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Qui, proponiamo un metodo per ottenere in modo efficiente le singole fibre muscolari nelle prime fasi dello sviluppo post-natale dal mutante omozygoso lamin modello murino 8, un modello molto severo per la distrofia muscolare Emery-Dreifuss (EDMD).
La distrofia muscolare emery-Dreifuss (EDMD) autosomica dominante è causata da mutazioni nel gene LMNA, che codifica le lamine nucleari di tipo A, le proteine del filamento intermedio che sostengono l'involucro nucleare e i componenti del nucleocosmo. Recentemente abbiamo riferito che lo spregio muscolare nell'EDMD può essere attribuito a disfunzioni epigenetiche intrinseche che interessano la capacità rigenerativa delle cellule staminali muscolari (satellite). L'isolamento e la coltura delle singole miofibre è uno degli approcci ex-vivo più fisiologici per monitorare il comportamento delle cellule satellitari all'interno della loro nicchia, in quanto rimangono tra la lamina basale che circonda la fibra e il sarcolemma. Pertanto, rappresenta un paradigma sperimentale inestimabile per studiare le cellule satellitari da una varietà di modelli murini. Qui, descriviamo un metodo riadattato per isolare le singole miofibre intatte e vitali dai muscoli degli arti posteriori post-natali (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius e Soleus). Seguendo questo protocollo, siamo stati in grado di studiare le cellule satellitari dei topi Lamin -8-11 -/-, un grave murino EDMD, a soli 19 giorni dalla nascita.
Dettagliamo la procedura di isolamento, così come le condizioni di coltura per ottenere una buona quantità di miofibre e la loro progenie derivata da cellule satellitari associate. Quando coltivate in fattori di crescita ricco mezzo, le cellule satellitari derivate da topi di tipo selvatico si attivano, proliferano, e alla fine differenziano o subiscono l'auto-rinnovamento. Nell'omozigano Lamin - 8-11 -/- topi mutanti queste capacità sono gravemente compromesse.
Questa tecnica, se rigorosamente seguita, permette di studiare tutti i processi legati alla cellula satellitare associata alla miofibra anche nelle prime fasi dello sviluppo post-natale e nei muscoli fragili.
Il muscolo scheletrico è un tessuto differenziato con una delle capacità più estese di rigenerarsi dopo l'esercizio o il trauma1. Questa caratteristica è dovuta principalmente alla presenza di cellule staminali, chiamate cellule satellitari a causa della loro posizione periferica tra la lamina basale e il plasmalemma della miofibra2. Durante lo sviluppo post-natale, le cellule satellitari proliferano e si differenziano progressivamente, contribuendo così alla crescita muscolare scheletrica. Una volta in età adulta, le cellule satellitari entrano in uno stato quiescente reversibile, e su traumi fisiologici o patologici, si attivano, proliferano e si differenziano per riparare i muscoli danneggiati3. I difetti nella capacità delle cellule satellitari di transitare correttamente attraverso queste diverse fasi rigenerative e di subire l'auto-rinnovamento sono stati saldamente legati allo spredamento muscolare, sia durante l'invecchiamento fisiologico4,5,6 o in malattie degenerative muscolari, come distrofie muscolari7,8,9,10.
Esistono due principali approcci di coltura per studiare le cellule satellitari ex-vivo: colture miogeniche primarie da cellule mononleate, dissociate meccanicamente e chimicamente dal muscolo intero11,12; o coltura di miofibre isolate13,14,15,16,17,18,19,20. Nel primo caso, il processo di isolamento delle cellule satellitari comporta la triturazione di muscoli interi estratti dal topo, una digestione chimica, filtrazione e ordinamento fluorescente delle cellule attivate (FACS)21. Questa procedura, anche se efficace nell'isolare le cellule satellitari da una varietà di modelli, comporta diverse variabili che espongono le cellule satellitari a stress e interrompono la loro nicchia fisiologica22,23. Al contrario, l'isolamento della miofibra comporta una digestione più delicata del tessuto muscolare con enzimi degradanti a matrice e una triturazione meccanica che causa riduzione dei traumi alle cellule staminali20. Questo secondo approccio permette un recupero molto più efficiente di cellule satellitari vitali, che rimangono fisicamente attaccate alla loro miofibra tra la lamina basale e il sarcolemma, consentendo così l'analisi all'interno della loro nicchia fisiologica19,20.
Negli ultimi anni sono stati proposti molti protocolli diversi per isolare correttamente ed efficacemente le singole miofibre dai muscoli scheletrici. Già nel 1986 Bischoff ha proposto un protocollo per isolare le fibre dal Flexor Digitorum Brevis13 e più tardi, nel 1995, Rosenblatt et al. modificato il protocollo per ottenere una separazione più efficiente delle miofibre14. Da allora, molti altri autori hanno proposto procedure regolate su altri muscoli, come Extensor Digitorum Longus (EDL) e Tibialis Anterior (TA)15,16,1717,18,19,20, che sono più lunghi, anche se più fragili, muscoli14.20 Le miofibre isolate possono quindi essere coltivate sia in aderesione, per consentire l'espansione dei mioblasti derivati da cellule satellitari, sia in condizioni di galleggiamento, fino a 96 ore, per seguire la progenie derivata da singole cellule satellitari19 (Figura 1). Concentrazioni variabili di siero all'interno del mezzo di coltura sono utilizzate per attivare l'attivazione, la proliferazione e/o la differenziazione delle cellule satellitari, per studiare la loro capacità di transitare correttamente attraverso queste diverse fasi1.
Recentemente abbiamo descritto il meccanismo epigenetico dietro l'esaurimento del pool di cellule staminali satellitari nel modello murino di EDMD, il lamin -8 - topo 11 - /-7. Poiché questi topi di solito muoiono tra 4-8 settimane di età24, a causa di una grave perdita muscolare, è stato fatto un tentativo di catturare i difetti molecolari alla base dell'insorgenza precoce della malattia concentrando la nostra analisi sullo sviluppo muscolare post-natale. Le mitraglie singole galleggianti erano isolate e coltivate da un tipo7 selvaggio e topi mutanti 7 di 19 giorni. In questa fase, i difetti muscolari sono già evidenti, ma i topi sono ancora vitali. Tuttavia, poiché tutti i protocolli sopra menzionati per l'estrazione di singole miofibre sono stati ottimizzati per i muscoli scheletrici di topi adulti, dovevamo adattarli ai nostri scopi: topi molto piccoli in termini di età e dimensione e miofibre molto fragili. Così, descriviamo qui il nostro riadattamento del protocollo proposto dal laboratorio Rudnicki19 per ottenere un numero significativo di singole miofibre vitali dai topi durante lo sviluppo post-natale e da gravi muscoli distrofici, come quelli derivati da Lamin - 8-11 -/- topi24. L'obiettivo finale di questo approccio è quello di fornire una procedura standardizzata per lo studio delle cellule staminali muscolari associate alle miofibre in qualsiasi altro modello murino quando le prime fasi dello sviluppo post-natale sono di interesse, o nel caso di modelli murini che trasportano una malattia specifica che rende le miofibre più suscettibili allo stress meccanico.
Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite sotto l'approvazione etica del Ministero della Salute italiano e del Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali (autorizzazione n. 83/2019-PR). Gli animali sono stati mantenuti in una struttura autorizzata presso l'Ospedale San Raffaele di Milano, Italia (autorizzazione n. N. 127/2012-A).
1. Dissezione muscolare e cultura della miofibra
2. Applicazioni a valle: miofibre traslitti e immunofluorescenza
NOTA: Le cellule satellitari associate alle miofibre possono essere visualizzate per immunofluorescenza (IF) al momento dell'interesse. Poiché la maggior parte dei protocolli pubblicati sono ottimizzati per eseguire IF su miofibre adulte, qui viene presentato un protocollo dettagliato per ottenere risultati affidabili anche sulle miofibre isolate dai muscoli post-natali.
Digeriamo in genere quattro muscoli diversi (TA, EDL, Soleus e Gastrocnemius) per recuperare una buona quantità di fibre lunghe e vitali che potrebbero sopravvivere a 96 h in mezzo ricco di fattori di crescita (Figura 4A,B). Solo le fibre più intatte dovrebbero essere trasferite nel mezzo di coltura, in quanto sopravviveranno; tutti gli altri, che sono facili da discriminare e selezionare, devono essere scartati.
Quando le miofibre vengono mantenute in un ricco di fattori di crescita le cellule satellitari medie derivate da topi selvatici iniziano ad attivarsi e proliferare, vedere Figura 1. Dopo 48 h di coltura, in condizioni di salute (Lamin - 8-11 ) ), le cellule satellitari regolano MyoD e subiscono la loro prima divisione. Le cellule satellitari attivate Pax7/MyoD proliferano e di 72 h nella coltura generano aggregati cellulari legati alla miofibra, che sono ancora più visibili a 96 h (Figura 5). Durante queste divisioni, alcuni di loro possono reprimere l'espressione di MyoD, subendo l'auto-rinnovamento per ripopolare il pool di cellule staminali, mentre quelli che mantengono MyoD si impegnano a differenziare la espressione Pax7. Dopo 96 h, i cluster di cellule satellitari contengono celle mioG, chiaramente visibili, che possono differenziarsi in nuove miofibre (Figura 1 e Figura 6). In particolare, con questo esperimento, abbiamo descritto una dinamica ritardata della differenziazione delle cellule satellitari nei topi omozici mutanti Lamin -8-11 (-/-) rispetto alle loro controparti di tipo selvaggio (sezione /z), vedi Figura 6.
Il risultato finale di ogni singolo esperimento pensiamo che il protocollo sviluppato per l'isolamento delle singole miofibre e la cultura da questo modello di grave distrofia muscolare garantisca miofibre di buona qualità per tutte le ulteriori applicazioni.
Figura 1: Rappresentazione grafica delle fasi rigenerative delle cellule satellitari modellate in miofibre galleggianti. Dopo 48 h di coltura in fattori di crescita ricco mezzo, le cellule Pax7 vengono attivate e subiscono la prima divisione, dando origine a un doppietto di cellule Pax7 / MyoD. Le cellule positive MyoD proliferano ed espandono, dando origine, in 72 h di coltura, a un gruppo di diverse cellule che sono la progenie di una singola cellula satellite. A 96 h di coltura le cellule Pax7/MyoD diventano cellule Pax7-/MyoG. Durante la fase di espansione, un sottoinsieme di celle Pax7/MyoD, downregulate MyoD espressione in fase di auto-rinnovamento in quiescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione delle pipette Pasteur del foro. (A) Visione longitudinale e frontale di come deve apparire la pipetta del foro grande. (B) La visione longitudinale e frontale di come deve finalmente apparire la pipetta del foro piccolo foro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative della dissezione muscolare singola. (A) Isolamento del muscolo TA. Evitare la rimozione dello strato sottile che copre il muscolo protegge le miofibre all'interno. (B) I muscoli TA ed EDL isolati insieme ancora attaccati al loro tendine superiore a livello della rotula. (C) Divisione di TA e EDL dopo l'isolamento tagliandoli lungo l'asse longitudinale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempi di miofibre sane e vitali. Immagini di contrasto di fase rappresentative di miofibre vitali in sospensione. (A) La freccia rossa indica una miofibra con organizzazione sarcomere visibile e una cellula satellitare su un lato; le frecce arancioni indicano alcuni pezzi di mitragliafibre rotte, e alcuni detriti presenti nel primo piatto prima della selezione finale per la cultura. Barra della scala di 100 m. (B) Visione più completa di altre miofibre sotto un ingrandimento più piccolo. Barra di scala 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Differenza nella dimensione degli ammassi di cellule staminali nei topi mutanti e wt. Immunofluorescenza colorazione delle miofibre estratte da 19 giorni di lamin 8-11 topi (z/ e -/--) dopo 96 h di coltura. Vengono visualizzate le cellule satellitari Pax7. La quota dell'ammasso di cellule nella maggior parte dei casi era significativamente più grande in Lamin , 8-11 , rispetto a Lamin - 8 -// in termini di numero di cellule. Barra di scala di 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esperimento di immunofluorescenza rappresentativo. Esperimento di immunofluorescenza eseguito, dopo 96 h di coltura, su miofibre estratte da 19 giorni di lamin-11 Sono state osservate cellule Pax7/MyoG- (rosso) e Pax7-/MyoG (verde). Immagini ottenute con un microscopio confocale. Barra di scala 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nome della soluzione nel testo | Componente | Percentuale | volume/campione finale suggerito | Note | |
soluzione di lavaggio | DMEM alto glucosio | 90% | 4 mL | Mantenere sterile, tenere a 4 gradi centigradi fino all'uso | |
Siero di cavallo (HS) | 10% | ||||
soluzione di digestione | DMEM alto glucosio | 9.80% | 20 mL | Polvere estremamente dannosa. Soluzione di filtro con filtro di 0,22 m e quindi mantenere sterile. Mantenere a 4 gradi centigradi fino all'utilizzo | |
Collagenasi I | 0.20% | ||||
mezzo di coltura | DMEM alto glucosio | 78% | 10 mL | Mantenere sterile, tenere a 4 gradi centigradi fino all'uso | |
Siero bovino fetale (FBS) | 20% | ||||
Estratto di embrione di pollo (CEE) | 1% | ||||
Penicillina-Streptomycin (P/S) | 1% |
Tabella 1: Ricette per le soluzioni utilizzate nella sezione 1.
Nome della soluzione nel testo | Componente | Percentuale | volume/campione finale suggerito | Note | |
4% PFA | Paraformaldeide (PFA) | 4% | 2-3 mL | Polvere e poi soluzione sono estremamente dannosi | |
Pbs | 96% | ||||
0,5% Triton X-100 | Triton X-100 | 0.50% | 2-3 mL | Triton X-100 è estremamente viscoso, preferibilmente tagliare la punta della pipetta ad esso aliquota aliquota | |
Pbs | 99.50% | ||||
0.25% Tween-20 | Tween-20 | 0.25% | 10 mL | Tween-20 è estremamente viscoso, preferibilmente tagliare la punta della pipetta aliquota ad esso | |
Pbs | 99.75% | ||||
0.1% Tween-20 | Tween-20 | 0.10% | 10 mL | Tween-20 è estremamente viscoso, preferibilmente tagliare la punta della pipetta aliquota ad esso | |
Pbs | 99.90% | ||||
soluzione di blocco | Siero bovino fetale (FBS) | 10% | 10 mL | Preparare una soluzione fresca e conservare a 4 gradi centigradi per non più di 3 settimane (controllare sempre la chiarezza prima dell'uso) | |
Pbs | 90% | ||||
Dapi | Dapi | 0.10% | 2-3 mL | Tenere al buio | |
Pbs | 99.90% |
Tabella 2: Ricette per le soluzioni utilizzate nella sezione 2.
L'isolamento delle singole miofibre intatte è un metodo essenziale nel campo della miogenesi quando l'obiettivo principale è caratterizzare le capacità rigenerative cellule-autonome delle cellule staminali muscolari all'interno della loro nicchia, in condizioni sane e patologiche. Tuttavia, quando gli studi biochimici o genomici sono di interesse, le cellule satellitari isolate dal FACS potrebbero essere l'opzione migliore.
L'isolamento delle miofibre singole permette di seguire l'ex-vivo, ma nel modo più fisiologico, la dinamica di tutti i passi che le singole cellule satellitari subiscono durante la rigenerazione muscolare, ovvero: attivazione, divisione cellulare (asimmetrica e simmetrica), differenziazione e ritorno alla quiescenza mediante auto-rinnovamento. Una volta che le miofibre vengono coltivate in condizioni galleggianti, le singole cellule satellitari si attivano ed espandono formando un gruppo di cellule, tutte derivanti dalla stessa cellula satellitare. L'analisi dell'immunofluorescenza per la proliferazione, la differenziazione, l'attivazione o i marcatori di stelo è quindi ottimale per quantificare la proporzione tra gli stadi cellulari.
Il passo chiave nel nostro protocollo per ottenere miofibre vitali e intatte può essere considerata la dissezione muscolare rapida ma delicata, dall'isolamento tendine-tendine, per evitare danni muscolari. Il nostro consiglio è quello di utilizzare solo forbici affilate e piccole pinzette affilate e di limitare l'intera procedura di dissezione muscolare a dieci minuti. Quando è difficile isolare muscoli molto piccoli (cioè, EDL e TA), è possibile tagliarli insieme e dividerli successivamente utilizzando forbici fini che tagliano lungo il piano longitudinale seguendo le fibre. Questa strategia alla fine darà meno intatti miofibre, ma la vitalità non sarà compromessa. Lo stesso deve essere eseguito su grandi muscoli come Gastrocnemius per facilitare la digestione. Ottimizzazione del tempo di digestione, che deve essere convalidata empiricamente, e la manipolazione minima di fibre isolate sono anche due aspetti cruciali per l'esito positivo delle analisi successive.
Il vantaggio del protocollo riportato qui è che può essere applicato su topi molto piccoli (in età e dimensione), anche quando i loro muscoli sono estremamente fragili. Anche se non menzionato sopra, è possibile seguire questo protocollo di dissezione per poi coltura melofibre vitali per un periodo più lungo utilizzando piatti interrati rivestiti a membrana18,19. È importante considerare che questa situazione è completamente diversa dalla condizione galleggiante, dove gli stimoli di adesione e gli stimoli di prossimità sono assenti.
Nessun interesse concorrente.
Ringraziamo Andrea Bianchi, la Rete Italiana di Laminopatie e i membri del laboratorio per il supporto e tutti i commenti costruttivi. Siamo grati a Chiara Cordiglieri per il prezioso aiuto al microscopio confocale. Gli autori ringraziano la dott.ssa Beatrice Biferali per il suo aiuto nello stopersi per scattare foto per figure. Il lavoro qui presentato è stato sostenuto da My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, il Ministro della Salute italiano n. GR-2013-02355413 e Cariplo 2017-0649 a C.L. C.M. è supportato da My First AIRC grant n.18993 e AFM-Telethon n. 22489.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank | to be used 1:20 | |
Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
Lab equipment | Manufacturer | ||
Bunsen burner | |||
Confocal microscope | Leica | ||
Diamond pen | bio-optica | ||
Dissection pins | |||
FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
Glass coverslips | Thermofisher | ||
Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
Glass slides | Thermofisher | ||
Micro dissecting scissors | |||
Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
Micropipette tips | Corning | ||
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
Rubber pipette bulbs | VWR | ||
Sharp tweezers | |||
Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
Water bath at 37°C | VWR |
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