומם. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים חמים ודגרה במשך 1 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי לעזור לנתק את התאים. בצע בדיקה חזותית של תאים תחת מיקרוסקופ תרבית רקמות וודא כי הקצוות של מושבות התא מופיעים מעוגלים, ולאחר מכן במהירות לשאוף את פתרון ניתוק התאים מהתאים (להבטיח כי מושבות התא עדיין מחוברים לצלחת, אם כי באופן רופף). יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת באמצעות DMEM/F12 כדי להסיר את פתרון ניתוק התאים.
3. הוסף 3 מ"ל של hiPS CCM לתאי hiPS (בכל באר של צלחת 6-well) שטופלו בתמיסת ניתוק התא. לגרד מושבות באמצעות מרים תא, בעדינות pipette תא השעיה למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים דבוקים באופן רופף. לשטוף את הצלחת ביסודיות כדי להבטיח את כל התאים נקצרים.
   הערה: מומלץ להשתמש בצינור 5 מ"ל כדי למנוע גיזמה עודפת על התאים.
4. העבר 0.5 מ"ל של השעיית התא לתוך כל באר של צלחת חדשה של מטריצת BM 1 מצופה 6-באר המכיל 2 מ"ל של hiPS CCM לבאר. הזז את הצלחת בצורה איור-שמונה כדי להפיץ מושבות תאים בתוך בארות ודגורה ב 37 °C בחממה 5 % CO_2. רענן מדי יום עד שהתאים יהיו מוכנים למעבר או לשימוש לניסוי הבידול (כ-70% השפעה).
   הערה: גודל המושבה האידיאלי עבור passaging שגרתי של iPSCs הוא בין 200-500 מיקרומטר בתנאים ללא מאכיל באמצעות hiPS CCM (ללא מעכב ROCK). אם תאים הם אינדיבידואליים במהלך הטיפול עם אנזימי דיסוציאציה או מאגרים, hiPS CCM ניתן להשלים עם מעכב ROCK (למשל, 10 μM Y27632) כדי לשפר את הכדאיות התא.

4. בידול של תאי hiPS לתאי mesoderm (ימים 0-2)

1. בעוד תרביות התא hiPS נמצאות בשלב הצמיחה המעריכי (בערך בתוך 4 ימים של תרבות לאחר המעבר, וכ -70% השפעה), לבדוק חזותית את נוכחותם של תאים מובחנים באופן ספונטני בתוך ומסביב לקצוות המושבות. במידת הצורך, א-פסטי לגרד את אזורי בידול.
2. שאפו ל-HIPS CCM מתאי HIPS ושטפו את התאים 3 פעמים ב-DMEM/F12 חם. לדגור על התאים עם 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תאים ללא אנזימים במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F) ולבדוק את הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. עקב הבדלים אינהרנטיים בין קווי תא hiPS שונים, יש לקבוע את זמן הדגירה בפועל עבור מאגר דיסוציאציה של התא עבור קו תא נתון.
3. לגרד בעדינות את הבאר עם מרים תא כדי לשחרר תאים דבוקים באופן רופף ולהעביר את השעיית התא לצינור חרוטי 15 מ"ל, ואחריו צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להתאים אישית את תאי hiPS.
   1. הביאו את מתלה התא לנפח של 15 מ"ל עם DMEM/F12 חם וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-290 x גרם בטמפרטורת החדר.
   2. שאפו בעדינות את supernatant ו resuspend התאים עם DMEM חם / F12 לסיבוב נוסף של צנטריפוגה כדי להסיר את שאריות מטריצת BM 1 ורכיבי חיץ דיסוציאציה.
4. שאפו את תאי העל והתוכן מחדש ב-1 מ"ל של מדיום אינדוקציה מסודרמי כמתואר לעיל. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer או מונה קולטר כדי לקבוע את הנפח המתאים של מדיום בידול mesoderm הדרוש כדי להשיג ריכוז של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל.
5. שאפו את תמיסת ECM מלוחות המטריצה עם 2 מצופים של BM ושטפו את הצלחות פעמיים ב-DMEM/F12 חם. מערבבים את ההשעיה של תאי HIPS בעדינות על ידי צנרת כמה פעמים. מעבירים מ"ל אחד של מתלה התא לכל באר של צלחות 12-באר מטריצת BM מצופה 2 ולאחר מכן בעדינות לנער את הצלחות כדי להפיץ את התאים באופן שווה יותר.
6. לדגור על הצלחת ב 37 °C (5° C) אינקובטור_{CO 2.} רענן את מדיום האינדוקציה mesoderm למחרת.
   הערה: לאחר יומיים, תאי mesoderm שמקורם בתא hiPS יהיו מוכנים לאינדוקציה מסודרם ביניים.

5. בידול של תאי mesoderm שמקורם בתא hiPS למסודרם ביניים (ימים 2-16)

1. ביום 2 של פרוטוקול הבידול, לשאוף mesoderm אינדוקציה בינונית ולחדש עם 1 מ"ל לכל מדיום אינדוקציה mesoderm ביניים היטב.
2. רענן מדיום כל יום כדי לשמור על סף מדויק של גורמי גדילה ומולקולות קטנות עבור התאים הפעילים מטבולית. אם יש צמיחת תאים משמעותית דלדול מהיר של חומרים מזינים מדיה (מסומן על ידי הצהבה של התקשורת), נפח בינוני בידול mesoderm ניתן להגדיל ל 1.3 מ"ל לכל באר של 12 לוחות היטב.
3. תאי תרבות במשך 14 ימים נוספים כדי להשיג תאי mesoderm ביניים. ביום 16, תאים אלה יכולים להיות cryopreserved לשימוש מאוחר יותר.

6. הבחנה בין תאי mesoderm מתווכים שמקורם בתא HIPS לפודוציטים (ימים 16 עד 21)

1. לשטוף את תאי mesoderm ביניים עם DMEM חם / F12 ואחריו דגירה של התאים עם 0.5 מ"ל לבאר של 0.05 % טריפסין-EDTA במשך 3 דקות ב 37 °C (5 ).C (70 °F). בצע בדיקה חזותית כדי לוודא שהתאים מתחילים להתנתק.
2. לגרד תאים באמצעות מרים תא pipette השעיית התא מספר פעמים באמצעות קצה 1,000 μL pipette כדי להשיג אינדיבידואלי (או גושים קטנים של) תאים.
   הערה: בשלב זה, ודא כי התאים מנותקים לחלוטין כמו תאים מצטברים עלול להיכשל ברכישת פנוטיפ מובחן סופני בתוך ציר הזמן של הפרוטוקול.
3. הוסף כ 2 מ"ל לבאר של פתרון נטרול טריפסין כדי לעצור את הפעילות של טריפסין.
4. העבר תאים לצינור חרוטי 50 מ"ל ולהביא את הנפח עד 50 מ"ל באמצעות DMEM / F12, ולאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 201 x g בטמפרטורת החדר.
5. שאפו את תאי העל והתוכן מחדש במדיום האינדוקציה של הפודוקיט. לקבלת תוצאות מיטביות, להבטיח צפיפות זריעה סופית של כ 100,000 תאים / באר של צלחת 12 היטב. הוסף את מתלה התא ללוחות מצופים 2 מטריצת BM ונער בעדינות את הצלחת כדי לעזור להפיץ את התאים באופן שווה יותר.
6. דגירה תאים ב 37 °C ו 5% CO₂ לרענן בינוני מדי יום עד 5 ימים כדי לקבל podocytes ביום 21.
   הערה: פודוקיטים שמקורם בתא hiPS וכתוצאה מכך ניתן לשמור בתרבות במשך 2-4 שבועות נוספים באמצעות מדיום מלא עם מדיה תחזוקה podocyte. פעם אחת במדיה תחזוקה podocyte, התאים ניתן להאכיל כל יומיים, עשוי לשמש למחקרים הבאים או ניתוחים במורד הזרם.

תוצאות

מטרת פרוטוקול זה הייתה להדגים כי פודוקיטים אנושיים בוגרים יכולים להיגזר מתאי hiPS בתנאים מוגדרים כימית. הנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות קו התא DU11 hiPS¹⁷, אשר נבדקו לראשונה, ונמצאו נקיים ממיקופלסטיסמה. ניתוח כרומוזומלי בוצע גם, והתאים נמצאו תקינים קריוטיפיים. החל מתאי ה-DU11...

Discussion

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוקיטים גלומרולריים בכליות מתאי hiPS. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS מציגים תכונות מורפולוגיות ומולקולריות הקשורות לפנוטיפ פודוקיט הכליות הבוגר¹³. בפרסומים קודמים, הראינו כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS יכולים לחקות את המבנה ואת פונקציית הסינון הסל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg)	72262	Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement	17504044	Thermo/Life Technologies
CHIR99021	04-0004	Stemgent	May show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R	4Z0-500-R	Cell Systems	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	12634028	Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	10565042	Thermo/Life Technologies	DMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	10082147	Thermo/Life Technologies
Human activin A	PHC9564	Thermo/Life Technologies
Human BMP7	PHC9544	Thermo/Life Technologies
Human VEGF	PHC9394	Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium	05850	Stem Cell Technologies	hiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×)	15140-163	Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor	1254	Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies	A32744; A32754; A-11076; A32790	Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)	ab20680	Abcam
Nephrin	GP-N2	Progen
OCT4	AF1759	R&D Systems
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	N-892012	Iwai North America	Basement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	354277	BD Biosciences	Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
Accutase	A1110501	Thermo/Life Technologies	Cell detachment solution
BSA	A9418	Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D2438	Sigma-Aldrich	DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt	13150016	Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	97065-058	VWR	Ethanol is flammable and toxic
FBS	431097	Corning
Paraformaldehyde (PFA)	28906	Thermo/Life Technologies	PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS)	14190-250	Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water	15230162	Thermo/Life Technologies
Triton X-100	97062-208	VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%	25300-120	Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped	29442-462	Corning
Avanti J-15R Centrifuge	B99516	Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL	352097	Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL	352098	Corning
Cryoboxes	3395465	Thermo/Life Technologies	For storing frozen aliquots
EVOS M7000	AMF7000	Thermo/Life Technologies	Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer	100503-092	VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	51030403	Thermo/Life Technologies	For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)	Carl Zeiss Microscopy	Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves	40101-346	VWR
Kimwipes, large	21905-049	VWR
Kimwipes, small	21905-026	VWR
P10 precision barrier pipette tips	P1096-FR	Denville Scientific
P100 barrier pipette tips	P1125	Denville Scientific
P1000 barrier pipette tips	P1126	Denville Scientific
P20 barrier pipette tips	P1121	Denville Scientific
P200 barrier pipette tips	P1122	Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped	356551	Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped	356525	Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped	356543	Corning
Steriflip, 0.22 μm, PES	SCGP00525	EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes	1138W14	Thomas Scientific	For aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates	353043	Corning
Tissue culture–treated six-well plates	353046	Corning
VWR white techuni lab coat	10141-342	VWR
Wide-beveled cell lifter	3008	Corning