单肌纤维隔离与文化从埃默里-德雷福斯肌肉萎缩的早期后纳塔尔发展穆林模型

摘要

在这里，我们提出了一种方法，从同源突变Lamin+8-11小鼠模型，一个非常严重的模型Emery-Dreifus肌肉萎缩症（EDMD）在出生后早期发育阶段有效地获得单肌肉纤维。

摘要

自体显性Emery-Dreifus肌肉萎缩症（EDMD）是由LMNA基因的突变引起的，该基因编码A型核拉明、维持核包络的中间丝蛋白和核细胞的成分。我们最近报告说，EDMD中的肌肉消瘦可以归因于影响肌肉（卫星）干细胞再生能力的内在表观遗传功能障碍。单一肉动物的分离和培养是监测卫星细胞在其利基范围内行为的最生理外生物方法之一，因为它们仍然存在于纤维周围的基底拉米纳和肉瘤之间。因此，它代表了一个宝贵的实验范例，研究卫星细胞从各种穆林模型。在这里，我们描述了一个重新适应的方法，从产后后肢肌肉（提比亚利斯前体，外向数字龙，胃和太阳）分离完整和可行的单肌异体。按照这个协议，我们能够在出生后19天研究Lamin+8-11-/-----小鼠的卫星细胞，这是一种严重的EDMD鼠型。

我们详细介绍了隔离程序，以及获得大量 myofibers 及其相关卫星细胞衍生后代的培养条件。当在生长因子丰富的培养中培养时，来自野生型小鼠的卫星细胞会激活、增殖，并最终分化或进行自我更新。在同源Lamin+8-11-/-突变小鼠中，这些能力严重受损。 Lamin

这项技术，如果严格遵循，允许研究所有过程链接到肌纤维相关的卫星细胞，即使在产后早期发育阶段和脆弱的肌肉。

引言

骨骼肌是一种分化组织，在运动或创伤1后具有最扩展的再生能力^之一。这一特性主要是由于干细胞的存在，称为卫星细胞，因为它们在基础层和血浆之间的外围位置^。在产后发育过程中，卫星细胞增殖并逐渐分化，从而促进骨骼肌生长。一旦成年，卫星细胞进入可逆的静止状态，在生理或病理创伤，他们激活，增殖和分化，以修复受损的^肌肉3。卫星细胞通过这些不同的再生阶段并经历自我更新的能力的缺陷与肌肉消^,瘦密切相关，无论是生理老化^{4、5、6，,5,还是}肌肉退行性疾病，如^{肌肉萎缩症7、8、9、10。,89,10}

研究卫星细胞外体有两种主要培养方法:来自单核细胞的原发性肌源培养物，机械和化学分离出整个肌肉11、12;^11,12或孤立的 myofibers^{文化 13，,14，,15，,16，,17，,18，,19，,20}。在第一种情况下，卫星细胞分离的过程涉及从小鼠中提取的整个肌肉的三角化，化学消化、过滤和荧光活性细胞分选^{（FACS）21。}这个过程，虽然有效地将卫星细胞从各种模型中隔离，但需要几个变量，使卫星细胞受到压力，并破坏其生理利基^{22，23。22,}相比之下，肌纤维分离涉及用基质降解酶更温和地消化肌肉组织，以及机械粉碎，导致干细胞^{20的创伤减少}。第二种方法允许更有效地检索可行的卫星细胞，这些细胞在基底层和肉瘤之间物理上附着在它们的真菌纤维上，从而允许在其生理利基^{19，20中进行分析}。

在过去的几年里，已经提出了许多不同的方案，以正确和有效地将单个肌骨与骨骼肌分离。比肖夫已经在1986年提出了一个协议，将纤维从Flexor DigitorumBrevis^{13分离出，后来，}在1995年，罗森布拉特等人修改了协议，以获得更有效的分离^{肌纤维14。}从那时起，许多其他作者提出了调整程序的其他肌肉，如外向数字龙us（EDL）和Tibialis前（TA）15，16，17，18，19，20，这是更长，即使更脆弱，^{15,16,17,18,19,20肌肉14。}然后，分离的肌黄细胞可以培养既粘附，允许卫星细胞衍生的肌细胞的扩展，或在浮动条件下，长达96小时，以遵循从单个卫星细胞^19（图1）派生的后代。培养培养的血清的可变浓度用于触发卫星细胞的活化、增殖和/或分化，研究它们通过这些不同阶段^1中适当传递的能力。

我们最近描述了EDMD的小鼠模型，Lamin+8-11-/---小鼠7中卫星Lamin干细胞池耗尽背后的表观遗传^机制。由于这些小鼠通常在²⁴岁4-8周之间死亡，由于严重的肌肉损失，因此试图通过专注于产后肌肉发育的分析来捕捉疾病早期发病的分子缺陷。漂浮的单一动物被分离和培养从野生类型和Lamin+8-11 -/-突变⁷ 19天大的小鼠。在这个阶段，肌肉缺陷已经很明显，但老鼠仍然是可行的。然而，由于上述单肌肌提取协议都针对成年小鼠的骨骼肌进行了优化，我们需要根据我们的目的调整它们:年龄和体型非常小的小鼠，以及非常脆弱的肌骨骼。因此，我们在这里描述我们重新适应鲁德尼基实验室^{19提出的协议，}从产后发育过程中从小鼠和严重的营养不良肌肉，如那些从Lamin+8-11-------小鼠²⁴获得大量的单一可行的肌黄鼠。这种方法的最终目标是在产后发育的早期阶段感兴趣时，或在小鼠模型携带任何特定疾病使肌黄鼠体更容易受到机械应力影响的情况下，为任何其他小鼠模型中的肌黄细胞相关肌肉干细胞的研究提供标准化程序。

研究方案

所有实验程序都是在意大利卫生部和机构动物护理和使用委员会（授权第83/2019-PR）下进行的。这些动物被饲养在意大利米兰圣拉斐尔医院的一家授权设施中（授权号N.N.N.127/2012-A）。

1. 肌肉解剖和肌纤维文化

1. 设备准备。
   1. 开始之前，请准备表 1 中描述的所有必要解决方案。这些解决方案需要重新准备。
   2. 用 70% 乙醇清洁手术过程中使用的所有表面和工具。
   3. 在开始用小鼠牺牲之前，使用马血清 （HS） 进行 100 mm 和 35 mm 培养皿的涂层。涂上所有盘子，防止 myofibers 附着在塑料上。考虑使用一个 100 毫米的盘子和四个 35 毫米的盘子每只鼠标。
   4. 去除多余的 HS 后，在 37 °C 的培养箱中存放涂层餐具 30 分钟。然后用洗涤液或培养剂（每只鼠标两个 35 mm 的盘子）填充。
      注:或者，在杜尔贝科的改良鹰的介质（DMEM）中，10%HS的溶液可用于涂覆盘子。始终使用涂层的盘子。可以使用不同尺寸的培养菜肴，但建议使用小尺寸的培养皿。
   5. 对于纤维隔离，准备无菌巴斯德移液器，如图2所示。对于每只鼠标，准备一个大孔孔移液器进行肌肉处理和机械分解（图2A）和一个小孔移液器用于纤维选择（图2B）。切割每个玻璃移液器，可能使用钻石笔，以所需的长度和光滑的移液器的边缘在火焰。
   6. 使用前，请用 HS 短暂润湿每个移液器。
2. 老鼠牺牲和肌肉解剖
   1. 在开始解剖程序之前，在室温下预热消化液10分钟。聚丙烯 FACS 圆底管是最适合该用途的容器。
   2. 在肌肉取回开始前，根据适当的国家 IACUC 建议牺牲鼠标。
   3. 在切割皮肤之前，用70%的乙醇弄湿下半身，使脱毛更容易。
   4. 将鼠标放在一个容易的位置，支持覆盖着铝纸的聚苯乙烯，从背部中间纵向和腿部方向切割皮肤。
   5. 小心去除皮肤，不要接触肌肉和肌腱。有可能撕掉所有的皮肤。
   6. 切开鼠标的两条腿，迅速进行解剖。
      注:如果它更舒适，可以继续解剖整个鼠标，但工作的腿允许更多的机动性和精度在以后的削减。
   7. 用针固定脚部支撑上的腿，并开始按此顺序隔离感兴趣的骨骼肌:TA、EDL、Gastrocnemius和Sleus。
   8. 抬起TA的下肌腱在脚踝高度的锋利的钳子，并削减它，然后用精细剪刀削减与TA肌肉周围的另一个肌腱在帕泰拉的水平（图3A）。转移到消化液中。
   9. 提起 EDL 的下肌腱，通过轻轻地将其向上拉到其他肌腱，将其与其他肌肉分离。切入消化液中。
      注:由于EDL可能与TA分开切割非常小，因此它们可以一起解剖（图3B）。然后，如果整个肌肉太大，切入2-3件从肌腱开始，并遵循纤维在纵向（图3C）。
   10. 旋转显示背部肌肉的腿，并使用针固定脚。抬起阿基勒的肌腱，胃骨就会自动与其他肌肉分离。上肌腱在帕泰拉的后面。切开它，把肌肉加入消化。
   11. 抬起腿部的外肌腱（与身体有关）并获得鞋底。用钳子向下滚动，轻轻地将它与其他肌肉分开。
   12. 对另一条腿执行相同的操作（从 1.2.7. 到 1.2.11 的步骤）。
3. 肌肉消化
   1. 在37°C的水浴中孵育含有所有肌肉的消化液约45-50分钟。在消化期间，定期检查肌肉，避免过度消化。每10分钟用能量运动10次反转消化管（避免涡旋）。
   2. 当肌肉开始放松，肌黄细胞可见时，停止消化。
   3. 在消化时间结束时摇动样品。
   4. 为了停止消化，小心地将消化悬浮液转移到预热的100毫米培养皿中，并配以10 mL的洗涤液。
      注意:避免肌肉过度消化，因为这将不可避免地导致超收缩肌黄种人隔离。通常使用这种协议，同源突变小鼠的肌肉需要45分钟才能消化，而野生型小鼠的肌肉需要50-55分钟。消化时间需要经过实验验证。
4. 单身 myofibers 隔离
   1. 首先通过用涂层的P200移液器或小孔巴斯德单独分离已经分离的纤维，将它们从100毫米培养皿中转移到新的35毫米培养皿中，并配以5 mL的预热洗涤溶液。
   2. 为了释放进一步的肌纤维，使用带热介质的大孔孔玻璃移液器上下移液肌肉，直到纤维被机械释放。不要过于持久，因为这将导致纤维损坏。
   3. 继续从肌肉中释放肌黄菜，直到菜中含有所需的量。如果培养皿在室温下保持超过8分钟，在37°C下停止并至少进行5分钟孵育，5%的_CO2重新平衡介质。
   4. 在将单一的 myofibers 转移到培养基之前，请将它们留在 37 °C，5% CO₂在洗碗中至少 1 小时。这有助于 myofibers 适应体外条件。
      注: 成人 myofibers 不太容易受到压力的影响， 可以洗 2 - 3 倍。然而，在这种情况下（在19天产后），最好是执行一个洗涤步骤，以防止硫化损伤。因此，始终注意通过不携带碎屑或超合同纤维来保持所选的 myofibers 足够清洁。
5. 单一的 myofiber 文化
   1. 将单个肌黄细胞转移到具有适当培养基的新预热盘中（高血清培养基以允许卫星细胞激活，参见图 1）。
   2. 将培养基更改为孤立的 myofibers，将其转移到具有新培养基的新涂层盘中，仅在 48-72 h 的培养后，以避免任何压力，这将导致 myofibers 过度冲突和中断。

2. 下游应用:Myofibers交联和免疫荧光

注:在感兴趣的时间，与 myofibers 相关的卫星细胞可以通过免疫荧光 （IF） 进行可视化。由于大多数已发布的协议都经过优化，可对成人肌骨剂执行 IF，因此这里提供了详细的协议，以便从产后肌肉分离出的肌方面获得可靠的结果。

1. Myofiber 交联
   1. 开始之前，请准备表 2 中描述的所有必要解决方案。
   2. 预涂与HS多达1.5 mL微离心管的样品数量。在继续之前，请务必删除所有 HS。由于交联纤维比活的纤维更硬，也更难移液，所以一定要将每管分别交联约200-300根纤维。
   3. 在解剖显微镜下，收集所有可以视为健康的纤维，将它们转移到微离心管中，将管垂直留在培养箱内5分钟，让纤维沉淀下来。
   4. 非常缓慢地从管子上取下上一液。
   5. 通过向RT中添加1 mL的4%甲醛（PFA）来交联纤维。轻轻做，以避免纤维的困扰。
   6. 为了防止纤维在交联过程中交联，请将管子保持非常温和的搅拌10分钟。
   7. 将管在 RT 的垂直位置保持 5 分钟，以允许纤维沉淀，然后丢弃上清液，确保去除大部分 PFA 体积。
   8. 加入 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），使管在 RT 下保持垂直 5 分钟，让纤维沉淀。
   9. 拆下上一液并再次重复洗涤程序（步骤 2.1.8.）。
   10. 将交联样品保持4°C。
       注:可以将交联的 myofibers 在 4 °C 下保持一周。如果纤维在这种情况下保持一周多，这将不可避免地导致 myofibers 的交织。
2. 免疫 荧光
   1. 使含有纤维的管子在RT上站立至少5分钟，以便纤维沉淀。
   2. 取出上一液，只留下一小卷，以确保不去除任何纤维。
   3. 在PBS中加入1 mL 0.5%Triton X-100，通过温和搅拌孵育5分钟。
   4. 将管子置于垂直位置 5 分钟，然后取出上流液。
   5. 加入1.5 mL的PBS，用温和的搅拌孵育5分钟。
   6. 将管保持垂直位置 5 分钟，然后拆下上流液。
   7. 加入1 mL 的阻消溶液，在 RT 下用温和的搅拌孵育 1 小时。
   8. 将管保持垂直位置 5 分钟，然后拆下上流液。
   9. 稀释阻断溶液中的原抗体，将其添加到管子中，并在4°C的温和搅拌中孵育过夜（有关建议浓度见材料表）。
      注:或者，原抗体可以在RT下孵育3小时。然而，隔夜孵育提供了最佳的染色。当沉淀纤维达到1.5 mL微离心管的100μL缺口时，初级抗体和次级抗体的孵化量应为300μL。当纤维不太丰富时，建议体积为100-200μL。
   10. 将管子保持垂直位置 5 分钟，然后拆下上流液。
   11. 在 PBS 中 1 mL 的 0.25% Tween-20 中进行 3 次洗涤，在温和搅拌中孵育 5 分钟，然后每次使管子站立 5 分钟。
       注:从这里开始，在黑暗中执行所有步骤，以避免氟化物漂白。
   12. 稀释阻断溶液中的二次抗体，将其添加到管中，在RT下用温和的搅拌孵育1小时（如浓度见材料表）。
   13. 在 PBS 中 1 mL 中洗涤两次 0.1% Tween-20，轻轻搅拌孵育 5 分钟，然后将管子留在站立位置 5 分钟。
   14. 取出上清液，加入1 mL的DAPI溶液，通过轻轻的搅拌孵育5分钟。
   15. 让管子垂直在机架中站立 5 分钟，然后拆下上流液。
   16. 用 1 mL 的 PBS 清洗，用温和的搅拌孵育 5 分钟，然后让管子在机架中站立 5 分钟。
   17. 拆下上一液，留下约 50 μL 的体积。
3. 在显微镜幻灯片上安装荧光标记的 myofibers
   1. 切割 P200 移液器尖端，并涂上阻塞溶液
      注:要涂覆尖端，在采摘纤维之前上下移液多次，这样会避免纤维粘在尖端壁上。
   2. 从管子中收集纤维，并将它们铺在显微镜玻璃滑梯上。
   3. 在解剖显微镜下，仅使用镜子反射的自然光，使用新的（不切割）P200移液器尖端来传播纤维并去除多余的液体溶液。
   4. 将滑梯在黑暗中晾干约 10-15 分钟，直到溶液量非常低。
   5. 在幻灯片上添加安装介质（应在盖玻片的尺寸上校准适当数量的安装介质:对于 24 x 40 mm 盖玻片，20 μL 就足够了），然后缓慢地在包含纤维的区域上铺设盖玻片。小心不要在眼镜之间产生气泡。
   6. 按盖玻片，使纤维位于单个水平平面图上。
   7. 使用指甲油固定盖玻片。
   8. 样品在4°C下储存长达4周。
   9. 使用共体显微镜获取荧光标记的 myofibers 所需的图像。

结果

我们通常消化四种不同的肌肉（TA，EDL，Soleus和胃素），以检索大量的长而可行的纤维，可以在生长因子丰富的介质中存活96小时（图4 Soleus A，B）。只有最完整的纤维才能在培养中转移，因为它们会存活下来;所有其他的，很容易区分和选择，需要被丢弃。

当从野生型小鼠中提取的富中型卫星细胞的生长因子中保持生长因子时，请参见图1。在培养48小时时，在健康状态（Lamin [8-11]/]）下，卫星细胞对 MyoD 进行调节，并进行第一次分裂。激活的Pax7+/MyoD®卫星细胞然后扩散，在培养中，它们产生与肉纤维绑定的细胞聚合，在96小时时更加明显（图5）。在这些分裂中，他们中的一些人可以抑制 MyoD 表达，进行自我更新以重新填充干细胞池，而那些保持 MyoD 的通过降低 Pax7 表达的调节来致力于分化。96小时后，卫星细胞群包含清晰可见的 MyoG+ 承诺细胞，可以分化成新的 myofibers（图 1 和图 6）。值得注意的是，通过这个实验，我们描述了同源突变Lamin+8-11小鼠（-/-）与野生类型对应体（+/+）相比卫星细胞分化的延迟动力学（+/+），参见图6。

每个单个实验的最终结果让我们认为，从这种严重肌肉萎缩症模型中为单肌体分离和培养而开发的协议确保了所有进一步应用的优质肌黄体。

图1:以浮式模型模型模拟的卫星细胞再生相的图形表示。在生长因子富介质中培养48小时后，Pax7+细胞被激活并经历第一次分裂，产生Pax7+/MyoD+细胞的双倍。MyoD阳性细胞然后增殖和扩张，在72小时培养中产生一组几个细胞，这些细胞是单个卫星细胞的后代。在96小时培养下，Pax7+/MyoD+细胞成为区分Pax7-/MyoG+细胞。在扩展阶段，Pax7+/MyoD+ 细胞的子集将自我更新的 MyoD 表达降低，进入静默。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:制备孔巴氏移液器。（A） 大孔孔移液器必须如何出现纵向和正面视图。（B） 小孔孔移液器最终如何出现纵向和正面视图。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:单肌肉解剖的代表性图片。（A） TA肌肉的隔离。避免去除覆盖肌肉的薄层，保护里面的肌纤维。（B） TA和EDL肌肉分离在一起，仍然连接到他们的上肌腱在帕泰拉的水平。（C） 隔离后通过沿纵轴切割 TA 和 EDL 的划分。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:健康可行的 myofibers 示例。具有代表性的相对比图像的可行 myofibers 在暂停。（A） 红色箭头表示具有可见沙状组织和卫星单元的 myofiber;橙色箭头表示一些破碎的 myofibers， 和一些碎片存在于第一道菜之前， 最终选择文化。比例线 100 μm. （B） 放大倍率下其他 myofibers 的更完整视图。比例杆 500 μm.请单击此处查看此图的较大版本。

图5:wt和突变小鼠干细胞簇的尺寸差异。从培养 96 h 后 19 天Lamin 8-11小鼠 （+/+ 和 -/-） 中提取的 myofibers 的免疫荧光染色。显示 Pax7+ 卫星单元。在大多数情况下，在Lamin [8-11]/]中，细胞簇的尺寸明显大于拉明[8-11-/--------]的细胞数量。比例杆 10 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:代表性免疫荧光实验。免疫荧光实验，在培养96小时后，在从19天Lamin+8-11小鼠中提取的 myofibers（+/+和--）。观察了Pax7+/MyoG-（红色）和Pax7-/MyoG+（绿色）细胞。用共和显微镜获得的图像。比例杆 25 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

文本中解决方案的名称	组件	百分比	建议的最终卷/样本	笔记
洗涤溶液	DMEM 高葡萄糖	90%	4 mL	保持无菌，保持4°C，直到使用
	马血清 （HS）	10%
消化液	DMEM 高葡萄糖	9.80%	20 mL	极其有害的粉末。使用 0.22μm 过滤器过滤溶液，然后保持无菌。保持 4°C 直到使用
	胶原蛋白酶 I	0.20%
文化媒介	DMEM 高葡萄糖	78%	10 mL	保持无菌，保持4°C，直到使用
	胎儿牛血清 （FBS）	20%
	鸡胚胎提取物（CEE）	1%
	青霉素-链霉素（P/S）	1%

表1:第 1 节中使用的解决方案配方。

文本中解决方案的名称	组件	百分比	建议的最终卷/样本	笔记
4% PFA	甲状甲醛（PFA）	4%	2-3 mL	粉末然后溶液是极其有害的
	Pbs	96%
0.5% 特里顿 X-100	特里顿 X-100	0.50%	2-3 mL	Triton X-100 非常粘稠， 优先切断移液器的尖端， 以等价
	Pbs	99.50%
0.25% Tween-20	特温-20	0.25%	10 mL	Tween -20 非常粘稠， 优先切断移液器的尖端， 以等价
	Pbs	99.75%
0.1% Tween-20	特温-20	0.10%	10 mL	Tween -20 非常粘稠， 优先切断移液器的尖端， 以等价
	Pbs	99.90%
阻塞解决方案	胎儿牛血清 （FBS）	10%	10 mL	准备新鲜溶液，在4°C下储存不超过3周（使用前始终检查清除性）
	Pbs	90%
达皮	达皮	0.10%	2-3 mL	保持黑暗
	Pbs	99.90%

表2:第 2 节中使用的解决方案配方。

讨论

分离完整的单肌纤维是肌生成领域的基本方法，当时主要目标是描述肌肉干细胞在健康和病理条件下的利基细胞自主再生能力。然而，当生化或基因组研究感兴趣时，FACS分离的卫星细胞可能是最佳选择。

单肌细胞隔离允许遵循前活体，但在最生理的方式，在肌肉再生过程中，单卫星细胞经历的所有步骤的动态，即:激活，细胞分裂（不对称和对称），分化和通过自我更新恢复静默。一旦在漂浮条件下生长，单个卫星细胞就激活并膨胀，形成一组细胞，所有这些细胞都来自同一个卫星细胞。增殖、分化、活化或茎性标记的免疫荧光分析是量化细胞阶段之间比例的最佳方法。

我们协议的关键步骤，以获得可行和完整的肌腱可以被认为是快速但温和的肌肉解剖，通过肌腱到肌腱隔离，以避免任何肌肉损伤。我们的建议是只使用锋利的剪刀和小锋利的钳子，并限制整个肌肉解剖程序到十分钟。当难以分离非常小的肌肉（即 EDL 和 TA）时，可以将它们切割在一起，然后沿着纤维的纵向平面图使用精细剪刀切割来分割它们。这一策略最终将给予不太完整的 myofibers，但生存能力不会受到影响。同样的大肌肉，如胃关节，以促进消化。消化时间优化，需要经验验证，对分离纤维的最小操作也是后续分析的正结果的两个关键方面。

这里报道的协议的优点是，它可以应用于非常小的小鼠（在年龄和尺寸），即使他们的肌肉是非常脆弱的。即使上面没有提及，也有可能遵循这个解剖协议，然后培养可行的 myofibers 使用地下室膜涂层的盘子^{18，,19 的较长时间}。重要的是要考虑，这种情况是完全不同的浮动条件，其中粘附刺激和接近刺激不存在。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	Sigma	D9542
Chicken embryo extract	Seralab	CE650-DL
Collagenase type I	SIGMA	C0130-500MG
Donkey anti-Rabbit 488 antibody	Thermofisher	R37118	to be used 1:200
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Horse serum	Gibco	26050-088
MyoG antibody	Millipore	219998	to be used 1:100
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Pax7 antibody	Developmental studies Hybridoma bank		to be used 1:20
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Phosphate saline buffer	Euroclone	ECB4004L
Prolong gold antifade mountant	Thermofisher	P36930
Triton X-100	SIGMA	T8787
Tween-20	SIGMA	P1379
Lab equipment	Manufacturer
Bunsen burner
Confocal microscope	Leica
Diamond pen	bio-optica
Dissection pins
FACS polypropylene tubes	Falcon
Falcon tubes (50 and 15 mL)	Falcon
Glass coverslips	Thermofisher
Glass Pasteur pipettes (22cm)	VWR
Glass slides	Thermofisher
Micro dissecting scissors
Micropipette (1 mL and 200 µL)	Gilson
Micropipette tips	Corning
Petri dishes (100 and 35 mm diameter)	Thermofisher
Plastic pipettes (5 and 10 mL)	VWR
Rubber pipette bulbs	VWR
Sharp tweezers
Stereo dissection microscope with transmission illumination	Leica
Tissue culture hood or lamina flow cabinet
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2)
Water bath at 37°C	VWR